專利名稱:制造犬細小病毒疫苗的方法
本發明涉及一種新的犬細小病毒疫苗，一種制備該疫苗的方法，一種新的犬細小病毒株，以及一種使犬免受犬細小病毒感染的方法。
犬特別是年青犬受到犬細小病毒(CPV)的感染，常常導致以急性腹瀉、發熱、白細胞減少(相對地淋巴細胞減少)為特征的腸道疾病。
雖曾研究出一種防止犬受CPV感染的痰苗。然而，當存在母體獲得性抗體(MDA)時給予這些疫苗常常是無效的。對某些幼犬，這種被動免疫可能以足以妨礙疫苗接種的水平，持續相當長的時間(四個月或更長)。其后，隨著MDA水平的降低，狗可能不足以對抗感染和疾病的侵襲，而仍難于接種成功。因此，在這些幼犬的生命早期的相當長時期內，仍不能得以保護;特別是在由母體獲得的免疫性消失之后，整個一窩仔犬受感染的危險就顯現出來了。
為此，很需要有一種對幼犬生命早期能夠進行成功免疫的CPV疫苗。
本發明的目的即是制備這樣一種疫苗的方法。
依據本發明而制得的疫苗，其特征在于它包含得自一種CPV病毒株(內部編號為154)的病毒。這種病毒株的樣品已寄存在法國巴黎巴士德研究院的國家微生物培養物保藏中心(Colleetion Nationale de Cultures de Mieroorganisms)，寄存號為1-404。
依據本發明的疫苗，最好含有活的減毒CPV病毒株。
減毒是通過在細胞的培養物中經一系列傳代完成的，所用的細胞取自犬或貓科動物，傳代于大約37℃下進行。每一步都是由上次培養步驟的培養物中收取病毒，之后接種到含有新鮮細胞培養物的培養基中。培養所使用的細胞是按本領域內已知的方法制備的。
為制備該疫苗，可將減毒的種株病毒培養在一細胞培養物中，如一種貓科動物的胚胎纖維母細胞(FEF)培養物。所用的培養溫度最好是犬的正常體溫。收集組織細胞培養液和/或細胞，以收獲經培養的病毒。為了提高病毒收獲率，可以使用某種提高由培養基質中釋放出的傳染顆粒的技術，如用超聲處理。可將疫苗制成懸浮液形成或凍干品。對于凍干的CPV疫苗，最好向其中加入一種或多種穩定劑。適用的穩定劑如SPGA(詳見Bovarnick(1950)J.Bacteriology 59，509)醣類(如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡聚糖、葡萄糖)、蛋白質(如白蛋白或酪蛋白)，或是其降解產物、含蛋白制劑(如小牛血清或脫脂奶)以及緩沖液(如堿金屬磷酸鹽)。必要時亦可加入一種或多種具有佐劑作用的化合物。適用的佐劑如氫氧化鋁、磷酸鹽或氧化物、礦物油(如BayolF，Marcol 52)以及皂角苷。
另外，依據本發明的疫苗亦可含有滅活的CPV病毒株。
依據本發明滅活的CPV疫苗，是由經處理失去了復制能力和毒力的病毒制得的。一般地，這可以通過化學或物理的方法達到。化學滅活，如可以用酶，甲醛、β-丙內酯或吖丙啶或其衍生物、某種有機溶劑(如鹵化烴)和/或去污劑(如吐溫、Triton X、脫氧膽酸鈉、磺基三甲銨乙內酯或十六烷基三甲基銨鹽)處理病毒來完成。物理滅活，可通過用高能射線對病毒進行照射來完成，如可使用紫外光，r射線或x射線。必要時，處理后可將滅活劑中和掉，例如可用硫代硫酸鹽來中和甲醛滅活制劑。如有必要，繼后亦可將PH值調回大約PH7。一般地，可向滅活病毒制品中加入某種佐劑，并且可加入一種或幾種乳化劑(如吐溫和斯潘(TWeen和Span))。
依據下列特征，將該病毒株154鑒定為犬細小病毒(ⅰ)在貓科或犬科動物細胞內有繁殖能力。
(ⅱ)不能在沒有分裂能力的貓科和犬科動物細胞中繁殖。
(ⅲ)細胞培養物中所產生的血凝素在PH7.2時可使豬紅細胞凝集，但不能使人類或嚙齒動物的紅細胞凝集。
(ⅳ)在細胞培養物中產生典型的核內含體。
(ⅴ)它可被制備的貓和兔的抗貓傳染性粒細胞缺乏癥(貓瘟)病毒和已知的犬細小病毒抗血清所中和。
(ⅵ)血凝作用可被抗貓傳染性粒細胞缺乏癥(貓瘟)病毒和已知的犬細小病毒抗血清所抑制。
此外，根據下列特性可將該新的CPV病毒株同迄今已知的CPV病毒株進一步區分開a.它能夠于37℃，在貓和犬的纖維母細胞樣細胞中生長繁殖良好，并表現出特征性的細胞病理效力。將依據本發明的病毒株與已知的CPV病毒株相比較，總結出其生長特征，如下面表1所示表Ⅰ
不同的CPV病毒株在不同的細胞培養系統中生長繁殖的能力所使用的細胞培養物 A72 FEF CRFKCPV病毒株Boostervac(C-Vet) - ++++ +++Enduracell(Smith-kline) + - +Nobivac P、C. ++++ ++ +++野生型 +++ +++ +++說明A72＝Binn氏犬纖維母細胞系FEF＝貓胚胎纖維母細胞系CRFK＝克蘭達爾貓腎細胞系++++＝于第一代即有廣泛的細胞病理效力(CPE)和血凝作用(HA)+++＝于第一代有輕度CPE
++＝到第二代時表現CPE和HA+＝第二代后產生CPE-＝反復傳代后亦未見CPE和HAb.于上述的細胞系中培養時，在瓊脂下面產生大的、清晰的噬斑。
根據上述資料，可以得出CPV病毒株154代表了一株新的病毒株的結論。
病毒株154是由表現有CPV感染癥狀的幼犬的糞便中得到的。但也可由病毒感染幼犬或成年犬的腸道、胸腺或其它淋巴樣組織、骨髓、血液或肝組織中分離。可用緩沖鹽水或細胞培養基純化并稀釋分離的樣品材料，之后接種于狗或貓的分裂活躍的細胞上。
與含有已知病毒株的疫苗相反，依據本發明的疫苗，對于大部分6周令的幼犬，以及事實上100%的9-12周令的幼犬是有效的，這種新的CPV病毒能夠使接種了疫苗的幼小犬打破事實上存在的來自母體抗體的對抗性，而不引起CPV感染的癥狀。
12周時，母體抗體滴度通常降低到1∶32以下，且在12周時母體抗體水平很少超過1∶32。幾乎100%的滴度水平為1∶32的動物，均能對依據本發明之疫苗的予防接種產生反應，甚至滴度水平為1∶64的大部分幼犬也能產生反應。
使用活的減毒疫苗，推薦的劑量為每只幼犬103TCID50以上，但對于有MDA的幼犬，最好每只動物至少給106TCID50。
這些疫苗可經非腸道途徑(即注射)或腸道途徑(即口服)給藥。
本發明的疫苗還包括除上述CPV疫苗病毒以外的聯合疫苗，其至少包含下列犬疫苗病毒之一種犬溫熱病毒、犬傳染性肝炎病毒(CAV1和CAV2)、狂犬病病毒、副流感病毒、犬冠狀病毒、麻疹病毒，和/或感染性鉤端螺旋體病病菌及博代桿菌(Bordetella)。
為了試驗傳播期間CPV的病源性、免疫源性和有無毒力增強，將CPV相繼傳給7只犬。在這項研究中使用了18只幼犬，在接觸時所有的均沒有抗體。整個觀察期間所有幼犬的存活，并證明了有抗體反應。白細胞計數在正常范圍之內。
為了證明使用本發明之疫苗進行疫苗接種所產生的保護效果，四只疫苗接種6周顯示有抗體反應的幼犬，同兩只未作疫苗接種的對照犬，接觸有毒力的CPV病毒株。結果未作疫苗接種的犬出現了有CPV感染特征的臨床征象，而作過疫苗接種的幼犬則沒有出現這種征象。
實施例1病毒的分離和傳代用拭子采取有細小病毒感染的臨床病例的直腸內標本，之后由其上分離病毒。該感染犬系狗窩內喂養的8周令比哥獵犬幼犬。
將病毒接種到FEF細胞培養物中，并在這些細胞中進一步傳代，之后轉移到犬A72細胞系培養物內〔Binn、MarchWicki & Stephenson A.M.J.V.R..41卷，855-860頁(1981)〕。病毒在細胞培養物中的所有傳代均于37℃進行。
在該細胞系中對病毒進行相繼41次傳代以減毒，在傳代過程中，分別于第4、第7、第10和第40代完成4次克隆步驟。每次都收集到一個大而清晰的弧立的噬斑。
之后將存在于A72細胞(POOL182)中的第41代病毒重新接種FEF培養物中，收獲在FEF(POOL182)細胞中的第二代病毒，以其作為“主體種子”堆鋪層，并定名為POOL190。
實施例2活疫苗的制備A.由按照實施例1方法得到的主體種子病毒堆制備初級和二級工作種子病毒堆。這些病毒是由A72細胞系轉染后的4和5次FEF細胞培養物傳代。將FEF細胞培養物用工作種子病毒感染，以接種。孵育該培養物，直到病毒的細胞病理效應達到適當的程度。此時收獲細胞培養的培養基并于-70℃儲存。
B.分析收獲物樣品的病毒滴度并試驗其有無細菌混染。已知其病毒滴度后，將其與穩定劑混合，達到在制成的混合物中含5.5%山梨醇和5.5% NZ胺(一種酪蛋白的胰酶消化產物)。之后將該混合物裝入中性玻璃瓶(體積為1.0毫升)中，再予以凍干并于真空下封口。
實施例3對尚存在母體抗體的幼犬的疫苗接種取135只經用血凝抑制方法證明其體內含有不同水平母體來源之抗體(MDV)的幼犬，每只均給予CPA劑量為107.4TCID50的疫苗。其中124只是6周令時作疫苗接種，其余的11只是在9周令時接種。小部分6周令的幼犬沒有對疫苗接種產生血清學反應，對這些動物在其8-9周令的再次接種，且在所有這些疫苗接種條件下，動物均表現了及時的血清轉化反應。
表2和表3中顯示對這些結果的總結。
表2一次疫苗接種之幼犬的血清學反應6周時 幼犬的 所試驗 6周時 6周時 9周 9周時MDA的 數目 的幼犬 作疫苗 疫苗接 時作 疫苗接滴度 占總數 接種的 種后出 疫苗 種后出的百分 數目 現血清學 接種 現血清比(%) 反應數 的數 學反應目(%) 目 數目%20 16 12 12 10 83 4 4 10020 18 13 16 15 94 2 2 10040 51 38 50 44 88 1 1 10080 39 29 37 26 70 2 2 100160 11 8 9 7 78 2 2 100
135 124 102 82 11 11 100(平均) (平均)表36周令時疫苗接種沒有出現反應的幼犬于8-9周時再次疫苗接種的血清學反應6周時的 8-9周時再次 血清學反應MDA滴 疫苗接種的幼 數目 %度 犬數20 2 2 10020 1 1 10040 6 6 10080 11 11 100160 2 2 10022 22 100
實施例4存在有可測到的母體得到之抗體時，用其它疫苗進行接種之效力的比較通過兩次分別進行的實驗，對三種不同的疫苗的效力進行了比較。
第一組實驗是用Smith-Klines氏活減毒CPV疫苗(SK-CPV)或Intervet貓細小病毒疫苗(FLV)對比哥獵犬群體中的青年犬進行疫苗接種。
第二組實驗是用依據本發明的活的CPV疫苗(Int-CPV)或Intervet貓細小病毒疫苗(FLV)對比哥獵犬群體中的幼犬進行疫苗接種。
幼犬從其4-8周令開始每周進行疫苗接種。所有幼犬均由其母體獲得了母體抗體。
實驗結果如表4所示。
表4第一組實驗 第二組實驗SK-CPV FLV Int-CPV FLV處理的仔犬窩數 27 38 16 16生存的幼犬數 156 212 108 91斷奶并疫苗接種的 136 194 99 84幼犬數因CPV感染致斷奶后死亡數 15 21 4 11因CPV感染致死的%數 11.0 10.8 4 13.1患病幼犬治療后恢復數， 24 35 2 18顯示臨床CPV病征的總的%數 28.7 28.9 6 34.5由此可以得出結論用根據本發明的疫苗對幼犬進行免疫，其對抗致命的CPV病的作用遠優于用已知疫苗所得到的防護。
實施例5滅活疫苗的制備將按照實施例2的方法制得的細胞培養基(每毫升滴度為10/8 tcid/50)于37℃培養2小時，此期間用濃度為0.1%的β-丙內酯處理。
逐滴加入1N NaOH間斷將大部分流體中和。如需要調節pH時，可用加在培養介質中的酚紅作指示劑。
最后將作為佐劑的磷酸鋁同該混合物相混合，達到終濃度為0.3%。
實施例6母體免疫的幼犬12周令時疫苗接種的反應用依據實施例2的方法制備的活疫苗，或者用基于貓病毒的異型疫苗，免疫顯示有很高母體抗體滴度的兩組幼犬。
用血凝抑制滴定法檢測母體抗體。
各組動物均給于三個不同劑量的疫苗，每組包括9只幼犬。
結果如表5所示。
表5組ⅠNobivac PC劑量/幼犬 犬號 接種時MDA 反應(tcid/50) (HI滴度)10/6 1 16 無2 32 無3 16 有4 16 有10/7 5 8 有6 32 有
7 16 有10/8 8 32 有9 32 有組Ⅱ貓細小病毒10 16 無10/6 11 16 無12 8 無13 16 無10/7 14 8 無15 16 無16 8 無10/8 17 4 無18 8 無
權利要求
1.犬細小病毒株154。
2.根據權利要求
1所述病毒株，它貯存在武漢大學內的中國典型培養物貯存中心，貯存號為CCTCC-V86001。
3.制備犬細小病毒疫苗的方法，其特征在于將犬細小病毒株154接種到犬或貓科動物細胞中，經數代培養減毒，再在FEF細胞中培養收集病毒，再加一種或多種藥物學允許的穩定劑或(和)其他佐劑制成。
4.根據權利要求
3的方法，其特征在于犬細小病毒株在FEF細胞中傳41代減毒，在FEF中培養溫度為犬正常體溫。
5.根據權利要求
3或4的方法，其特征在于所加穩定劑為糖類，蛋白質或是其降解物，含蛋白制劑以及緩沖液。
6.根據權利要求
3或4的方法，其特征在于其病毒株是貯存在武漢大學內的中國典型培養物貯存中心的犬細小病毒株154，貯存號為CCTCC-V86001。
7.制備聯合疫苗的方法，其特征在于它除含用權利要求
2方法制得的疫苗病毒外，還至少含有下列疫苗病毒中的一種犬熱病病毒、傳染性犬肝炎病毒(CAV-1和CAV-2)，狂犬病病毒、付流感病毒、犬冠狀病毒、麻疹病毒和/或致病菌-釣端螺旋體和博代桿菌。
專利摘要
本發明涉及一種制造包含新犬細小病毒株疫苗的方法，該疫苗能突破9-12周齡幼犬中保持的從母體衍生的抗體水平，甚至可以在有母體衍生抗體存在下免疫大多數6周齡的幼犬。
文檔編號A61P31/12GK86100726SQ86100726
公開日1986年10月1日 申請日期1986年1月29日
發明者吉爾·威爾施 申請人:阿克佐公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan