制備豬支原體的重組表面抗原及其疫苗的方法

專(zhuān)利名稱(chēng):制備豬支原體的重組表面抗原及其疫苗的方法
本發(fā)明是關(guān)于豬支原體表面抗原;涉及以重組DNA的方法制備該抗原在此抗原的基礎(chǔ)上，制備豬支原體疫苗的方法;關(guān)于用此疫苗防治豬地方性獸病肺炎的處理方法，此外，在此抗原或此抗原的抗體的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還涉及用以發(fā)現(xiàn)豬群中豬支原體感染的診斷方法。
豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)是豬地方性獸病肺炎的病原，造成世界范圍內(nèi)豬的重要疾病。該病為慢性過(guò)程，非致命性疾患，各年齡組的豬都可得病，受感染的豬僅有輕度咳嗽和發(fā)燒的癥狀。但此種感染的經(jīng)濟(jì)影響是很大的，因?yàn)閷?shí)際進(jìn)食的減少，體重增加的減低，成為市場(chǎng)上的小個(gè)兒豬，致使蒙受重大經(jīng)濟(jì)損失。迄今，用疫苗控制此病或建立隔離病原豬群的努力尚未獲得成功。
支原體與宿主細(xì)胞表面的物理性連接，是地方性獸病肺炎持久存在與發(fā)展的基礎(chǔ)。如今在檢定出豬肺支原體的媒介貼附宿主細(xì)胞的表面蛋白組分及其在感染過(guò)程中刺激自然生成抗體的基礎(chǔ)上，提出抗地方性獸病肺炎的疫苗和對(duì)地方性獸病肺炎的診斷方法。
檢定出上述表面蛋白DNA順序編碼后，可用適宜的表地載體，組成重組DNA分子，并將此重組DNA分子將適宜的宿主轉(zhuǎn)化(例如，原核性或真核性宿主)。然后培養(yǎng)轉(zhuǎn)化宿主，使其表達(dá)DNA順序并制造出理想的支原體表面蛋白。
繼之，將產(chǎn)生和分離出的表面蛋白與其它活性成分或它們的組合物，給豬注射，給藥量應(yīng)足夠刺激抗體的生成，從而提供一種免疫豬，抗豬肺炎支原體感染的方法。這種疫苗的有效載體和適宜的給藥方式，在獸醫(yī)技術(shù)操作中是人所共知的。
本發(fā)明的表面抗原也是用于創(chuàng)造檢測(cè)豬群中豬肺炎支原體感染診斷藥盒的基礎(chǔ)，例如，根據(jù)抗體檢出本發(fā)明表面抗原的道理，可用診斷藥盒在豬群中，每10或20個(gè)豬中抽取一個(gè)，常規(guī)地、經(jīng)常地檢查支原體感染是否存在。檢查陽(yáng)性，應(yīng)對(duì)整個(gè)豬群用本發(fā)明的抗原盡早接種，以防止支原體的擴(kuò)散。
本發(fā)明還關(guān)系于一些多肽和肽鏈，這些多肽和肽鏈?zhǔn)秦i肺炎支原體細(xì)菌表面蛋白的一部分，當(dāng)施用于豬時(shí)它們可刺激生成與豬肺炎支原體結(jié)合的抗體。
優(yōu)選出的多肽選自NNNNEKKK;NNPESKSQDNANKGNYLSLNIGYRSFADKPDLLMVMMQSQKLYKNLVNRQLWLILSHKKQVKKECIENGQKIAKDLGE;
NSKMSLKNTEPNFFYGIYEKAIDKRFSLIDKIKI;
NSTVSETRDFIQKFQKFDIFYQENVGKIKEDLDFAIAPSFISLSLISKSLTKKLEIAAQNLSQFDSGAFTGEISGKMLQDLGTKYVI;和NSGPVYGPFLPGEDKRELNPIVAKSANSITIDLNIITKTKLSERVAALSRVEF。
上述氨基酸編碼中，字母符號(hào)所代表的氨基酸如下F苯丙氨酸 L亮氨酸I異亮氨酸 M蛋氨酸V纈氨酸 S絲氨酸P脯氨酸 T蘇氨酸A丙氨酸 Y酪氨酸H組氨酸 Q谷氨酰胺
N天冬酰胺 K賴(lài)氨酸D天冬氨酸 E谷氨酸C半胱氨酸 W色氨酸R精氨酸 G甘氨酸本發(fā)明還關(guān)系到重組DNA分子，用其制備上述肽鏈。以DNA順序?yàn)樘卣鞯膬?yōu)選的重組DNA分子選自GAACAACAACAATGAAAAAAAAGAAATAATGCGTGATTTTTTTGAAAAGGGAAGAAAAGGCCTTTTTTTATTACCAGTTATATGGCCCTCTTTTC;
AAATAATCCTGAATCAAAATCGCAAGCTAATGCAAATAAAGGAAATTATCTTTCTTTAAATATTGGTTATCGTAGTTTTGCTGATAAACCTGACTTGCTGATGGTTTTATTACAGTCCCAAAAGTTGGTAAAGAACTTAGTAAATCEACAATTATGGCTGATCCTGTCCCATAAAAAACAGGTAAAAAAAGAGGACATCGAAAACGGGCAAAAAATAGCAAAAGACCTTGGTGAA;
GAATTCAAAGATGAGTTTAAAAAATACTGAACCTAATTTTTTTGTCGGCATCTATGAAAAGGCAATTGATAAACGTTTTTCTTTGATAGATAAAATTAAAATCG;
GAATTCGACCGTAAGTGAAACACGTGATTTTATTCAAAAATTTGACATTTTCTATCAGGAAAATGTGGGCAAAATCAAAGAAGATTTAGATTTTGCAATAGCTCCAAGTTTTATATCTTTATCACTAATTTCTAAGTCCTTGACTAAAAAATTAGTAATTGCTGCTCAAAATCTTAGTCAGTTTGATTCAGGAGCCTTTACTGGGGAAATCAGTGGCAAAATGCTGCAGGATTTAGGGACAAAATATGTAATT;GAATTCTGGACCTGTATATGGGCCATTTTTACCGGGCGAAGATAAGCGCGAACTCAACCCAATTGTGGCAAAAAGTGCTAATTCAATCACAATTGATCTTAATATTTTATCGATAATAACCAAAACAAAATTATCAGAGAGAGTTGCAGCCTTAAGCAGAGTTGAATTC;
與上述任何一個(gè)DNA順序雜交并表達(dá)豬肺炎支原體表面抗原編碼的DNA順序;豬肺炎支原體表面抗原的DNA編碼順序是用前述任何一個(gè)DNA編碼順序所表達(dá);DNA順序退化造成前述DNA順序的基因編碼和豬肺炎支原體表面抗原的編碼。
圖1敘述重組DNA分子PME1921的轉(zhuǎn)譯的DNA順序的有關(guān)部分。該圖還用單一字母的氨基酸編碼，表示融合蛋白的氨基酸順序的有關(guān)部分，此融合蛋白由PME1921表達(dá)產(chǎn)生的。DNA順序和氨基酸順序的劃線(xiàn)部分示為專(zhuān)一地來(lái)自豬肺炎支原體的部分。圖1中剩余的DNA和氨基酸順序則示為來(lái)自用于克隆支原體序列的表達(dá)載體和連接子的順序，圖1還表示在這里使用的單一字母氨基酸編碼。
圖2表示重組DNA分子PME1922轉(zhuǎn)譯的DNA順序的有關(guān)部分。該圖還敘述用相關(guān)的DNA順序編碼表達(dá)的氨基酸順序。再之，劃線(xiàn)部分用以表明是來(lái)自豬肺炎支原體的DNA和氨基酸順序的部分。剩余的DNA和氨基酸順序則是來(lái)自表達(dá)載體和連接子。
圖3表示重組DNA分子PME1925轉(zhuǎn)譯的DNA順序的有關(guān)部分。該圖還表示用相關(guān)的DNA順序編碼表達(dá)的氨基酸順序。再之，劃線(xiàn)部分用以表明是來(lái)自豬肺炎支原體的DNA和氨基酸順序的部分。剩余的順序的部分則是來(lái)自表達(dá)載體和連接子。
圖4表示重組DNA分子PME2413的轉(zhuǎn)譯的DNA順序的有關(guān)部分。該圖還敘述用相關(guān)的DNA順序編碼表達(dá)的氨基酸順序。再之，劃線(xiàn)部分用以表明是來(lái)自豬肺炎支原體的DNA和氨基酸順序的部分。剩余的順序部分則是來(lái)自表達(dá)載體和連接子。
圖5表示重組DNA分子PME442轉(zhuǎn)譯的DNA順序的有關(guān)部分。該圖還敘述用相關(guān)的DNA順序編碼表達(dá)的氨基酸順序。再之，劃線(xiàn)部分用以表明是來(lái)自豬肺炎支原體的DNA和氨基酸順序的部分。剩余的順序的部分則是來(lái)自表達(dá)載體和連接子。
圖6說(shuō)明豬抗血清19和20的特異性。用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離出支原體蛋白后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾紙并經(jīng)下述血清處理抗血清19(第2行)，抗血清20(第4行)，抗血清19(第1行)和20(第3行)的予先免疫血清。上述這些與含有標(biāo)以[125I]、完整的支原體的蛋白凝膠進(jìn)行放射自顯影比較(第5行);與培養(yǎng)條件下，標(biāo)以[125I]的超聲粉碎處理的支原體提取物相比較(第6行);并與活體內(nèi)，標(biāo)以[35S]-蛋氨酸的完整支原體蛋白，相比較(第7行)。第8行示完整支原體蛋白的馬斯蘭染色。用分子量標(biāo)準(zhǔn)物(Sigma廠(chǎng)出品)測(cè)得之分子量(10)示于右側(cè)。
圖7敘述用于創(chuàng)建本發(fā)明優(yōu)選基因庫(kù)的表達(dá)載體p EX29。該載體是表達(dá)載體p PIC24.的衍生物。該圖指明在PL啟動(dòng)子和MS2區(qū)(編碼100N-端氨基酸)之間，原始的EcoR1的位點(diǎn)缺失;并指明多聚連接子置于BamHⅠ和HindⅢ的位點(diǎn)上。該圖還指明復(fù)制的起始點(diǎn)(Ori)和β-內(nèi)酰胺酶(Amp)的編碼的區(qū)段。
圖8說(shuō)明表達(dá)于大腸桿菌E.內(nèi)融合蛋白的特異性。(A)由基因庫(kù)免疫篩選出10個(gè)克隆的細(xì)胞提取物，以聚丙烯酰胺凝膠電泳分析并以考馬斯蘭染色，p PIc24自身是一個(gè)11千道爾頓的蛋白質(zhì)，相當(dāng)于MS2聚合酶的N-端(最右側(cè))。(B)用上述聚丙烯酰胺凝膠電泳將全部細(xì)胞提取液級(jí)分離后，將分離出的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾紙過(guò)濾并與抗血清19一起孵育。結(jié)合的抗體用[125I]標(biāo)的蛋白質(zhì)A檢測(cè)并進(jìn)行放射自顯影。可見(jiàn)融合蛋白與抗血清呈不同強(qiáng)度的反應(yīng)，這顯然取決于融合蛋白合成的數(shù)量。[14C]標(biāo)記的分子量標(biāo)準(zhǔn)物(NEN Corp.)示于左側(cè)。
圖9表示豬肺炎支原體蛋白與特異性抗血清的免疫吸附圖。如圖1所述制成硝酸纖維素條帶，經(jīng)各種不同的抗血清處理。用抗血清19染出的支原體輪廓作為參考帶。用抗血清檢出本發(fā)明的各表面抗原體來(lái)識(shí)別支原體蛋白，以箭頭表示之;它們的近似分子量是根據(jù)與分子量標(biāo)準(zhǔn)物比較而得，在圖中示于右側(cè)。(分子量標(biāo)準(zhǔn)物在左側(cè))。
圖10表示本發(fā)明克隆的表面抗原對(duì)胰酶的敏感性。完整的支原體細(xì)胞(相當(dāng)培養(yǎng)液1ml)在有胰酶(50μg/ml)或沒(méi)有胰酶的條件下孵育后，用聚丙烯酰胺電泳的方法將蛋白分離，用考馬斯蘭染色或轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾紙以供免疫吸附分析。如圖所示吸附是將其與抗血清孵育，而抗血清是由抗我們克隆的各種抗原而獲得。圖中箭頭指示被抗血清所識(shí)別的蛋白質(zhì)的位置。
如上所描述的，本發(fā)明的特點(diǎn)是豬肺炎支原體的表面抗原。尤其是本發(fā)明有關(guān)的表面抗原可使處理過(guò)的豬免疫，不受感染，或是用于這種感染的診斷方面。
本發(fā)明的表面抗原包括一些多肽和肽鏈，該多肽和肽鏈顯示固有的豬肺炎支原體表面抗原的抗原性。因此本發(fā)明表面抗原即是DNA編碼順序轉(zhuǎn)化的宿主生成的重組多肽。當(dāng)然應(yīng)該明白這些多肽可能含有與豬肺炎支原體無(wú)關(guān)的殘基。例如，本發(fā)明的重組多肽可能成為融合蛋白，包含有來(lái)自表達(dá)載體或其它來(lái)源的蛋白部分，并包含有來(lái)自豬肺炎支原體的蛋白部分。該重組多肽及其融合物還可能包括一個(gè)起端的蛋氨酸。所有這些使最終的多肽顯示如上所述的固有的豬肺炎支原體表面抗原的抗原性。
在本發(fā)明的表面抗原中還有合成或重組上述多肽的肽鏈。該肽鏈的特點(diǎn)是具有一個(gè)或幾個(gè)由表面抗原鑒定的表面抗原位點(diǎn)。這些位點(diǎn)可以測(cè)定，含此位點(diǎn)的肽鏈也可用不同的方法制成。例如，見(jiàn)歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)83301589.4，公布號(hào)為0090581，發(fā)表于1983年10月5日。和Geysen，H.M.，etal.所著“Use of Peptide Synthesis To Probe Viral Antigens For Epitomes To A Resolution of A Single Amino Acid”，Proc.Nate.Acad.Sci USA，vol 81∶3998-4002，1984。在此提出這些材料以結(jié)合參考。
本發(fā)明的表面抗原還包括上述肽鏈或多肽的突變。此突變發(fā)生在DN或氨基酸的水平，可用以改進(jìn)抗原的產(chǎn)量、抗原的免疫原性或抗原性、或改進(jìn)它們的對(duì)各種純化方案的相容性及對(duì)各種佐劑和各種給藥方式的相容性。
最后，本發(fā)明的表面抗原可與同種化合物抗原性位點(diǎn)或混合化合物抗原性位點(diǎn)相連接。當(dāng)然，此連接，可見(jiàn)于按照本發(fā)明，來(lái)自上述的各類(lèi)表面抗原中。
參考圖1至圖5。在本發(fā)明限定的綱目?jī)?nèi)，描述了其中各種表面抗原。例如，各圖顯示一融合蛋白，此融合蛋白由來(lái)自表達(dá)載體及其連接子的蛋白部分和來(lái)自豬肺炎支原體的蛋白部分所組成。但每一融合蛋白都顯示本發(fā)明表面抗原所要求的抗原性。應(yīng)該明了，僅只融合產(chǎn)物的豬肺炎支原體部分也可顯示其抗原的特點(diǎn)，并且也是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。因此，該多肽的已知重組或合成的技術(shù)也是本
發(fā)明內(nèi)容
的一部分。相似的肽鏈，在抗原位點(diǎn)的基礎(chǔ)上，以上述多肽的操作辦法同樣可制備出來(lái)，并且也沒(méi)有脫離本發(fā)明的范圍。最后，圖1至圖5中表示的支原體DNA順序(劃線(xiàn)部分)，按照本發(fā)明可用作雜交探針，選擇豬肺炎支原體的其它的表面抗原;和選出完全或至少是較為完全的抗原的DNA編碼順序，DNA順序編碼的該抗原其氨基酸順序也是圖中顯示的一部分。然后，將該DNA順序以圖1至圖5中，對(duì)DNA順序?qū)嵸|(zhì)上相同的方法去制備本發(fā)明的表面抗原。圖1至5中顯示的各個(gè)DNA順序，這些順序的劃線(xiàn)部分和由此而選出的DNA順序，都包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
在豬肺炎支原體表面抗原DNA順序編碼的克隆和表達(dá)中，有很多種載體可供使用。例如包括有染色體片段組成的載體，非染色體的和合成的DNA順序，諸如各種已知的SV40的衍生物，已知的細(xì)菌性質(zhì)粒，如大腸桿菌質(zhì)粒，包括ColEl，p CR1，p BR322，p MB9及它們的衍生物;廣泛的宿主質(zhì)粒，如RP4，DNAS噬菌體，如λ噬菌體的眾多衍生物，如NM989，和其它DNA噬菌體，如M13和絲狀單帶DNA噬菌體;酵母質(zhì)粒，諸如，2μ質(zhì)粒或其衍生物;還有來(lái)自DNAS噬菌體和質(zhì)粒結(jié)合的載體，諸如，供DNA噬菌體或其它表達(dá)控制順序使用的修飾的質(zhì)粒。
在各專(zhuān)一性的克隆或表達(dá)載體中，有很多位點(diǎn)可供本發(fā)明插入的DNA順序選擇使用。這些位點(diǎn)通常是用限制性?xún)?nèi)切酶點(diǎn)命名，用這方面的技術(shù)該酶可識(shí)別位點(diǎn)并切割之。眾所周知，在位點(diǎn)間插入DNA順序形成重組DNA分子，有很多種方法。例如，包括dG-dC或dA-dT尾接法，直接連接法，合成的連接子外切酶和聚合酶-連接修復(fù)反應(yīng)后，繼以連接的方法，或用DNA聚合酶將DNA帶延伸為適宜的單鏈模板后，繼而連接的方法。當(dāng)然，應(yīng)該明了本發(fā)明所用克隆或表達(dá)載體并不需要限制性?xún)?nèi)切酶的位點(diǎn)供選定的DNA片段插入，而是采用其它的方法使載體與片段結(jié)合。
為了表達(dá)本發(fā)明的DNA順序，這些DNA順序有效地連結(jié)到一個(gè)或更多個(gè)表達(dá)控制順序中。這一有效連結(jié)可在選定DNA順序插入克隆載體之前或以后實(shí)施，使表達(dá)控制順序能夠控制或啟動(dòng)插入DNA順序的表達(dá)。
廣泛多樣表達(dá)控制順序中的任何一種順序一控制DNA順序表達(dá)的順序，當(dāng)對(duì)其施以有效連結(jié)時(shí)一可用于載體中以表達(dá)本發(fā)明的DNA順序。象這樣可用的表達(dá)控制順序，包括例如，SV40的早期和晚期的啟動(dòng)子，Lac系統(tǒng)，trp系統(tǒng)，TAC或TRC系統(tǒng)，λ噬菌體的大操縱子區(qū)和啟動(dòng)子區(qū)，fd外衣蛋白的控制區(qū)，3-磷酸甘油酸激活酶的啟動(dòng)子，或其它糖解酶的啟動(dòng)子，酸性磷酸酶的啟動(dòng)子，如Pho5，酵母α-matung因子的啟動(dòng)子以及其它原核細(xì)胞或真核細(xì)胞及其病毒基因的控制表達(dá)的順序和由此而結(jié)合的各種順序。在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中，將基因連結(jié)到去氫葉酸還原酶編碼中并選用中國(guó)侖鼠卵巢細(xì)胞為宿主，可為擴(kuò)增表達(dá)單位增加了可能。
載體或表達(dá)載體、尤其是為選定的DNA片段插入選定的位點(diǎn)和本發(fā)明使用的表達(dá)控制順序，是由各種各樣很多因素決定的，如，對(duì)某一特定的限制性酶敏感位點(diǎn)的數(shù)目，被表達(dá)的蛋白質(zhì)的大小，表達(dá)的特征，諸如與載體有關(guān)的順序編碼的起始和終止的部位，以及其它一些已知的技術(shù)工作中的因素。選擇載體，表達(dá)控制順序和選擇為特定的磷脂酶抑制蛋白順序插入的位點(diǎn)，是由這些因素綜合平衡而決定的，對(duì)一種情況來(lái)說(shuō)，不是所有選擇都能完全地有效。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，我們使用一個(gè)來(lái)自細(xì)菌噬菌體λ(PL)的衍生物，細(xì)菌性質(zhì)粒p EX29，作為表達(dá)控制順序。p EX29是p BR322的衍生物，并在EcoRⅠ的位點(diǎn)將我們的DNA順序插入質(zhì)粒中進(jìn)行無(wú)性繁殖和表達(dá)。
重組含有所需基因的DNA分子，將其有效地連結(jié)于表達(dá)控制順序上，然后轉(zhuǎn)化多種宿主中適宜的宿主，使轉(zhuǎn)化宿主能表達(dá)該基因或由此而得的片段，產(chǎn)生雜交DNA編碼的多肽或它的一部分。重組DNA分子同樣可用于轉(zhuǎn)化宿主使宿主能復(fù)制產(chǎn)生更多的重組DNA分子，以作為豬肺炎支原體基因及其片段的來(lái)源。
在制備本發(fā)明的抗原和DNA順序中，有很多種宿主可以使用。這些宿主包括例如，細(xì)菌，諸如大腸桿菌、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬;真菌，諸如酵母;動(dòng)物，諸如CHO細(xì)胞和組織培養(yǎng)中的植物細(xì)胞。
由這些宿主中選擇一個(gè)適宜的宿主使用時(shí)，受技術(shù)操作中已知的許多因素的控制。包括例如，與選定載體的相容性，付產(chǎn)物的毒性，所需多肽回收的易行性，表達(dá)的特征，生物完全性和成本。為一特定的重組DNA分子或多肽，由這些因素中任何一種因素絕對(duì)地選擇宿主是不行的，而應(yīng)綜合平衡這些因素，因?yàn)檎鎸?shí)情況是全部的宿主都不能完全有效的表達(dá)一個(gè)特定的重組DNA分子。本發(fā)明的優(yōu)選整體方案中，我們使用了大腸桿菌GCl，該菌包含pc1857質(zhì)粒，具有耐卡那霉素和對(duì)λCI溫度敏感抑制的基因編碼。
如前所證實(shí)，應(yīng)該明了一個(gè)克隆或表達(dá)載體在選定位點(diǎn)插入的DNA順序，可包括不是所需多肽真正基因編碼部分的核苷酸，或者僅只包括該蛋白整個(gè)基因一個(gè)片段，僅僅要求的是不管使用什么樣的DNA順序，轉(zhuǎn)化宿主應(yīng)產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。例如，本發(fā)明的DNA順序可在本發(fā)明表達(dá)載體中，以同樣讀碼融合而成為至少是一個(gè)真核或原核傳遞體蛋白編碼的DNA順序一部分，或至少是一個(gè)真核或原核信號(hào)順序或它們的結(jié)合順序的DNA順序編碼。這樣的結(jié)構(gòu)有助于所需DNA順序的表達(dá)，改善純化，有利于突變，還有助于由宿主細(xì)胞得到所需的多肽。DNA順序可包括一個(gè)ATG起始編碼，單獨(dú)的或與其它編碼一起，二者替換著，直接融合到為所需多肽第一個(gè)氨基酸編碼的順序。這樣的結(jié)構(gòu)能產(chǎn)生，例如蛋氨?；蚱渌幕亩嚯?，該多肽為本發(fā)明的一部分。這個(gè)N-端的蛋氨酸或肽鏈，可用各種已知的方法，在胞內(nèi)或胞外切割，或者以本發(fā)明的方法，該多肽與蛋氨酸或其它附著的融合蛋白組合。
本發(fā)明的多肽和肽鏈顯示的豬肺炎支原體的抗原性可用于建立鑒定豬群中支原體肺炎感染的方法和藥盒，并且由此而識(shí)別某一豬群中已被該病毒感染的豬，以便盡早給豬群接種而抵抗感染。
為了上述目的，例如，以本發(fā)明的重組DNA分子轉(zhuǎn)化宿主制成的表面抗原或抗該抗原而得的抗體，可用放射免疫法或酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定之。放射免疫測(cè)定的方法之一抗本發(fā)明表面抗原的抗體，在實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物，如兔體內(nèi)獲得，將其附于固相載體上，例如，置于試管內(nèi)。然后向試管內(nèi)加入表面抗原使之與抗體結(jié)合。每一豬群內(nèi)，每10至20個(gè)豬中任取一個(gè)豬血清樣品，與一已知量的標(biāo)以放射性同位素，諸如放射性碘的表面抗原的抗體混在一起后，加入覆以抗原抗體復(fù)合物的試管內(nèi)。在豬血清中任何表面抗原(豬肺炎支原體感染的一個(gè)標(biāo)志)的抗體將與標(biāo)記抗體競(jìng)爭(zhēng)抗原一抗體復(fù)合物上沒(méi)有結(jié)合的位點(diǎn)。一旦血清完成了相互作用，則將多余的液體除掉，沖洗試管后，計(jì)數(shù)放射性活性的數(shù)量。陽(yáng)性結(jié)果，即檢查的豬血清含有豬肺炎支原體抗體，表現(xiàn)為放射活性的計(jì)數(shù)降低。
酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定的方法之一微孔平板覆以本發(fā)明的表面抗原，每一豬群內(nèi)，每10至20個(gè)豬中任取一個(gè)豬血清樣品，加在微孔平板上。孵育一段時(shí)間，使血清中存在的抗體與抗原相互作用后，沖洗平板，并加入由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物制備取得的，連以酶標(biāo)記的表面抗原的抗體，孵育使其發(fā)生反應(yīng)后，再次沖洗平板。此后，在微孔平板上加入酶的底物，孵育一段時(shí)間，使酶作用于底物，并對(duì)最后制品的吸附進(jìn)行測(cè)量。吸附變化大表明為陽(yáng)性結(jié)果，即檢查的豬血清中含有豬肺炎支原體的抗體，而豬是被該病毒所感染。
用已知標(biāo)準(zhǔn)方法的技術(shù)可制備本發(fā)明供豬使用的疫苗。例如，選定的多肽可溶于消毒的生理鹽水溶液中。為了長(zhǎng)期儲(chǔ)存，可將多肽冷凍干燥，給藥之前，再制成消毒生理鹽水溶液。冷凍干燥前可加入防腐劑和其它諸如甘油或氯化鈉等保證其容量的標(biāo)準(zhǔn)添加劑。一個(gè)適宜的佐劑也可與疫苗一起給藥。
根據(jù)本發(fā)明，疫苗也能夠用，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物如兔體內(nèi)獲得的抗本發(fā)明多肽的抗體而制成。此“被動(dòng)”免疫疫苗給豬應(yīng)用時(shí)，能夠保護(hù)豬免受肺炎支原體的感染。
本發(fā)明疫苗優(yōu)選的是溶在消毒生理鹽水中，注射給藥，劑量為每個(gè)豬幾毫克的多肽。疫苗的優(yōu)選給藥時(shí)間是豬齡1至2周，并且最好是在豬齡4-6周時(shí)，追加再次免疫或強(qiáng)化注射一次。
實(shí)施例1.豬肺炎支原體的培養(yǎng)我們從美國(guó)樣板培養(yǎng)中心得到豬肺炎支原體(貯藏號(hào)ATCC27719)，將其培養(yǎng)在37℃的Friis氏培養(yǎng)基(見(jiàn)N.F.Friis，Nord.Vet.Med.27期，337-339頁(yè)(1975年)。將原種培養(yǎng)物貯存在-70℃以1∶10稀釋接種在培養(yǎng)液上。在對(duì)數(shù)中期(2-5×107細(xì)胞/毫升)收集支原體，這時(shí)培養(yǎng)液顏色變成淡澄黃色。將培養(yǎng)物在4℃，12500×g下離心15分鐘。在PBS緩沖液中洗兩次(含150mM氯化鈉，10mM磷酸鈉的緩沖液pH7.4)，重懸在原體積1/100的PBS緩沖液中。
2.標(biāo)記支原體蛋白根據(jù)J.J.Marcha louis等人的方法(見(jiàn)Biochem，J.124期921-927頁(yè)(1971年)，將豬肺炎支原體表面蛋白在乳過(guò)氧物酶催化下碘化。取20ml對(duì)數(shù)中期培養(yǎng)物，在PBS中洗兩次，懸在0.6ml的PBS中。將0.3ml的懸液用超聲波予處理(5×15s)，用作對(duì)照。將全部細(xì)胞和超聲處理細(xì)胞標(biāo)記，加入的試劑(溶在PBS中)量和順序如下5μl(5×10-5M，Merck公司產(chǎn)品，10μl乳過(guò)氧物酶(0.2mg/ml，Sigma公司產(chǎn)品)，50μci游離125I載體(New Enland Nuclear公司產(chǎn)品)和3μl H2O2(9×10-4M)。5分鐘后，加入3μl的H2O2，反應(yīng)持續(xù)5分多鐘。將樣品緩沖液加入放射性碘化的樣品，然后跑凝膠電泳。
將20毫升Friis培養(yǎng)液中的培養(yǎng)物用250μci〔32S〕-蛋氨酸(Amersham公司產(chǎn)品)標(biāo)記總體支原體蛋白。在對(duì)數(shù)中期收集細(xì)胞，如前制備蛋白萃取物。
3.分離DNA用Blin和stafford方法(“核酸研究”3期，2303～2308頁(yè)(1976)年))從豬肺炎支原體培養(yǎng)物中分離其基團(tuán)組DNA，用其分離真核細(xì)胞的DNA。
4.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)和Western吸附法用Laemmli方法(見(jiàn)“自然”227期，680-685頁(yè)(1970年))，將大腸桿菌萃取液或支原體溶胞液在聚丙烯酰胺凝膠上跑電泳。再用Towbin等人(見(jiàn)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)，76期，4350-4354頁(yè)(1979年))方法進(jìn)行Western吸附。從而將電泳分離的蛋白電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維紙上(4℃下以60伏/0.3安培，在192mM甘氨酸，25mM Tris-HCl緩沖液(pH8.3)和20%甲醇中用Transblot電泳裝置(Biorad公司產(chǎn)品)，電泳轉(zhuǎn)移一夜，再用抗血清和放射碘化的蛋白A鑒定分離的蛋白。
5.制備抗血清將新鮮豬肺炎支原體培養(yǎng)物直腸注入一頭未被支原體感染的10周令豬(每次注射2×107個(gè)細(xì)胞)，在3個(gè)月內(nèi)每隔2到4周注射一次。每次注射前一周采集血清，第六次注射后取的抗血清(抗血清19)用來(lái)進(jìn)行下述的免疫篩選。將第二頭10周令豬以用Freund氏完全佐劑乳化的2×107支原體直腸接種一次，3周后采集抗血清(抗血清20)也用來(lái)進(jìn)行免疫篩選。
我們用Western吸附法分析這些支原體表面抗原抗血清的特異性。首先通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析總體支原體蛋白，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾紙上，用抗血清19和20以及對(duì)這二者予先免疫的抗血清處理濾紙。結(jié)果示在圖6(舉1為予免疫血清對(duì)抗血清;帶2為抗血清19;帶3為予先免疫血清對(duì)抗血清20;帶4為抗血清20;帶8為用考馬斯蘭染色的總體支原體蛋白質(zhì))。如圖6所示，我們的抗血清只識(shí)別了總體支原體蛋白中限定的一組大約11個(gè)蛋白。
為說(shuō)明這些抗血清特異識(shí)別的支原體蛋白都位于細(xì)胞表面。我們可將總體支原體蛋白的Western吸印圖與用乳過(guò)氧物酶法碘化總體支原體的〔125I〕-標(biāo)記蛋白的放射自顯影圖比較，因?yàn)閮H僅細(xì)胞表面蛋白才被碘化(圖6，帶5)。如圖6帶5所示，許多在Western吸印中與兩種抗血清反應(yīng)的蛋白也都與在整個(gè)菌中被碘化的蛋白共遷移。這說(shuō)明我們的抗血清對(duì)細(xì)胞表面蛋白是特異性的。
我們也將整個(gè)支原體碘化與體內(nèi)用〔35S-蛋氨酸〕標(biāo)記的超聲處理細(xì)胞萃取液(圖6，帶6)或總體支原體蛋白(圖6，帶7)比較。與僅有少數(shù)蛋白標(biāo)記(大約10個(gè))的整個(gè)細(xì)胞標(biāo)記相反，該細(xì)胞萃取物碘化和總體細(xì)胞蛋白標(biāo)記導(dǎo)致多得多的蛋白被標(biāo)記，它的輪廓與用考馬斯蘭染色的總體染色的總體支原體蛋白相似(圖6，帶8)。結(jié)論是我們的抗血清主要是抗細(xì)胞表面組分的，首先結(jié)合在支原體膜外面。
5.克隆支原體DNA片段我們決定將支原體DNA直接克隆到一個(gè)表達(dá)載體中，用上面制備的抗體篩選表達(dá)支原體表面抗原的表達(dá)載體文庫(kù)。
在200μl含33mM Tris-HCl(pH7.6)，10mM Mn Cl2，1mMβ巰基乙醇的緩沖液中，室溫下用2ng脫氧核糖核酸酶Ⅰ(Boehringer，Mannheim公司產(chǎn)品)酶解20μg支原體基因組DNA(上面制備)5分鐘，得到大約100～1000對(duì)堿基對(duì)的片段(平均約300對(duì)堿基)。加入大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ，〔32P〕-標(biāo)記的EcoRⅠ酶切支原體DNA，將其連接到表達(dá)載體PE×29的EcoRⅠ位點(diǎn)。
表達(dá)載體PEX29(E.Beck建立，未發(fā)表)是pPLc24的衍生體(見(jiàn)E.Remaut等人“基因”15期，81～93頁(yè)(1981)及它們?cè)凇盎颉?2期，103～113頁(yè)(1983)的文章)。如圖6所示，與pPLc24比較PEX29P在缺失的PL和Ms區(qū)(為100個(gè)N-末端氨基酸)之間有EcoRⅠ原來(lái)的點(diǎn)和一個(gè)引入BamHⅠ和HindⅢ點(diǎn)間的一個(gè)多連接子。與pPLc24一樣，其表達(dá)載體攜帶為β-內(nèi)酰胺酶編碼的基因(抗氨芐青酶素)。
1 PMO1 DNA(從所加連接子放射活性推算)連接到1PMO1載體，生成大約5×104個(gè)轉(zhuǎn)化體;大約75%攜帶插入體的克隆。
將大腸桿菌GCl菌株(T.F.Meyer送的禮品見(jiàn)T.F.Meyer，“細(xì)胞”30期，45～52頁(yè)(1982))在28℃培養(yǎng)，達(dá)密度為4～7×107細(xì)胞/毫升。根據(jù)D.Hanahan的方法(見(jiàn)“分子生物學(xué)雜志”，166期557～580頁(yè)，1983)，用其制備轉(zhuǎn)化體。質(zhì)粒pcI857轉(zhuǎn)化的菌株被用作制備攜帶支原體DNA插入體的PEX29的克隆和表達(dá)宿主。質(zhì)粒pcI857攜帶一個(gè)卡那霉素抗性標(biāo)記和溫度敏感的λCⅠ抑制基因(見(jiàn)E.Remant等人“基團(tuán)”22期，103～113頁(yè)(1983年))，它從pL啟動(dòng)子調(diào)節(jié)表達(dá)。菌株有該質(zhì)粒存在時(shí)，將其在42℃孵育于培養(yǎng)液中誘導(dǎo)，表達(dá)載體中支原體的DNA可以表達(dá)。通過(guò)核糖體結(jié)合點(diǎn)從Ms聚合酶起始在PEX29中的轉(zhuǎn)譯。(見(jiàn)圖6)。在PEX29的EcoRⅠ點(diǎn)，插入DNA的表達(dá)產(chǎn)生一個(gè)由Ms2100個(gè)N-末端氨基酸，連接子編碼的任意氨基酸和在任意相中止碼前，及插入DNA中無(wú)中止碼時(shí)，DNA插入體編碼的氨基酸及為緊跟著連接子和產(chǎn)生第一個(gè)相內(nèi)中止碼的載體順序編碼的任何附加氨基酸組成。
6.基因組文庫(kù)的免疫篩選大約3×105個(gè)轉(zhuǎn)化體于28℃，生長(zhǎng)在20個(gè)25cm×25cm瓊脂平皿上，生成直徑為1mm的菌落。將這些菌落轉(zhuǎn)移到硝酸纖維濾紙上。轉(zhuǎn)移后立即將濾紙鋪在預(yù)熱的瓊脂平皿上，20℃下擱置2小時(shí)。將菌落暴露在氯仿蒸汽中15分鐘，使菌落溶胞。然后將濾紙風(fēng)干30分鐘，浸泡在含2%牛血清蛋白的PBS中2小時(shí)，與抗血清19(用含1%牛血清蛋白，0.01%NP40的PBS將其稀釋500倍)孵育過(guò)液。孵育前，用E.Coli萃取液吸收抗血清，降低菌落染色的本底。用含0.05%NP40的PBS洗濾紙，用〔125I〕標(biāo)記的蛋白A孵育4小時(shí)，用PBS，0.05%NP40大范圍地沖洗濾紙。重復(fù)取出放射自顯影圖上顯示信號(hào)的菌落，用同樣程序再篩選。
大約有40個(gè)克隆顯示不同程度的正信號(hào)。最后選出其中10個(gè)用來(lái)分析它們表達(dá)的蛋白，數(shù)量占合成總蛋白的10到20%。其余的克隆或者是只提供少量(＜10%)合成的融合蛋白或者是提供不穩(wěn)定的融合蛋白質(zhì)。因此就沒(méi)進(jìn)一步定性它們。當(dāng)然必須懂得其余選擇的克隆含為支原體細(xì)胞表面抗原編碼的DNA順序。所以，它們和其它用本發(fā)明方法選擇的克隆也是本發(fā)明的一部分。為分析其順序，與上述選出的10個(gè)克隆一樣來(lái)處理這些克隆。也可將其順序與選出的10個(gè)克隆的順序比較，并用在各種表達(dá)載體中生產(chǎn)由它們編碼的抗原。
7.大腸桿菌中融合蛋白的表達(dá)將所選10個(gè)克隆于28℃培養(yǎng)在每毫升含50μg氨芐青霉素和25μg卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，直到密度為2×108細(xì)胞/ml。在有效通氣條件下將培養(yǎng)物(用預(yù)熱的培養(yǎng)基稀釋5倍)在42℃孵育2小時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)。(見(jiàn)H.Kiipper發(fā)表在第四屆國(guó)際工業(yè)微生物遺傳會(huì)議刊222-226頁(yè)(1982)的文章)。然后將0.5ml細(xì)菌樣品(相應(yīng)有2×108個(gè)細(xì)胞)沉淀，再懸浮在相同體積的樣品緩沖液(含4%SDS，125mM Tris-HCl pH6.8，10%β-巰基乙醇，10%甘油和0.02%溴酚蘭)中，煮沸5分鐘，在12.5%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳上分析(見(jiàn)英國(guó)LaemmLi，“自然”227期，680-685頁(yè)(1370))。
圖8(A)表示選中的10個(gè)大腸桿菌克隆總體細(xì)胞萃取液的考馬斯蘭染色凝膠。該圖也顯示純化的質(zhì)粒pPIc24用考馬斯蘭染色的萃取液，該質(zhì)粒表達(dá)相應(yīng)于Ms2聚合酶N-末端的11K蛋白，圖8(B)表示上述用抗血清19和〔125I〕標(biāo)記的蛋白A吸附的所選細(xì)胞萃取液的Western吸附圖。正如圖8(B)所示，用不同強(qiáng)度的抗血清與融合蛋白反應(yīng)的結(jié)果。為大量制備這些蛋白。將在28℃培養(yǎng)一夜的20ml培養(yǎng)液在180ml培養(yǎng)基中稀釋?zhuān)?2℃攪動(dòng)孵育2小時(shí)，將細(xì)胞沉淀，然后用30ml含50mM Tris-HCl(pH8)，100mM Na Cl緩沖液沖洗細(xì)胞，再重懸在1.6ml含10%蔗糖，50mM Tris-HCl(pH8)緩沖液中。加入0.4ml溶胞酶(5mg/ml)和0.4ml0.5M EDTA，將細(xì)胞在37℃孵育30分鐘。然后加入4ml去利通溶胞混液(含0.1%去利通X-100，50mM Tris-HCl pH8.0，72.5mM EDTA)，將混液擱置冰上15分鐘，進(jìn)一步在37℃孵育30分鐘。然后將細(xì)胞超聲波處理(4×15s)，再在20，000×g下離心30分鐘，然后離心，再用5ml 7M尿素37℃下萃取30分鐘。用12.5%制備性SDS-聚丙烯酰胺純化溶在7M尿素上清液的融合蛋白。
用考馬斯蘭(含0.06%考馬斯亮蘭，50%甲醇和10%醋酸)染色10分鐘，沖洗后肉眼可見(jiàn)融合蛋白帶。將凝膠搗碎，用含0.1%SDS的PBS于42℃將蛋白洗脫。離心將蛋白與聚丙烯酰胺分離，再將含融合蛋白的上清液濃縮到1mg/ml。從20ml培養(yǎng)一夜的培養(yǎng)物平均可得到0.2～1mg蛋白。
8.用在家兔中產(chǎn)生的抗融合蛋白抗血清鑒定特異性支原體蛋白在家兔中生產(chǎn)抗上述的Ms-支原體融合蛋白的抗血清。將200～500μg凝膠純化蛋白給每只家兔皮下注射，每2-3周注射一次，共注射3次。第一次注射時(shí)用Freund氏完全佐劑。以后注射都用Freund氏不完全佐劑。3個(gè)月后，收集抗血清，用Western吸附分析。在ELISA試驗(yàn)得到的不同抗血清的滴度為1∶103到1∶104。
用豬肺炎支原體總體細(xì)胞蛋白Wwstern吸附分析抗血清中存在的特異性支原體蛋白的抗體。圖9表示四個(gè)制備的抗血清的結(jié)果主要與分子量為90.000，命名為p90的蛋白反應(yīng)的抗-1922;主要與分子量為68，000的p68和26，000的p26反應(yīng)的抗-2413。識(shí)別分子量為50，000的p50蛋白抗-442。抗-1921識(shí)別分子量為30，000的p30蛋白?？?1925也與同樣分子量的蛋白(因9中未標(biāo)出)反應(yīng)。所有這些蛋白都與被抗血清19強(qiáng)染色的支原體帶共遷移，它們?cè)趫D中都用箭頭指示出，只有與一個(gè)小帶相關(guān)的p26沒(méi)指示出。用不同融合蛋白免疫的家兔子先免疫血清不被支原體蛋白染色。(沒(méi)在圖9中示出)。這些結(jié)果說(shuō)明我們分離的支原體抗原誘導(dǎo)了能與不連續(xù)的豬肺炎細(xì)胞表面抗原反應(yīng)的特異性抗體。
我們也將支原體表面抗原抗血清識(shí)別的支原體表面蛋白與它對(duì)胰蛋白酶解敏感，因而可能位于支原體細(xì)胞表面聯(lián)系起來(lái)。
作為對(duì)照，我們先制備20ml新鮮支原體培養(yǎng)物。然后離心培養(yǎng)物，用PBS洗一次，再將其懸在2ml的PBS中，用50μg胰蛋白酶孵育1ml的該懸液。剩下的1ml作為對(duì)照不加胰蛋白酶。室溫下孵育10分鐘后，將兩試管內(nèi)的細(xì)胞離心，用PBS洗一次，將沉淀懸在同樣緩沖液中，注入聚丙烯酰胺凝膠。用考馬斯蘭將分離的蛋白染色，或轉(zhuǎn)到Western吸印用的硝酸纖維紙。結(jié)果示在圖10。
如圖10(CB)所示，一些高分子量蛋白選擇性地被胰蛋白酶解成一些小分子量蛋白。圖10(WB)還表示了胰蛋白酶解除去了與本發(fā)明表面抗原抗血清特異性識(shí)別的表面蛋白p90，p68和p50相關(guān)的抗原。同時(shí)，這些抗血清識(shí)別的蛋白位于細(xì)胞表面并具有很多暴露在外面對(duì)胰蛋白酶敏感的部位。兩個(gè)其它的蛋白，抗-1925(圖10)和抗-1921(沒(méi)表示)識(shí)別的p30和抗-2413識(shí)別的p26對(duì)胰蛋白酶不敏感。p30和p26蛋白對(duì)胰蛋白酶這種不敏感性并不意味著它們是非表面蛋白，因?yàn)橐恍┍砻娴鞍滓部梢越Y(jié)合到細(xì)胞膜中，從而它們沒(méi)有胰蛋白酶解所需的位點(diǎn)。p30也不與碘化的表面蛋白共遷移。進(jìn)而，這也不能清楚地證實(shí)p30就不是一種表面蛋白，因?yàn)閜30可能代表一種小的表面成分或一種缺乏酪氨酸殘基的蛋白，因此它不能很好的被標(biāo)記。
抗-1921和抗-1925都識(shí)別p30。Southern吸印顯示插入到PME1021和1925的DNA屬于不同的限制片段。因?yàn)閮蓚€(gè)克隆的DNA順序沒(méi)有同質(zhì)序列部分，所以?xún)蓚€(gè)克隆可能對(duì)應(yīng)同一個(gè)基因的不同區(qū)域或兩個(gè)為同樣分子量的蛋白編碼的不同基因。
另一方面，p25與一個(gè)碘化蛋白共同跑電泳，并被抗血清19微弱地識(shí)別。因此，它好象是位于細(xì)胞表面上。p26也是被抗-2413識(shí)別的兩個(gè)蛋白之一，另一個(gè)蛋白是p68。這些蛋白或者可能是兩個(gè)具有共同抗原決定簇的無(wú)關(guān)蛋白，或者p68是p26的前體。第二種可能性為Southern吸印分析所支持，分析結(jié)果表明僅一個(gè)基因組片段與PME2413克原體插入部分雜交。
我們克隆的抗原定位在表面最直接的證據(jù)是將支原體與特異性抗體原位標(biāo)記。
冷凍薄切片和抗體標(biāo)記是根據(jù)G.Griffiths等人(見(jiàn)“酶學(xué)方法”96期，466-485頁(yè)(1983年))的方法進(jìn)行的。將從10ml培養(yǎng)物得到的支原體細(xì)胞沉淀固定在4%的甲醛中，用2.3M蔗糖浸漬，再冷凍在液氮中。用玻璃刀切片，將薄切片化開(kāi)，轉(zhuǎn)移到Formvar/涂碳的，100目的銅柵上，浮在10μl Ig G懸液上(用含1%小牛胎兒血清的PBS稀釋10倍的)，在室溫下孵育30分鐘。30分鐘內(nèi)用PBS沖洗五次銅柵，然后轉(zhuǎn)移到5μl微量的金黃蛋白A溶液中(1mg/ml)，用含10%小牛胎兒血清的PBS稀釋30倍。室溫下使其反應(yīng)20分鐘。用PBS在30分鐘內(nèi)，將銅柵再?zèng)_洗5次，再用蒸餾水沖洗4次。然后用2%醋酸雙氧鈾染色，然后包埋在1.5%甲基纖維素溶液中。電鏡下觀(guān)察切片。微電鏡圖說(shuō)明抗血清19結(jié)合在支原體膜上，而抗-1922結(jié)合的較少。
9.為支原體細(xì)胞表面抗原定性為了進(jìn)一步為本發(fā)明的細(xì)胞表面抗原定性，我們用常規(guī)的DNA序列測(cè)定方法測(cè)定了五個(gè)克隆的順序(PME1921，1922，1925，2413和442)。得到的DNA順序及從它衍算出的氨基酸順序分別示在圖1到圖5，每個(gè)圖都顯示從表達(dá)載體和連接子(及由它編碼的氨基酸順序)得來(lái)的表達(dá)DNA順序的一部分和從豬肺炎支原體衍算的DNA順序及它的表達(dá)產(chǎn)物。例如圖1中，1-32核苷酸(PME1921)是從載體和連接體得來(lái)的，而33-125核苷酸是從支原體得來(lái)的。然后只表達(dá)了八個(gè)支原體氨基酸，這是因?yàn)槠渲杏幸粋€(gè)中止信號(hào)(位于57-60核苷酸，見(jiàn)圖5)。另一方面，在PME1922中，整個(gè)插入的支原體順序得到了表達(dá)，這是由于其中的第一個(gè)中止信號(hào)在位于該克隆支原體插入順序的羧基末端的載體順序中。
我們制備的5個(gè)克隆的DNA和氨基酸順序都可以不同方式用于制備本發(fā)明的其它表面抗原。例如特異的支原體編碼順序或它們的片段可從每個(gè)克隆分離，并將其用在其它表達(dá)載體生產(chǎn)由它們編碼的抗原，這些抗原是融合蛋白或僅是支原體衍生蛋白。這些編碼順序或片段也可用作制備DNA探針(人工合成或從克隆本身提取的)，這些探針又用來(lái)篩選其它DNA文庫(kù)(cDNA或其因組DNA)，通過(guò)雜交選擇出那些為最完整的已為我們制備的克隆編碼的抗原編碼的同質(zhì)DNA序列和為其它相關(guān)支原體表面抗原編碼的DNA序列。例如可以從在一個(gè)λgt10或λgt11載體制備的較長(zhǎng)的DNA插入體的一個(gè)基因組文庫(kù)中篩選出為這些表面抗原編碼的全長(zhǎng)基因。然后將這些基因如上述在一系列廣泛的宿主和表達(dá)載體中表達(dá)出由其編碼的抗原。
最后，從本發(fā)明的DNA序裂衍算出的氨基酸順序可用于制備含我們細(xì)胞表面抗原的一個(gè)或幾個(gè)抗原性部位的合成肽。見(jiàn)歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)83301589.4，1983年10月發(fā)表的公開(kāi)號(hào)為0090581;和H.M.Geysen等人在美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)81卷3998-4002頁(yè)(1984)的文章。這些合成肽可用于疫苗及上述的診斷試驗(yàn)。
實(shí)施例中所述本發(fā)明的DNA順序，重組DNA分子和轉(zhuǎn)化宿主都貯存在德國(guó)Sammlung Von微生物培養(yǎng)收集中心，地址是西德，哥廷根，貯存日為1985年3月19日。樣品包括(1)大腸桿菌GCl(PC I857)(PM E1921)，貯藏號(hào)D SM3271，(2)大腸桿菌GC1(PC I857)(PM E1922)，貯藏號(hào)D SM3272，(3)大腸桿菌GC1(PC I857)(PM E1925)，貯藏號(hào)D SM3273，(4)大腸桿菌GC1(PC I857)(PM E2413)，貯藏號(hào)D SM3274，(5)大腸桿菌GC1(PC I857)(PM E442)，貯藏號(hào)D SM3275，以上敘述了本發(fā)明的實(shí)施例，很顯然，只要根據(jù)本發(fā)明的材料與方法，可以作適當(dāng)修改而實(shí)施。然而本發(fā)明范圍是由下述權(quán)利要求
來(lái)限定的，而不受實(shí)施例的限制。
權(quán)利要求
1.制備多肽的方法，該多肽可在豬體內(nèi)誘發(fā)與豬肺炎支原體結(jié)合的抗體，該方法包括培養(yǎng)用含有選自下列一組之一的DNA序列的重組DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主，[a]DNA序列GAACAACAATGAAAAAAAGAAATAATGCGTGATTTTTTTGAAAGGGAAGAAAGGCCTTTTTTTATTACCAGTTATATGGCCCTCTTTTC；AAATAATCCTGAATCAAAATCGCAAGATAATGCAAATAAAGGAAATTATCTTTCTTTAAATATTGGTTATCGTAGTTTTGCTGATAAACCTGACTTGCTGATGGTTTTATTACAGTCCCAAAAGTTGGTAAAGAACTTAGTAAATCGACAATTATGGCTGATCCTGTCCCATAAAAAACAGGTAAAAAAAGAGGTCATCGAAAACGGGCAAAAAATAGCAAAAGACCTTGGTGAA；GAATTCAAAGATGAGTTTAAAAAATACTGAACCTAATTTTTTTGTCGGCATCTATGAAAAGGCAATTGATAAACGTTTTTCTTTGATAGATAAAATTAAAATCG；GAATTCGACCGTAAGTGAAACACGTGATTTTATTCAAAAATTTGACATTTTCTATCAGGAAAATGGGCAAAATCAAAGAAGATTTAGATTTTGCAATAGCTCCAAGTTTTATATCTTTATCACTAATTTCTAAGTCCTTGACTAAAAAATTAGAAATTGCTGCTCAAAATCTTAGTCAGTTTGATTCAGGAGCCTTTACTGGGGAAATCAGTGGCAAAATGCTGCAGGATTTAGGGACAAAATATGTAATT；andGAATTCTGGACCTGTATATGGGCCATTTTTACCGGGCGAAGATAAGCGCGAACTCAACCCAATTGTGGCAAAAAGTGCTAATTCAATCACAATTGATCTTAATATTTTATCGATAATAACCAAAACAAAATTATCAGAGAGAGTTGCAGCCTTAAGCAGAGTTGAATTC；[b]與上述DNA序列雜交的DNA序列和為豬肺炎支原體表面抗原編碼并表達(dá)它的DNA序列。[c]為上述任何DNA序列表達(dá)的豬肺支原體表面抗原編碼的DNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中所述多肽是豬肺炎支原體表面抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1或2的方法，其中所述的DNA序列有效地連接到重組DNA分子中的一個(gè)表達(dá)控制序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的方法，其中所述表達(dá)控制序列選自下列一組SV40的早期或晚期后動(dòng)子，Lac系統(tǒng)，TAC系統(tǒng)，TRC系統(tǒng)，trp系統(tǒng)，λ噬菌體的大操縱子和后動(dòng)子，fd殼蛋白的控制區(qū)，3-磷酸甘油酸激酶的后動(dòng)子，其它糖酵解酶的啟動(dòng)子，酵母α-配對(duì)(α-mating)因子啟動(dòng)子和其它控制原核或真核細(xì)胞或它們的病毒基因表達(dá)的序列。
5.根據(jù)上述權(quán)利要求
的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述重組DNA分子選自PME 1921，PME 1922，PME1925，PME 2413和PME 442。
6.根據(jù)上述權(quán)利要求
的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述宿主選自大腸桿菌，假單胞桿菌，芽孢桿菌，酵母或其它真菌，小鼠、豬或其它動(dòng)物或植物宿主和人組織細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求
6的方法，其中所述的大腸桿菌是大腸桿菌GC1。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1-6中任一項(xiàng)所述方法，其中所述宿主選自大腸桿菌GC1(PCI 857)(PME 1921)，大腸桿菌GC1(PCI 857)(PME 1922)，大腸桿菌GCI(PCI 857)(PME 1925)，大腸桿菌GCI(PCI 857)(PME 2413)，和大腸桿菌GCI(PCI 857)(PME 442)。
9.根據(jù)上述權(quán)利要求
中任一項(xiàng)的方法，其中所述的多肽選自NNNNEKKK;NNPESKSQDNANKGNYLSLNIGYRSFADKPDLLMVLLQSQKLVKNLVNRQLWLILSHKKQVKKEVIENGQKIAKDLGE;NSKMSLKNTEPNFFVGIYEKAIDKRFSLIDKIKI;NSTVSETRDFIQKFDIFYQENVGKIKEDLDFAIAPSFISLSLISKSLTKKLEIAAQNLSQFDSGAFTGEISGKMLQDLGTKYVI;andNSGPVYGPFLPGEDKRELNPIVAKSANSITIDLNILSIITKTKLSERVAALSRVEF.
10.制備保護(hù)豬免受肺炎支原體感染疫苗的方法，包括至少一定量有效地誘發(fā)其免疫應(yīng)答的前述各權(quán)項(xiàng)制備的一種多肽及藥學(xué)上可接受的載體。
11.制備宿主的方法，該宿主能表達(dá)一種多肽，將這種多肽用于豬時(shí)可誘發(fā)形成與豬肺炎支原體結(jié)合的抗體，該方法包括用權(quán)利要求
1-5中任一項(xiàng)所述重組DNA轉(zhuǎn)化一個(gè)潛在的宿主。
12.根據(jù)權(quán)利要求
11的方法，其中所述宿主選自下列一組大腸桿菌，假單胞桿菌，芽孢桿菌，酵母或其它真菌，小鼠，豬或其它動(dòng)物或植物宿主及人組織細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求
12的方法，其中所述的大腸桿菌是大腸桿菌GC1。
14.根據(jù)權(quán)利要求
13的方法，其中所述宿主選自下列一組大腸桿菌GC1(PCI 857)(PME 1921)，大腸桿菌GC1(PCI 857)(PME 1922)，大腸桿菌GC1(PCI 857)(PME 1925)，大腸桿菌GC1(PCI 857)(PME 2413)，和大腸桿菌GC1(PCI 857)(PME 442)。
專(zhuān)利摘要
豬支原體的表面抗原，這種抗原是用重組DNA的方法制備的，一種基于該抗原制備的疫苗，用該疫苗治療和預(yù)防豬地方性獸病肺炎，基于這種抗原或它的抗體診斷豬感染肺炎支原體，及為抗原編碼的DNA序列。
文檔編號(hào)C12N5/10GK86102858SQ86102858
公開(kāi)日1987年10月28日 申請(qǐng)日期1986年3月26日
發(fā)明者海因茨·E·沙勒, 莫·奎·克林克特 申請(qǐng)人:拜奧根公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan