專利名稱:用于誘導在體內和體外產生細胞分裂素的化合物制備工藝的制作方法
眾所周知，正常淋巴細胞的生長，不僅取決于與抗原物質或促細胞分裂劑的接觸，而且也取決于某些稱為淋巴細胞活素的生長因子的存在。這些生長因子當中，有一種稱為T-細胞生長因子(TCGF)，通常稱其為微胞間白細胞(殺菌)素-2(IL-2)。這種生長因子的發現(Gillis)等人，《自然》(Nature)，268;154(1977)和Ruscetti等人，《免疫學雜志》(J.Immunol.)，119;131(1977)，導致作為IL-2來源的T-淋巴細胞的大規模培養和克隆化。
動物體內的淋巴細胞或白血細胞有兩種類型B-細胞和T-細胞。B-細胞以免疫球蛋白的形式產生抗體，與侵入體內的微生物結合在一起，而T-細胞則產生決定B-細胞能否發揮作用的淋巴細胞活素。參閱，例如《細胞免疫學》(Cell Immunol.)，3615(1978);《細胞生理學雜志》(J.Cell Physiol)9653(1978);《歐洲免疫學雜志》(Eur.J.Immunol.)8681(1978);《免疫學評論》(Immunol.Rev.)54188(1981);《免疫學評論》54158(1981);《實驗醫學雜志》(J.Exp.Med.)1541500(1981);《國立癌癥研究所月刊》(National Cancer Institute Mon.)60211(1982);《國際癌癥雜志》(Int.J.Cancer)28157(1981);《T-細胞亞種群在癌癥治療中的潛在作用》，編著A.Fefer和A.Goldstein，Raven Press，紐約，173頁及其后文，(1982);《免疫學雜志》128258(1982)。
已知的淋巴細胞活素除IL-2外，還包括B-細胞因子，巨噬細胞活化因子(MAF)，微胞間白細胞(殺菌)素-3(IL-3)，菌落刺激因子(CSF)，腫瘤壞死因子，和由諸如微胞間白細胞(殺菌)素-1(IL-1)和r干擾素這樣的單核細胞產生的其它因子。所有這些因子都由白血細胞分泌，總稱胞質分裂素。對于各種重組體DNA技術和能產生這些物質的正常T-細胞系和B-細胞系的其它克隆化方法的應用受到高度注意。參閱，例如《自然》209130(1976);《免疫學》32319(1977);《實驗血液學》(Exp.Hemat.)8494(1980);《自然》283581(1980);《美國國家科學院院報》(Pnoc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)781858(1981);《免疫學方法雜志》(J.Immunol.Methods)491(1982);《自然》29424/31697-699(1981)，所有這些都列入參考文獻。
本發明基于發現一類合成的碲或硒的有機衍生物能刺激可產生胞質分裂素的細胞在體內和體外產生大量胞質分裂素。這一發現使得有可能采用一種新的治療方法治療癌癥，免疫缺陷，自身免疫疾病和傳染病。
因此，本發明的目的是提供可用作治療藥劑的以碲和硒為基礎的新化合物。
本發明的目的還有提供在體外產生胞質分裂素，例如淋巴細胞活素的新方法，并誘導受體產生這些胞質分裂素。
本發明的目的還有在體內產生像淋巴細胞活素這樣的胞質分裂素，并誘導受體產生胞質分裂素，用來治療疾病，如癌癥，免疫缺陷，自身免疫疾病和傳染病。
本發明的目的還有提供以能在體內外產生胞質分裂素的碲化合物為基礎的新藥組合物。
圖1是實例1化合物在KBr中的紅外分析。
圖2是實例2化合物在KBr中的紅外分析。
可用于本發明的碲或硒的衍生物，包括能刺激細胞產生淋巴細胞活素的具有如下通式的那些化合物
(C)TeO2或(D)phTeCl3或(E)(C6H5)+P(TeCl3(O2C2H4))-其中Q是Te或Se;t是1或0;u是1或0;v是1或0;R，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8和R9，相同或不同，并且可獨立選自下列基團氫，1-5碳的羥烷基，羥基，1-5碳原子的烷基，鹵素，1-5碳原子的鹵代烷基，羧基，2-10碳的烷基羰基烷基，1-5碳原子的鏈烷酰氧基，1-5碳原子的羧烷基，酰基，酰胺基，氰基，1-5碳的酰胺基烷基，2-10碳的N-單烷基酰胺基烷基，4-10碳的N，N-二烷基酰胺基烷基，1-5碳的氰基烷基1-5碳原子的烷氧基，2-10碳原子的烷氧基烷基和-COR10，其中R10是1-5碳的烷基;X是鹵素;在說明這種銨鹽的同時，還應理解其它在藥物學上可接受的鹽，都屬于本發明的范圍。具有五元環的化合物是最理想的。
如同在這里和在追加權項中使用的一樣，1-5碳原子的烷基這一術語包括直鏈和支鏈烷基，例如甲基;乙基;正丙基;正丁基等等;1-5碳原子的鹵代烷基這一術語包括氯甲基;2-碘乙基;4-溴正丁基;碘乙基;4-溴正戊基等等;1-5碳原子的鏈烷酰氧基這一術語包括乙酰基，丙酰基，丁酰基等等;羧烷基這一術語包括羧甲基，羧乙基，亞乙基羧基等等;烷基羰基烷基這一術語包括甲酰基甲基，乙酰基乙基等等;酰胺基烷基這一術語包括-CH2CONH2;-CH2CH2CONH2;-CH2CH2CH2CONH2等等;氰基烷基這一術語包括-CH2CN;-CH2CH2CN;-CH2CH2CH2CN等等;1-5碳原子的烷氧基包括甲氧基，乙氧基，正丙氧基，正戊氧基等等;鹵代和鹵素這些術語用來表示氯，溴，碘和氟;酰基這一術語包括R16CO，其中R16是H，或1-5碳的烷基，例如甲酰基，乙酰基等;芳基這一術語包括苯基，烷基苯基和萘基;N-單烷基酰胺基烷基這一術語包括-CH2CH2CONHCH3，-CH2CONHCH2CH3;N，N-二烷基酰胺基烷基這一術語包括-CH2CON(CH3)2;-CH2CH2CON(CH2CH3)2。
以碲為基礎的化合物是本發明目前優先選擇的化合物。優先選擇的以碲為基礎的化合物包括具有如下化學式的化合物
其中X是鹵素，優先選擇的鹵素化學物是氯。這些化合物能誘導IL-2生成，以及使能產生IL-2的細胞分裂增殖，和使IL-2受體部位活化。
以碲為基礎并可用于本發明實施的其它化合物包括PhTeCl3，TeO2和(C6H5)4P+(TeCl3(O2C2H4))-〔《自然研究雜志》(Z.Naturforsh)，368，307-312(1981)〕。在后面實例2中描述的化合物有如下結構
可用于實施本發明的其他化合物包括
其中R11，R12，R13和R14都可獨立選自下列基團氫，1-5碳原子的羥烷基，羥基，和1-5碳原子的烷基。
可用于制備結構A或B的化合物的有用二羥基化合物，包括化學式Ⅰ的那些化合物，其中R，R1，R4和R5如表所示
(Ⅰ)
表R R1R4R5H H H HH Cl H HH OCH3H HH COOCH3H HH H CN HH CHO H HH H COOH HH CH2COOH H HH H CHCOOCH3HH I H HH H Br HH H CONH2HH H CH2OH HH COOH H H可用于制備化合物A和B的其它二羥基化合物，包括化學式Ⅱ的那些化合物，其中R，R1，R2，R3，R4和R5如表中所示
(Ⅱ)
R R1R2R3R4R5H H H H H HH H Cl H H HH CH2OH H H H HH H OH H H HH H H CH3H HH H H CH2Cl H HH H H COOH H HH H H CH2COOH H HH H H CHO H HH H H H H CH2CHOH H CONH2H H2CH3H H H CN H HH H H H CH2CONH2HH H H COOCH3H3HH H3OCH3H H H用于制備化學式A和B的化合物的其它二羥基化合物，包括化學式Ⅲ的那些化合物，其中R，R1，R2，R3，R4，R5，R8和R9如表所示
(Ⅲ)
R R1R2R3R4R5R8R9H H H H H H H HH H Cl H H H H HH H H H Br H H HH H OCH3H H H H HH H2CONH2H H H H HH Br H H Br H H HH H H H CH2COOH H H HH H Cl H H H H HH CH2COOH H H H H H HH H CH3H H H H HH CH3H H H H H HH CH2Cl H H H H H HH H H H H H H HH CH2CN H H H H H HH H H H CH2CH2OH H H H還有一些二羥基化合物，包括結構式(Ⅳ)的化合物，其中R，R1，R2，R3，R4和R5如下表所示
(Ⅳ)
R R1R2R3R4R5R6R7R8R9H H H H H H H H H HH H Cl H H H Cl H H HH H Cl Cl H H H H H HH H CONCH3H H H Br H H HH H Br H H H CON(CH3)2H H HH H H OCH3H H H H H HH H H H OCH3H H H H HH H H H CH2COOH H H H H HH H COOH H H H H H H HH CH3H H H H H H H HCH3H H H H CH3H H H HH CH2CH3H H H H H Cl H HH CH2CN H H CH2OH H H H H HH H H I H H H H CN HH CH2CH2COOH H H H H H H H HH H CHO H H H H H H HH H H F H H H H H H化學式為
的化合物，其中R11，R12和R15如同上文定義的一樣;可由適當的二，三或四鹵代硒化物或碲化物與可能具有如下化學式的適當羥基化合物反應制備HO-R16
R16是1至5個碳原子的烷基，1至5個碳原子的鹵代烷基，芳基，烷基芳基，1至5個碳原子的烷基酰胺基，1至5個碳原子的烷基羰基，1至5個碳原子的氰基烷基，和2至10個碳原子的烷氧基烷基。R16的具體實例包括甲基，乙基，正丙基，苯基，甲苯基，酰胺基乙基，氰基甲基，甲氧基甲基和CH2CH2COOH。
這些化合物可通過在適當的反應器中，在室溫或高達回流溫度的高溫下，使基本上等摩爾量的反應物化合制備。最好利用一種能溶解反應物的溶劑，如乙腈，苯，甲苯，二甲苯，二甲基亞砜及它們的混合物，等等。結構(A)的化合物只能用乙腈制備。最好的方法，要求把反應混合物加熱至溶劑的回流溫度，同時用一個適用的磁力攪拌器或機械攪拌器攪拌反應混合物。反應可進行足夠長的時間，以確保反應物完全反應。這個時間因反應條件，所制取的特定化合物和溶劑的性質而異。反應可在常壓下進行，但如果需要也可以利用惰性氣氛如氮氣，氬氣，氦氣或它們的混合物。可用的反應時間為1分鐘到168小時，雖然較佳的反應時間為6至16小時。
反應器應是玻璃結構的，或內襯對于反應物呈惰性的玻璃或其它陶瓷材料。
用這種工藝產生的化合物，通常會隨著反應混合物冷卻至室溫而沉淀。添加適當的沉淀劑，例如像己烷這樣的液態烷烴，或者通過借助于真空或無真空的蒸發除去溶劑而使反應混合物濃縮，也可以產生沉淀。產物可用燒結玻璃過濾器收集，用冷溶劑洗滌，然后利用常用技術干燥。產物貯存在避光的適當容器中，最好是貯存在低溫下，以避免分解。
本發明化合物配藥的溶劑系統，包括二甲基亞砜或低級鏈烷醇，如乙醇和丙醇，鄰二醇，如乙二醇，甘油，丙二醇，等等。最好的溶劑系統是磷酸鹽緩沖鹽水溶液，其水中含有一定量的酸式磷酸鈉，得到的PH值為7.1～7.2(PBS)。
技術熟練人員會知道，對于會干擾特定化合物合成的活潑基團的存在，需要使用一種可用已知方法除去的保護基團。
本發明的化合物，可使用在各種條件下有效的量對哺乳動物給藥，以治療癌癥，免疫缺陷，自身免疫病和傳染病。該治療通過引起哺乳動物體內產生更大量的淋巴細胞活素，減輕這些疾病的癥狀。本發明也包括在體外產生更大量的細胞分裂素，如淋巴細胞活素，和/或它們的受體，并使用這些物質和/或作為治療劑，對哺乳動物給藥，以減輕癌癥，免疫缺陷和傳染病。可以預期，本發明的配方可與其它抗癌化學治療劑，如環磷酰胺聯合使用。
癌癥這一術語，通常包括由于接觸致癌物質，由于放射及由于腫瘤病毒而自發產生的白血病和硬腫瘤。這些病癥為本領域熟練的技術人員所熟知，而且包括這樣的病癥，如腎上腺腫瘤，骨腫瘤，胃腸腫瘤，腦腫瘤，乳房腫瘤，皮膚腫瘤，肺腫瘤，卵巢腫瘤，泌尿生殖器腫瘤等。《默克手冊》(Merck Manual)第13版(Merck & Co.(1977))描述許多種這樣的腫瘤。這個出版物第647-650;828-831;917-920;960;970-974;1273;1277;1371-1376;1438-1441;1563;1612;1615頁，均列入本文參考文獻。
免疫缺陷這一術語，通常描述一類各不相同的病癥，例如獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)，其主要特征是對各種感染的敏感性增加，隨后產生嚴重的急性，復發性和慢性疾病，這是由于在專一性的或非專一性的免疫系統中有一種或幾種缺陷而產生的。《默克手冊》(Merck Manual)第13版第205-220頁描述了很多這樣的疾病，它們都列入本文參考文獻。
自身免疫病這一術語包括如下病癥，其中免疫系統對內生抗原產生自身抗體，導致對組織的傷害。《默克手冊》(Merck Manual)第13版第241-243頁描述許多這樣的疾病，它們均列入本文參考文獻。
傳染疾病這一術語包括那些病理性疾病，是由于細菌、病毒或真菌微生物侵入并破壞哺乳類動物體內的正常功能而產生的。《默克手冊》(Merck Manual)第13版第3-149頁描述這樣的疾病，它們均列入本文參考文獻。
這些化合物的給藥方式可以是口服的，腸胃外的，經皮的、局部的，或通過粘膜接觸。這些化合物可以以膠囊或片劑口服給藥，膠囊或片劑可以用一般的賦形劑，粘合劑，分散劑等制備。腸胃外途徑是目前較好的方法，且組合物可以這樣配制把化合物溶解在適當的溶劑中，例如水緩沖劑和二甲基亞砜或甘油。腸胃外的途徑可以是肌肉內的，靜脈內的，利用持續釋放載體的皮內的，或皮下的途徑。化合物在與藥用載體共用時的濃度是無關緊要的，這只是選擇問題。《雷明頓藥房實踐》(Remingtons Practice of Pharmacy)第九，十，十一版中描述了各種各樣的藥用載體，并列入本文參考文獻。
已經發現，可用于實施本發明的許多碲化合物，在水存在下會水解。這些水解的組合物在活體內外都是有特效的，雖然這些水解的組合物最終要分解，喪失它們誘導淋巴細胞活素分泌的能力。因此，這些組合物應當新鮮配制。如果這些化合物以干的形式經口給藥，那么它們在誘導淋巴細胞活素的產生方面仍有特效。最理想的是，應將這些化合物存放在無水條件下，直至臨使用前再配制。
也已發現，像TeO2這樣的某些化合物，能單獨誘導產生T細胞的淋巴細胞在活體內外產生淋巴細胞活素，但它不會引起產生IL-2的細胞分裂繁殖，也不會使應答T-細胞的淋巴細胞中的接受部位活化。因此，本發明也預期TeO2和碲化合物單獨使用，能有效地誘導產生淋巴細胞活素。
局部使用的組合物，可通過將化合物分散在親水的或疏水的化粧品中制備。可以用凡士林或工業制劑，如Olay(商品名)油。其濃度按重量計，可從0.0001%到5%。
用于刺激淋巴細胞活素產生或治療本文描述的特殊疾病的本發明化合物的劑量，可能因特定的疾病和疾病階段而異。通常該化合物可以給藥的量，范圍從0.05×10-3至1×10-3克/公斤體重，最好從0.1×10-3至0.5×10-3克/公斤體重。例如，對于75公斤體重的哺乳動物，預計每天1-3毫克的劑量，就足以誘導產生淋巴細胞活素，但這個劑量仍可根據進行治療的個體響應和特定病癥加以調整。
除治療上文描述的哺乳動物病癥外，這些化合物也可以用于獸醫用途，以治療馬，有蹄動物和家禽所患的病毒性疾病和免疫疾病。治療這些病癥可以使用的量，就是可以治療上文描述的哺乳動物病癥的化合物的那些量。
對于體外使用，可以刺激細胞產生淋巴細胞活素的用量是1×10-8至1×10-4克，最好是1×10-7至1×10-5克化合物/106細胞/毫升。
對小鼠的初步毒性研究已確定，對于6周齡的小鼠，采用實例1的化合物，其半致死劑量LD50為300微克/25克體重。這些化合物可用作植物或動物的抗菌劑或抗病毒劑。病毒感染，例如小鼠中的西尼日病毒感染，對于實例1化合物可感受的劑量為10微克/天/只小鼠。植物細菌感染，例如由腫脹野桿菌(Agrobacterium tumefaciens)引起的根瘤，施用本發明化合物的0.1%溶液，即可治療或預防。
本發明也考慮了一種將本發明化合物溶解于水載體中的方法。這種方法包括利用長時間超聲波攪拌或機械攪拌使化合物溶解。通常由變頻器把50/60赫的交流市電轉換為高頻電能，再偶合到振子上產生超聲波。采用壓電陶瓷制品使電頻率轉變為機械振動。典型的40千赫芝0.0003振幅的設備和20千赫芝0.00007至0.001振幅的裝置是有用的。超聲振子配備一個增壓器與集音器連接，后者有一個部件用以把超聲波傳導到盛有液體的容器，用以溶解本發明的化合物。有用的裝置包括小型超聲波清洗機，例如Bronson儀器。已經發現，含大約5毫克/100毫升的本發明的溶液，可在足以提供含本發明化合物水溶液的時間內應用超聲波制備。對此，所需的時間通常是3小時到24小時。為此目的可使用高速機械振動器，如Tutenhauer振動機，或韋林氏攙合器。用電動攪拌器，通常在攪拌3至4小時后將使化合物形成溶液或懸濁液。
已經發現，可以用甘油配制含這種化合物的含水液體。然后，用可注射的水稀釋劑，如水，鹽水溶液等，來稀釋這些制劑。優先選擇的稀釋劑是PBS。
下列實例是本發明的具體說明，當然，它們不限制本發明的范圍。
實例1將0.01摩爾乙二醇和0.01摩爾四氯化碲溶解在35毫升干燥的乙腈中，并放入裝有回流冷凝器和電磁攪拌器的燒瓶中。將反應混合物回流6小時，溶液趁熱用燒結玻璃過濾器過濾，收集濾液并使溫度降到室溫，使其形成白色沉淀。在燒結玻璃過濾器中過濾并收集沉淀，用冷的乙腈洗滌，在0.05毫米Hg的真空下干燥10小時。熔點(d)為200℃。元素分析計算值是，%C＝7.70;H＝2.57;N＝4.49;Cl＝34.06;O＝10.26;Te＝40.92。實測值C＝7.87;H＝2.5;N＝4.5;Cl＝33.38;O＝10.13;Te＝41.12。質子核磁共振譜(氘化的二甲基甲酰胺)σ(PPm)4.43(4H，s)，7.7(4H，t)。質譜是m/e130，160，165，180，190，200，222，224，247，251，258，260;13C核磁共振譜證實存在CH2基團;125Te核磁共振譜證實該分子中存在一個Te原子。
Cl分析中出現的差異，可能是由于樣品中存在少量化學式Ⅱ的化合物。
實例2在裝有回流冷凝器和電磁攪拌器的燒瓶中，放入含0.01摩爾四氯化碲的50毫升干燥苯，添加0.01摩爾乙二醇。反應混合物回流16小時，趁熱通過燒結玻璃過濾器過濾，以下步驟同實例1，只是用苯做洗滌液。得到分子式Ⅱ的化合物。熔點(d)約250℃。
實例3按下列步驟配制實例1化合物的溶液取5毫克實例1化合物置于容量瓶中，加入100毫升含40%二甲基亞砜(DMSO)和60%磷酸鹽緩沖劑鹽水(PBS)的溶液，得到的溶液濃度為10微克/0.2毫升。如果溶液是混濁的，可以2000轉/分的速度離心分離10分鐘，取上層清液備用。
實驗動物是6～8周齡的Balb-C小鼠。用25號5/8″皮下注射針頭，全部向腹膜腔內注射0.2毫升實例1化合物的溶液。
動物接受下列注射(a)對照組(無注射)(b)對照組(0.2毫升DMSO)(c)1微克實例1化合物(0.2毫升DMSO/PBS溶液)(d)10微克實例1化合物(0.2毫升DMSO/PBS溶液)a，b，c和d組各由21只動物組成，從注射后24小時起至7天，每天處死這些動物。
每天將各對照組三只動物的脾細胞集中在一起處理，讓這些脾細胞通過一個60目不銹鋼網，置于一個含PBS的5毫米培養皿中，以便分離這些細胞。收集這些細胞，并以1000轉/分的轉速離心分離10分鐘。棄去上層清液，用5毫升低滲緩沖溶液(0.15MNH4Cl，0.01MKHCO3，溶于重蒸餾水中，PH7.2)將細胞處理2分鐘，以殺滅紅細胞。然后向細胞中加入PBS，以1000轉/分的轉速將這些細胞離心分離10分鐘。用PBS對這些細胞洗滌兩次，在血球計中用錐蟲藍計數，以檢驗其活力。用富RPMI把這些細胞配成107細胞/毫升的濃度，這種富RPMI含10%胎牛血清(英格蘭蘇塞克斯血清實驗室)，5×10-5M2-巰基乙醇和3%d-谷氨酰胺(以色列生物實驗室)(2mM×1000非必需氨基酸的儲備液)(以色列生物實驗室)(儲備液×1000)和丙酮酸鈉(以色列生物實驗室)(儲備液1mM×100)。
再從每個實驗組中各處死三只動物，分別用同樣的步驟處理各個脾臟。
將細胞混合物分成兩組。
(a)在濃度為107細胞/毫升富RPMI的細胞中，加入刀豆球蛋白-A(CON-A)(DiFCO，批號352)2微克/毫升。在37℃，7.5%CO2條件下，將這些細胞在5毫米培養皿(NUNC)中培養24小時，收集上層清液，以1600轉/分的轉速離心分離10分鐘，在4℃貯存備用。對這些上層清液進行IL-2和CSF活性檢定。
(b)濃度為107細胞/毫升富RPMI的細胞，不加CONA在37℃，7.5%CO2條件下培養96小時。取上清液，離心分離，貯存在4℃直至使用。對這些上層清液檢定CSF活性。
在細胞培養前，從培養皿取出樣品，用細胞離心法制作培養物涂片。用May-Grunwald-Giemsa(1∶10)溶液將載片染色，根據形態進行評價。利用放射性胸苷檢定法測定IL-2活性。
IL-2活性檢定法1、利用依賴IL-2的細胞系CTLD的增殖，測試上清液的IL-2活性。IL-2檢定是基于這些培養的T-細胞系生長對IL-2的依賴性。從依賴于IL-2的培養物中收集T-細胞，洗滌，然后再放回沒有IL-2的培養物中，T-細胞在24小時內不斷死亡。使用氚化的胸苷結合物(3H-TdR)作為培養的T-細胞重復的指標。IL-2的微量檢定，給出在上述制備的上清液中IL-2活性數量的高度再現指示和定量指示。
2、為了檢定IL-2活性的條件介質，把含有5×104CTLD細胞，10%胎牛血清和50%待查的上清液的樣品，全部懸浮于最終體積為1毫升的RPMI中。在96微孔組織培養盤(NUNC)的四個重復孔中，放入等份量的每種樣品，每份0.2毫升。條件介質是從用CONA刺激的查里斯河大鼠脾細胞培養物中得到的，CONA中含有已知量的IL-2，作為所有檢定的參比標準。
3、這些微孔在37℃培養24小時，然后加入1微居里/孔的3H-甲基胸苷。隨后將細胞進一步培養過夜，用細胞收集器收集，在β閃爍儀中計數。
以每分鐘計數(CPM)表示的結果如下，結果指出，在上層清液中存在相當數量的IL-2。
a)對照組(無注射)b)對照組(0.2毫升DMSO)c)1微克實例1化合物(0.2毫升DMSO/PBS溶液)d)10微克實例1化合物(0.2毫升DMSO/PBS溶液)
第1天 第2天 第3天 第4天 第6天 第7天(a)＊37，695 32，055 24，758 45，029 25，065 36，775(b)＊16，323 30，824 24，861 30，555 48，921 38，626(c) 25，919 21，398 10，130 31，999 41，261 66，854(c) 34，326 22，050 13，235 14，226 80，314 58，094(c) 16，718 9，338 2，176 17，228 42，485 51，268(d) 24，335 31，901 20，316 26，644 22，040 85，216(d) 21，193 36，390 18，288 18，051 74，043 6，299(d) 25，381 22，066 12，126 65，963 43，838 -＊對照組動物的脾從動物身上摘除后集中處理。
實例4本實例描述用實例1化合物對人體單核細胞產生IL-2的刺激作用。
靜脈全血(加肝素，Evans10國際單位/毫升血)用RPMI以1∶1的比例稀釋。稀釋的血緩緩放入淋巴制劑中(挪威，奧斯陸，Nylgard & Co.，密度1.077克/毫升)，一份淋巴制劑加兩份稀釋血。每支試管中加3毫升淋巴制劑和6～7毫升稀釋血。將這些試管在室溫下以1600轉/分的轉速離心分離30分鐘，離心分離后，從界面部分收集單核細胞，用RPMI洗滌三次，把細胞重新懸浮于RPMI中，在血球計上用錐蟲藍計數，以測試活力，并用富RPMI配制成1×106細胞/毫升的濃度。以細胞混合物10%的體積，添加范圍從50微克/毫升到5皮克/毫升的各種濃度的實例1化合物。從每個樣品中取出每份0.2毫升置于微培養皿孔中(NUNC)(每個樣品三份)。將微培養皿在37℃培養72小時。然后，向培養物中加入3H-甲基胸苷1微居/孔(以色列核研究中心)，將細胞進一步培養過夜，用細胞收集器收集。在每毫升細胞1～10納克實例1化合物的范圍內，人體單核細胞的增殖量增加5～6倍，從而表明實例1化合物既能在單核細胞子集中誘導IL-2的產生，引起所觀察到的增殖，和/或能在一給定的群體中誘導形成受體，這也會導致增殖。
實例5這個實例說明了實例1化合物對以實驗方法在體內誘發腫瘤的影響。
0.2%甲基膽蒽(MCA，Sigma，美國)溶液的制備，是將2毫克該致癌物溶解在1.0毫升橄欖油中(參閱Petra等人，《癌癥》(Cancer)19302，1961)，在37℃連續搖動30分鐘。對6～8周齡的C3Heb小鼠的右臀部做皮下注射，劑量為0.6毫克MCA/0.3毫升溶劑/只小鼠。
21～30天后，將誘發的腫瘤切除，使其通過60目不銹鋼網，得到分離的細胞。然后再把這些細胞經皮下注射到5～8周齡的C3Heb小鼠右臀部，濃度為106細胞/0.3毫升PBS/只小鼠/25號5/8″注射針頭，以進一步誘發腫瘤的形成。
注射癌細胞5天后，誘發了可觸診的腫瘤。隨后對這些動物做如下處理a)對照組(0.2毫升40%DMSO60%PBS，在誘發的腫瘤可觸診后1天做腹膜腔內注射)。
b)對5只小鼠向腹膜腔內注射10微克實例1化合物(0.2毫升40%DMSO60%PBS，在誘發的腫瘤可觸診后三天注射第二次注射10微克化合物，溶劑量相同，在第一次注射后五天對五只小鼠中的三只進行。)13天后切除腫瘤，測量它的體積，并報告于下表中。所有動物都在最初接種后35到38天死亡。
表組 小鼠 實例1化合物給藥 腫瘤體積(13天)a＊ 1 - 4.01a＊ 2 - 3.7a＊ 3 - 3.9b 7 第3天 0.77b 8 第3天 1.66b 4 第3天和第5天 0.7b 5 第3天和第5天 0.52b 6 第3天和第5天 0.31＊對照組實例6按照實例5的步驟，對7周齡的Balb-C小鼠體內注射甲基膽蒽，誘發纖維肉瘤細胞的形成。試驗動物分成兩組。
a)對照組(0.2毫升40%DMSO60%PBS)b)10微克實例1化合物(0.2毫升40%DMSO60%PBS，以表2中表示的時間間隔注射。)
表2接種腫瘤細 注射實例1化胞后的天數 合物后的天數 %存活率a)＊24 - 100%25 - 63%34 - 55%46 - 45%60 - 35%67 - 18%69 - 0%b) 4 4 100%9 9 100%23 23 100%30 30 100%37 37 100%39139 100%41 41 100%43 43 100%46 46 80%48 48 80%50 50 80%53 53 60%60 60 40%67 - 20%68 - 0%＊對照組1、第39天標志著開始增加劑量攝生，以確定實例1化合物的毒性。(b)組的死亡率結果，直到增加劑量攝生后不久還是0%。
實例7本實例描述在體外用實例1化合物作為外在刺激劑，從小鼠脾細胞制備IL-2和CSF。
從15只6～8周齡的雄性Balb-C小鼠摘除脾臟。為了分離細胞，迫使脾細胞通過60目(美國標準)不銹鋼網，置于含PBS的5毫米培養皿中，然后將細胞收集到離心試管中，以1000轉/分的轉速旋轉10分鐘。棄去上清液，對細胞用5毫升低滲緩沖劑(0.15MNH4Cl;0.01MKHCO3溶于重蒸餾水中，PH7.2)準確處理2分鐘。然后，將PBS加到細胞中，將試管以1000轉/分的轉速離心分離10分鐘。將細胞漂洗兩次，在血球計上用錐蟲藍計數，以測試活力。把這些細胞配制成濃度為107活細胞/毫升的濃度。讓這些細胞接觸在1毫升40%DMSO60%PBS中不同數量的實例1化合物。表3列出IL-2活性的誘導作用，和用不同數量實例1化合物得到的菌落刺激因素。
表3實例1化合物IL-2(Cpm) CSF(菌落數/盤)50μg 5，000 25μg 5，000 5500ng 5，000 2550ng 6，000 755ng 15，000 120500pg 30，000 17550pg 38，000 2605pg 12，000 140
μg＝微克(10-6克)ng＝納克(10-9克)pg＝皮克(10-12克)發現注射DMSO溶劑的對照組動物有4，000～5000CPM的IL-2本底值和70～80/菌落數/盤的CSF。
實例8人體單核細胞以如上文所述的方法得到，并以106細胞/毫升富RPMI的濃度，在不同濃度的實例1化合物存在下培養72小時。收集培養物上層清液，離心分離，用50%體積的上層清液測試IL-2活性，檢定它們支持依賴IL-2的細胞系CTLD增殖的能力。表4報告了這種檢定的結果。
表4實例1化合物 每分鐘計數1微克 250100微克 28010納克 1，5001納克 11，000對照組CTLD細胞 3，500實例9本實例描述用實例2化合物刺激人體單核細胞產生IL-2。
靜脈全血(加肝素，Evans10國際單位/毫升血)用RPMI以1∶1的比例稀釋。稀釋血緩緩置于淋巴制劑Nylgard & CO.，挪威奧斯陸，密度1.077克/毫升)中，一份淋巴制劑加兩份稀釋血，每支試管中加3毫升淋巴制劑和6～7毫升稀釋血。這些試管在室溫下以1600轉/分的轉速離心分離30分鐘。離心分離后，從界面部分收集單核細胞，用RPMI洗滌三次，把這些細胞重新懸浮在RPMI中，在血球計上用錐蟲藍計數，以測試活力，并加入到富RPMI中。以細胞混合物10%的體積添加范圍從50微克/毫升到1納克/毫升的不同濃度的實例2化合物。從每個樣品取出每份0.2毫升(每個樣品三份)置于微培養皿孔中(NUNC)。將微培養皿在37℃培養72小時。然后將3H-甲基胸苷1微居/孔(以色列核研究中心)加入培養物中。細胞進一步培養過夜。用細胞收集器收集。在1～10納克實例2化合物/毫升細胞的范圍內，人體單核細胞的增殖量增加了10倍。這表明實例2化合物也能在單核細胞集中誘導IL-2的產生，引起觀察到的增殖，和/或在給定的群體中誘導受體形成，這也會導致增殖。
實例10在無菌條件下，向100毫升PBS＊溶液中加入5.0克實例1化合物。將混合物放在高頻聲波殺菌器(sonicator)中，用高頻聲波處理(sonicated)4小時。4小時后化合物溶解，得到濃度為10毫克/0.2毫升。
＊NaCl 8.0克KCl 200毫克Na2HPO41150毫克KH2PO4200毫克
CaCl2(無水) 100毫克MgCl2·6H2O 100毫克H2O 足夠配成1升實例11用實例10中的PBS100毫升溶解5.0克實例1的化合物，在電動振蕩器上振蕩4小時。在無菌條件下得到濃度為10毫克/0.2毫升的溶液。
實例12在無菌條件下，利用攪拌，將5.0克實例1化合物溶解在20毫升甘油中。然后加入80毫升PBS，形成含10毫克/0.2毫升的溶液。
已確定，實例1化合物將溶解如下在40%甘油/60%PBS中 6.0克/升在20%甘油/80%PBS中 1.3克/升在10%甘油/90%PBS中 1.0克 升實例13本實例證實口服實例1和2的化合物對誘導淋巴細胞活素的影響。
用這些化合物對6-8周齡的雄性Balb-C小鼠給藥，其給藥方式是將實例1和2的化合物置于飲用水中，對于實例1的化合物，濃度為10微克/毫升水和1微克/毫升水，而對于實例2的化合物，濃度為25微克，10微克和1微克/毫升水。配制水溶液時，將這些化合物溶于PBS中，使濃度為50微克/毫升PBS，并將得到的溶液稀釋到所希望的濃度。將這些化合物在4天周期內給藥。每天記錄準確的液體攝取量。4天后，將小鼠處死，摘除脾臟，按實例3所述那樣加工。這些細胞用含2微克/毫升的Con-A的富集RPMI配成濃度為107細胞/毫升，在37℃培養24小時。收集上清液并測試IL-2含量。
每分鐘計數化合物 微克/毫升水 攝取量/只動物 (cpm)實例1 10微克/毫升 248微克實例1 1微克/毫升 23微克 49179〔+50%〕＊實例2 25微克/毫升 406微克 44500〔+35%〕＊實例2 10微克/毫升 123微克 36815實例2 1微克/毫升 17微克 42500〔+30%〕＊對照組 32843＊與對照相比增加的百分率。
將實例1的化合物與粉末狀蔗糖充分混合，把混在25毫克粉末狀蔗糖中的10微克實例1化合物，放入每只小鼠口中。
24小時后處死這些小鼠，并按如上所述那樣處理脾臟。IL-2含量如下試驗1 cpmA 250，175〔+117%〕＊B 116，475〔+50%〕＊對照組 110，853
試驗2 cpmA 55，382〔+69%〕＊B 41，938〔+28%〕＊C 29，172〔0〕對照組 32，980＊與對照組比較時計算的增加百分率。
這個實驗表明，實例1的化合物，當以干的形式給出時或當用水稀釋劑水解時，對于誘導淋巴細胞活素產生是有特效的。
實例14二氧化碲(0.5摩爾)懸浮于250毫升1，2-乙二醇(過量)中，在低真空下，于90℃對這種混合物回流加熱16小時。得到一種白色結晶產物。將這種物質過濾分離，干燥，然后在150℃(0.25毫米Hg)升華純化，熔點(mp)為206-210℃。參閱美國化學會志(JACS)，103，2340-2347(1981)。對C4H8O4Te的分析計算C，19.2;H，3.3;O，25.07;Te，51.2。實測值C，19.91;H，3.12;O，24.98;Te，49.99。質譜(MS)m/e250。這個化合物有如下結構
實例15向在-40℃攪拌的TeCl4(0.015摩爾)和1，2-丙二醇(0.03摩爾)的四氫呋喃(70毫升)溶液中，滴加溶于30毫升四氫呋喃的三乙胺(0.06摩爾)。將三乙胺鹽酸鹽的白色沉淀過濾除去。在室溫下濃縮濾液，得到白色油狀結晶，在120℃(0.25毫米Hg)升華純化，質譜(M.S.)m/e＝204，278。
這種化合物有如下結構
實例16利用實例1的步驟，用四氯化碲和相應的二醇制備如下化合物
1，2-丙二醇質譜(M.S.)165;200;239
實例17下列化合物在體外以范圍從10微克/毫升細胞到1×10-6微克/毫升細胞混合物的各種濃度進行試驗。細胞得自6～8周齡雄性Balb/C小鼠的脾臟。將脾擠壓通過一個60目不銹鋼粗濾器，使細胞分離。用低滲緩沖劑(0.15M NH4Cl，0.001M KHCO3溶于重蒸餾水中，PH7.21)處理2分鐘，使細胞溶解。剩余的細胞漂洗兩次，配制成107細胞/毫升富集RPMI。然后，把這些細胞與試驗化合物混合，并在7.5%CO2存在下于37℃培養24小時。然后收集上層清液，利用依賴IL-2的細胞系CTLD的增殖，測試IL-2活性。這些實驗表明，在1微克/毫升細胞混合物的濃度，這些化合物大多數能對IL-2分泌產生最大影響。
化合物 脾細胞(cpm)實例1 14，600(+472%)實例14 10，300(+304%)實例2 18，000(+605%)Ph2Te(OCOCH3)2＊ 3，500Ph2TeCl2＊ 2，300Ph2Te(OCOPh)2＊ 4，300Ph2TeCl＊ 2，100PhTeCl318，000(+605%)(P-CH3OPh)2TeCl22，148實例16(a) 13，540(+435%)＊在所試驗的水平無顯著活性實例16(b) 10，650(+318%)實例16(c) 15，720(+516%)實例16(d) 18，075(+608%)TeO217，055(+508%)對照組 2，550實例18這個實例表明實例1，實例16(a)和TeO2這些化合物對誘導人體單核細胞的IL-2受體的刺激效應。
人體單核細胞(MNC)配成106細胞/毫升(RPMI+10%FCS)的溶度。將每份0.2毫升置于微培養盤的復式孔中，將盤在37℃培養24小時。然后，用RPMI對這些孔漂洗兩次，把細胞與20國際單位(I.U.)/毫升重組體IL-2重新懸浮于RPMI和10%FCS中。把這些盤進一步培養48小時，且用3H胸苷標記24小時，然后采集細胞。
用3HT攝取量衡量增殖作用，如Cillis等人(《免疫學雜志》(J.Immunol.)120，2027(1978))所述。結果用每分鐘計數表達。
試驗A(微 實例1 實例1 實例16(a) 實例16(b)TeO2克/毫升) 化合物 化合物 化合物 化合物1 28625 27593 21910 1563 10185×10-1120755 105943 145208 4667 11957×10-1164538 115195 130845 2475 21015×10-220022 5702 8752 2515 16021×10-21952 3963 9543 3108 58831×10-33652 5055 6685 2867 10931×10-43558 4047 6447 5540 11381×10-52474 4063 8177 3442 2146(a)對照組-2338(無化學品)(b)細胞加重組體IL-2(人體)促生物原1.5×10-6單位-3260(c)植物凝血素M(Difco)-195，432
試驗B 實例1 實例2 實例14TeO2(微克/毫升) 化合物 化合物 化合物1 23488 9315 3275 26205×10-166910 8688 5405 24027×10-117620 5250 4302 20005×10-25390 5538 4280 32901×10-26057 6418 3077 39281×10-35865 5167 3800 30071×10-44960 5372 2925 23271×10-57155 6397 3645 2242(a)對照組 5573(無化學品)(b)細胞加重組體IL-2(人體)生物原1.5×10-6單位-6858(c)植物凝血素M(Difco)-125，272實例19本實例表明本發明的化合物對人體單核細胞增殖的刺激效應。
人體單核細胞是通過用Ficoll/Hypaque組分使肝磷脂化的血液分層得到的。把單核細胞重新懸浮于富集的RPMI中，漂洗三次，配制成5×105細胞/毫升富集的RPMI的濃度。向細胞中添加范圍從0.005微克到5微克/細胞混合物的不同濃度的實例1化合物和實例2化合物。把每份0.2毫升的每種樣品放入微培養盤孔中(每個樣品同樣三份)。微培養盤在37℃培養72小時，然后用H3甲基-胸苷1微居/孔對它們標記，需另加24小時。然后用細胞收集器收集細胞。
實例1 實例1(微克/毫升) 化合物 化合物1 873 47005×10-118515＊33700＊1×10-12735 7085×10-23865 9101×10-23235 13621×10-32553 21801×10-43838 23871×10-53218 2442對照組 2700 2943實例1 實例1 實例16(a)(微克/毫升) 化合物化合物化合物 TeO25微克/毫升 5008 5182 4118 30281微克/毫升 6000 5600 4557 28425×10-120488＊13600＊18415＊47731×10-17037 10382＊12435＊48255×10-25520 5765 5953 58021×10-26898 5712 6000 47301×10-35800 6000 6300 61681×10-45513 6212 4587 5331對照組 3600 6117 6113 4912＊誘導增殖的濃度范圍從5×10-1到1×10-1微克。對于TeO2，在試驗的任何濃度下都發現無顯著效應。
實例2 實例2微克/毫升 化合物 化合物4557 9435×10-118415 23957＊1×10-112435 31424＊5×10-25953 55321×10-26000 29871×10-36300 15101×10-44321 23321×10-55118 2481對照組 4587 2018＊誘導增殖的濃度范圍從5×10-1到1×10-1微克。對于TeO2，在試驗的任何濃度均發現無顯著效應。
實例20用實例4的方法，對人體單核細胞測試其在用PHA誘導后或在來自正常獻血者和來自全身性紅斑狼瘡的患者的未受刺激細胞中產生IL-2的能力。IL-2含量按照實例3的方法，用依賴IL-2的細胞系CTLD測試。結果列于表5。
表5試驗對象 由實例1化合物產生IL-2PHA 5微克0.2毫升PBS 150PBS＊1100PBS＊1200PBS＊正常獻血者1 - 2.3＊＊43.6 38.4 30.1+ 36.4 48.2 46.2 38.6
2 - 2.1 52.2 50.3 47.1+ 30.4 38.9 54.2 49.83 - 2.1 50.8 46.1 31.3+ 38.9 53.5 44.8 38.3全身性紅斑狼瘡患者1 - 2.0 37.3 32.1 26.1+ 6.3 24.2 19.7 15.42 - 2.4 43.6 35.1 30.3+ 8.2 28.1 24.0 18.63 - 2.4 19.2 18.1 14.4+ 4.1 23.8 20.2 16.8＊1份0.2毫升含5微克實例1化合物的PBS，用50，100或200份PBS稀釋。＊＊在像實例3中那樣的上層清液(1∶2稀釋)存在下，5×104CTLD細胞的3H胸苷的CPM×10-3。
實例21這個實例提供一種檢定法，以檢測IL-2受體部位的存在。人體單核細胞在實例1化合物和TeO2存在下培養24小時。這些細胞用PBS洗滌兩次，然后按照Uchiyama等人描述的方法〔《免疫學雜志》(J.Immunol.)126，1398(1981)〕，用抗IL-2受體的特種熒光素的抗體培養。結果是在對照組中，2%細胞是陽性的;在PHA存在下，80%細胞是陽性的，而用1微克/毫升實例1的化合物，發現20%細胞是陽性的。已發現，TeO2在1微克/毫升的水平產生5%陽性細胞。
實例22已確定了實例1化合物對西尼日病毒(WNV)感染的影響。西尼日病毒是黃病毒群中的一種toga病毒，是一種正單股鏈的RNA病毒，當對小鼠做腹膜腔內注射時，由于對中樞神經系統的廣泛損壞，經常在5～8天內將其殺死。對于本研究，給ICR小鼠(3周齡)以103或104LD50單位/只小鼠的濃度向腹膜腔內注射這種病毒。在-1天(病毒注射前一天)和病毒注射后6天進行10微克/0.2毫升PBS/只小鼠的實例1化合物注射。表A列出一次這樣的實驗的初步結果。可以看出，在8天后，只注射病毒的動物全部死亡，而接受用實例1化合物處理的五只動物中，有三只還活著。
表A處理 103LD50103LD50104LD50104LD50O注射實例 否 是 否 是 是1化合物存活數/動物總數 0/6 3/5 0/6 3/5 6/6在第二次實驗中，對小鼠用103LD50病毒向腹膜腔內注射，并在-1，1，2和4天注射實例1化合物(1微克/0.2毫升PBS/只小鼠)。一次這樣的實驗在注射后第8天的初步結果列于表B。可以看到，在第8天，只注射病毒的動物全部死亡，而接受實例1化合物的五只動物中有三只還活著。在剩下的三只中有兩只又存活了8天，而第三只則仍然活著，未表現出任何臨床癥狀。
表B處理 腹膜腔內注射 腹膜腔內注射 實例1化合物103LD50103LD50+實例1化合物存活數/總數 0/8 3/5 5/5實例23本實例表明，西尼日病毒同ICR小鼠巨噬細胞的培養物相互作用造成產生性(productive)感染。不同數量的實例1化合物(5微克，1微克，0.1微克)用小鼠巨噬細胞單層培養24小時。24小時后，用5微克實例1化合物培養的巨噬細胞死亡，而其它的則仍未受影響。然后將所有培養物用104PFU/盤(Plate)感染。培養72小時后，收集上層清液，對病毒做Vera細胞滴定。表A列出一次這樣的實驗的初步結果。可以看到，巨噬細胞培養物用1微克實例1化合物培養，導致病毒產率降低40倍，而用0.1微克實例1化合物/盤(plate)培養，導致病毒產率降低十倍。
表A處理 病毒產率(PFU/毫升)對照組(只有病毒) 2×104/毫升實例1化合物，1微克/盤 5×102/毫升實例1化合物，0.1微克/盤 2×103/毫升
權利要求
1.具有如下化學式的化合物的制備工藝，其特征在于
其中Q是Te或Se；t是1或0，u是1或0，v是1或0；R，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8和R9是相同的或不同的，而且可獨立選自下列基團氫，1至5個碳原子的羥烷基，羥基，1至5個碳原子的烷基，鹵素，1至5個碳原子的鹵代烷基，羧基，2至10個碳原子的烷基羰基烷基，1至5個碳原子的烷酰氧基，1至5個碳原子的羧烷基，酰基，酰胺基，氰基，1至5個碳原子的酰胺基烷基，2至10個碳原子的N-單烷基酰胺基烷基，4至10個碳原子的N，N-二烷基酰胺基烷基，1至5個碳原子的氰基烷基，1至5個碳原子的烷氧基，2至10個碳原子的烷氧基烷基和-COR10，其中R10是1至5個碳原子的烷基；X是鹵素，所說的工藝包括(a)制備四鹵化碲或四鹵化硒與具有如下化學式的至少有兩個羥基的化合物的混合物
其中R，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8和R9，與上文所述相同；(b)使四鹵化碲或四鹵化硒在乙腈存在下與至少有兩個羥基的化合物反應；(c)然后回收產物。
2.權利要求
1所定義的工藝，其中，所得到的至少有兩個羥基的化合物是乙二醇。
3.權利要求
1所定義的工藝，其中，所得到的至少有兩個羥基的化合物是1，2-丙二醇。
4.權利要求
1所定義的工藝，其中，所得到的至少有兩個羥基的化合物是2，3-丁二醇。
5.權利要求
1所定義的工藝，其中，所得到的至少有兩個羥基的化合物是1，3-丙二醇。
6.權利要求
1所定義的工藝，其中，所得到的至少有兩個羥基的化合物是1，4-丁二醇。
7.產生權利要求
1化合物水溶液的工藝，其中，把該化合物放入水載體中，進行足夠長時間的超聲或機械攪拌，以使化合物溶解。
專利摘要
已發現，某些碲化合物具有刺激在體內和體外產生細胞分裂素及其受體的能力。這些化合物可以用于治療某些腫瘤，自身免疫疾病，免疫病和傳染病。
文檔編號A61K31/66GK86101696SQ86101696
公開日1986年12月24日 申請日期1986年3月15日
發明者邁克爾·阿爾貝克, 本杰明·斯雷德尼 申請人:科學診斷公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan