專利名稱:可被生物降介的襯質和生產它的方法
本發明涉及可被生物降介的襯質，特別涉及到多功能膠原基礎襯質和/或它的載體。
將藥物，生長因子，激素，多肽及糖肽投送至外傷上傳統方法為直接局部應用，內傷上為注射于血液中或通過消化系統吸收至血液中。控制這些因子的釋放，可將其在大量或微量水平上用合成多聚物包裝在膠囊中，如硅酮;或用天然多聚物，如明膠和纖維素。用特殊選擇的多聚系統控制擴散速率〔蘭格，R.S.和比拍司，N.A，生物材料2.201，1981.(Longer，R.S.and Peppbs，N.A.，Biomaterials 2.201，1981)〕，釋放速率可控制到一年的時間。天然多聚物如明膠或纖維素可在幾分鐘到數小時內緩慢溶解，而硅酮在數月至數年期間仍可保持完整。由于僅需要一次外科處理，可被生物降介的多聚物具有可控制的釋放到內部傷面的優點。
膠原是可被生物降介的在動物和人體中存在的多聚物，曾被用為血漿容積擴張劑，投藥運載工具，玻璃體代用物，止血劑，縫合材料，角膜代用物，血液透析膜，傷口敷料及人造皮膚，疝修補，人造脈管，陰道內避孕用具以及組織增加物的可注射因子。(齊瓦比里等，“結締組織研究國際綜述”6，1，1973;齊瓦比里“膠原生物學”，A·維的克和J·吳司特主編，科學院印刷，第22章，1980)(Ckvapil等;Tnt.Review of Connective Tissue Rescarch 6.1，1973;Chvapil，in Biology of Callageneditecl by A.Viidik ang J Vaust，Acagemic Press;Chapter 22，1980)。上述應用中的大多數情況，膠原須經重建并交聯成不溶的形式。
延納司等(Yanas it al)人介紹(美國專利4，06，081)(U.S.Patent 4，060，081)，應用膠原及粘多糖為人造皮膚。這些材料用戊二醛交聯，戊二醛為雙功能交聯劑，可與自由胺類反應。在許多實用中，應用交聯膠原的一個主要缺點是用于制備交聯和不溶性膠原的共同試劑游離戊二醛具有有害的生物學作用。自交聯膠原中漏出的戊二醛表明對細胞有毒性作用，特別是對成纖維細胞(司比爾等，生物醫學材料研究雜志14，753，1980;柯克等，“英國實驗病理學雜志”64，172，1983(Speer et al，J.Biomegjcal Mbterials Research 14，753，1980;Coohe et al;British J.Exp.Pafh.64，172，1983)。最新的證據指出戊二醛多聚物，而不是單體戊二醛，在膠原分子間形成交聯;交聯可再重排而釋放游離戊二醛和戊二醛多聚物(瓊，D·T和尼姆尼，M·D;結締組織研究10，187-217，1982)(Cheung，D.T.ang Nimni，M.D，Connective Tissue Research 10，187-217，1982)本發明的目的之一是提供新的可被生物降介的襯質。
另一目的是提供新的基礎膠原襯質。
另一目的是提供海綿狀或頁狀新的基礎膠原襯質。
再一目的是提供浸有載體復合物的新的可被生物降介的襯質。
還有一目的是提供浸有運載復合物的新的可被生物降介的基礎膠原襯質。
另一目的是提供以海綿或紙頁形式浸有載體復合物的新的可被生物降介的基礎膠原襯質。
進一步的目的是提供浸有載體復合物的新的可被生物降介的基礎膠原襯質，并且它是無毒的并能促進細胞生長。
再一目的是提供可控制藥物釋放的浸有載體復合物的新的可被生物降介的基礎膠原襯質。
再一目的是提供為外傷局部應用的浸有載體復合物新的可被生物降介的基礎膠原襯質。
再一目的是提供為內傷應用的浸有載體復合物新的可被生物降介的基礎膠原襯質。
本發明是通過形成海綿或紙頁形基礎膠原襯質來實現這一目的。包括自一組包含有Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型膠原中選擇膠原、海綿或紙頁型膠原與交聯劑接觸，交聯劑自一組包含有碳化二亞胺或琥珀亞胺基活性酯中選擇，形成膠原-基礎襯質中間物，再經嚴格脫水，形成海綿形或紙頁形基礎膠原襯質。另一具體實施為，海綿狀或紙頁狀基礎膠原材料先經嚴格脫水，形成的中間物再與碳化二亞胺交聯合物接觸，形成海綿或紙頁形膠原基礎襯質。本發明的另一實施是，將交聯劑在海綿狀或紙頁狀基礎膠原中間物形成之前，與基礎膠原材料混合，再經嚴格脫水的加工步驟。本發明特別推薦的形式是形成浸有載體復合物的海綿狀或紙頁狀基礎膠原襯質的過程中，摻合載體復合物，載體復合物是自下列一組化合物中選擇的Ⅳ型Ⅴ型膠原，纖維結合素，昆布氨酸透明質酸鹽，蛋白多糖，表皮生長因子，血小板衍生的生長因子，血管發生因子，抗菌素，抗真菌因子殺精子劑，酶及酶的抑制劑。
本發明的基礎膠原載體體系，基于利用可溶性或不溶性膠原為原材料，這些膠原是從一組含有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原及其混合物中選出的。
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原的可溶性膠原部分是從含這些膠原豐富的組織中經部分酶降介制備并形成基礎膠原溶液(如，可溶性膠原溶于適當溶劑中如鹽酸、稀醋酸或相似物)
不溶性膠原從下列有代表性的來源中得到Ⅰ型膠原牛、雞和魚皮膚，牛和雞肌腱，包括胎兒組織的牛和雞骨骼;Ⅱ型膠原牛關節軟骨，鼻中隔，胸骨軟骨;Ⅲ型膠原牛和人的表皮及皮膚。
本發明中的一個實施是把在適當液體(如稀鹽酸，稀醋酸或類似物)中懸浮或溶脹的基礎膠原液或不溶性膠原放于大約0℃到-100℃之間。使基礎膠原材料固化，此后，固化的基礎膠原材料置于50毫乇(Millitorr)在22℃到-100℃下減壓，形成基礎膠原海綿，再按下文詳述的方法進一步加工，通常，可溶或不溶膠原對溶劑或懸浮劑的重量比，分別從1到10，000或從1到15，用于形成基礎膠原溶液或懸浮液。
另一實施是這個基礎膠原溶液或基礎膠原懸浮液在如下較詳盡敘述的進一步加工程序之前干燥為紙頁形。在4℃到40℃，2到48小時之間干燥是有效的。
本發明另一實施是形成基礎膠原襯質。基礎膠原海綿或紙頁首先與自一組包括碳化二亞胺或N-羥基琥珀亞胺衍生的活性酯(琥珀亞胺活性酯)選擇出的交聯劑接觸，再嚴格脫水，形成基礎膠原襯質。
碳化二亞胺衍生物，例如氨基氰和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽。
雙功能琥珀亞胺活性酯衍生物，例如，雙功能N-羥基琥珀亞胺，3，3′-二硫(磺基琥珀亞胺基)丙酸酯和雙(磺基琥珀亞胺基)辛二酸酯，當應用碳化二亞胺交聯劑時，基礎膠原海綿或紙頁浸入碳化二亞胺溶液中，濃度自大約0.1到10%(重量/體積，W/V)，溫度保持在大約2℃到40℃，氫離子濃度(PH)在2到11之間，大約反應2到96小時。當應用琥珀亞胺活性酯交聯劑時，基礎膠原海綿或紙頁浸入上述溶液，濃度自大約0.1到15.0%(重量/體積W/V)，溫度保持在大約2℃到40℃，反應大約2到96小時。基礎膠原海綿或紙頁置于含有0.1到大約15%(重量/體積W/V)的N-羥基琥珀亞胺和碳化二亞胺溶液中，氫離子濃度(PH)在2到11之間，反應2到96小時，溫度2℃到40℃，這樣處理的基礎膠原襯質中間物經徹底洗滌，以除去過多的交聯劑。
基礎膠原的中間物嚴格脫水條件，溫度自50到200℃，真空度50毫乇或以下，時間2到96小時，直至形成基礎膠原襯質。在嚴格脫水之前，海綿狀基礎膠原襯質中間物需先在大約0℃到-100℃間固化，然后減壓到至少50毫乇，在22℃-100℃之間進行。
本發明的另一實施是利用碳化二亞胺交聯劑形成基礎膠原襯質時，嚴格脫水對用以上的交聯劑縮合為基礎膠原襯質的中間物之前形成基礎膠原襯質中間物。
本發明的另一實施是交聯劑在干燥或冰凍干燥步驟開始前與膠原一基礎材料混合。
按照本發明制備的基礎膠原襯質，可被認為是“類珊瑚”狀或“支架”結構，具有孔度為3到100微米(m)的孔隙，分子量自10×106至50×106以上，通過共價鍵形成的交聯度自1，000到100，000。
本發明的另一實施是把載體復合物摻合到基礎膠原襯質中。載體復合物是從一組包括有Ⅳ、Ⅴ型膠原，纖維結合素，昆布氨酸，透明質酸鹽，蛋白多糖，表皮生長因子，血小板衍生的生長因子，血管發生因子，抗菌素，抗真菌因子，殺精子劑，激素，酶和酶的抑制劑中選擇的。
一般地說來，載體復合物可在基礎膠原材料加工成海綿狀或紙頁狀基礎膠原襯質的過程中，隨時可以加入的，本文推薦載體復合物在形成基礎膠原襯質中間物可溶性或不溶的膠原過程固化之前摻合;或在嚴格脫水之前，基礎膠原襯質中間物固化之前摻合。載體材料加入量基于可溶性與不溶膠原的重量的1%到30%(重量/重量)。一般地，結締組織因子，如纖維結合素，Ⅳ、Ⅴ型膠原，昆布氨酸，氨基多糖和透明質酸鹽在形成膠原基礎海綿的開始加工步驟中摻合，或在基礎膠原襯質中間物交聯以后摻合;最好在形成基礎膠原襯質中間物形成過程中摻合纖維結合素及透明質酸鹽。
摻合到基礎膠原襯質的各式各樣載體復合物有許多來源。本發明的實施中的Ⅳ型、Ⅴ型膠原，發現分別與組織中基底膜及平滑肌細胞相關聯。Ⅳ型代表性的來源，包括EHS小鼠肉瘤，牛及人胎盤，眼水晶體膜，腎臟;Ⅴ型膠原來源有胎盤膜，眼組織和胎兒皮膚(見實例，垂司特得，“細胞外間質的免疫化學”卷1，H福斯美主編，CRC印刷，第二章1982年)(Trelstad In Immunochemistry g the Extracellular Matrix vol1 edited by H Furthmayr CRC Press Chapter 2，1982)。
蛋白多糖代表性的來源包括牛及人軟骨及滑液，鼻中隔和胸骨軟骨和皮膚，糖蛋白的典型來源包括EHS腫瘤，牛及人腎臟，軟骨，骨骼，胎盤以及牛及人血液。透明質酸鹽的典型來源包括雞冠及牛玻璃體。
用于基礎膠原襯質的最佳載體化合物包括纖維結合素，昆布氨酸，Ⅳ型膠原和透明質酸鹽和蛋白多糖。與暴露傷面接觸的基礎膠原襯質需有溶脹比值在2.5到5之間，皮下植入用的有載體復合物的基礎膠原襯質，其溶脹比值2.5到10之間是有用的。溶脹比的定義為單位體積的基礎膠原襯質所吸收水的體積。
在內傷及短期內藥物釋放的情況下，帶有載體化合物的基礎膠原襯質，做成紙頁形或管形放在直接與組織接觸的部位。
可被生物降介的速率及釋放速率可由改變交聯度來調節。在實用中，希望長時間釋放時，可被生物降介的多聚物的無孔擴散層如多聚-3-(羥基丁酸鹽)放在基礎膠原襯質的兩側。用于全厚度傷面的物質，如在前面所提到的給延納司美國專利信件所述，用一個擴散控制層來阻止水或其它小的揮發性分子自基礎膠原襯質擴散;擴散控制層必須緊粘到基礎膠原襯質層上。基礎膠原襯質層和擴散控制層的結合必須強到能縫合在一起，并需每平方英吋至少有100磅的張力強度，并在失效前能至少變形10%，合成的，不能被生物降介的多聚物如硅酮多聚物(硅橡膠醫用級粘合劑)或可被生物降介的多聚物，如多聚乳酸，多聚乙醇酸，多聚3-(羥丁酸鹽)和這些物質的共聚物可用為擴散控制層。
硅酮多聚物最好用于控制小分子擴散速率的材料，在擴散控制層粘合劑的治療作用可完成而不會弄濕在室溫干燥的基礎膠原襯質上的載體化合物。
0.5到1.5毫米厚的薄膜用于襯質層，可允許在14英吋汞柱的真空度及室溫下治療至少2小時。
基礎膠原襯質的厚度可從1毫米變化到幾百毫米，對全厚度傷口，需要用2到3毫米厚度，并要使在基礎膠原襯質上的載體化合物與傷面緊密接觸。
當皮下移植或直接用于全厚度皮膚傷口時，本發明的任何基礎膠原襯質不會刺激產生炎癥。另外，慢性植入可使成纖維細胞和內皮細胞移動至基礎膠原襯質上。基礎膠原襯質的降介及重吸收速率用體外分析法，測定1mg材料對抗100單位細菌膠原酶溶介的時間，1單位膠原酶于37℃下，保溫5小時，釋放的膠原氨基酸相當于1微克分子L-亮氨酸。琥珀亞氨基活性酯的生成和嚴格脫水相結合，或碳化二亞胺處理和嚴格脫水相結合，可明顯增加對抗膠原酶的時間，并超過了以前所用的任何方法。這些研究指出本發明的交聯方法可抗膠原酶降介，并且不刺激炎癥發生。
下列實例說明本發明實驗過程中的條件，應了解。但發明的范圍不限于此。
例 1可溶性及不溶性膠原的制備所用的膠原來自肉芽層與真皮及表皮分離后的小牛皮革。真皮切成小塊，洗凈，溶脹，冰凍干燥并貯存于-20攝氏度。
可溶性膠原是通過下列方法得到把250克冰凍干燥不溶的膠原放于1.5升鹽酸(HCl)，氫離子濃度(PH)2.5及1.5克結晶胃蛋白酶(西格馬化學公司Sigma)混合物于4℃攪拌過夜，然后連續經過干酪包布，4號華特曼濾紙，華特曼42號濾紙，格爾曼5微米和1.2微米濾膜過濾，最后經過0.65微米及0.45微米微孔濾膜過濾。經一系列過濾得到的可溶部分含有Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型膠原。可溶性膠原部分對含50毫克分子濃度三羥甲基氨基甲烷(Trls)的1.0克分子濃度(M)氯化鈉(Nacl)透析，透析液的氫離子濃度調到7.5(PH7.5)。然后加入固體氯化鈉使克分子濃度增至1.7，在1.7克分子濃度氯化鈉沉淀的是Ⅲ型膠原。把它于10，000×重力加速度(g)離心60分鐘收集，再對0.005克分子濃度乙酸透析，冰凍干燥，并貯存于-20℃。上清液中再加入氯化鈉至2.5克分子濃度，離心，沉淀，(Ⅰ型膠原)對0.005克分子濃度乙酸透析，冰凍干燥，-20攝氏度保存。剩余的上清液含Ⅴ型膠原，并對0.005克分子濃度乙酸透析，冰凍干燥，-20攝氏度保存。
不溶性膠原溶液得自冰凍干燥的真皮，用魏
研磨器(Wiley Mill)在鹽酸中，氫離子濃度2.5時研磨成懸液。溶脹的膠原對0.005克分子濃度乙酸透析，并冰凍干燥，如果用熟牛革為真皮的來源，則產生的不溶性膠原是典型的Ⅰ型。
可溶性Ⅳ型膠原自小鼠EHS肉瘤提取。瘤組織用冷蒸餾水洗三次。在10，000×重力加速度(g)離心過濾30分鐘。沉淀(0.500克)在0.5升0.5克分子濃度乙酸，PH用鹽酸調至2.5的溶液中勻漿，并加入0.5克胃蛋白酶。勻漿物在4℃混合24到48小時，通過干酪包布過濾，在10，000×重力加速度離心30分鐘。沉淀重新懸浮在含50毫克分子濃度三羥甲基氨基甲烷的0.5克分子濃度氯化鈉中，再加入氯化鈉至其終濃度為4.5克分子濃度，在10，000×重力加速度(g)離心30分鐘。所得沉淀對0.1當量濃度乙酸透析三次，并冰凍干燥。
例 2制備牛血清纖維結合素新鮮放出的牛血〔80毫升(ml)〕收集在含有20毫升5%枸橡酸三鈉和0.1毫升苯基甲基磺酸基氟化物的聚丙烯管中，在300×重力加速度(×g)離心10分鐘以分開血漿及細胞層。再在30，000×重力加速度15℃下離心30分鐘，血漿中再加入苯基甲基磺酸基氟化物，使其達1mM，再加到明膠-瓊酯糖柱上。用磷酸鹽緩沖液洗脫(0.182克分子濃度磷酸鹽和0.145克分子濃度氯化鈉)，再用2倍柱床體積磷酸緩沖液的1克分子濃度氯化鈉洗，然后用2倍柱床體積磷酸緩沖液洗，最后用2倍柱床體積含4克分子濃度尿素的磷酸緩沖液的洗脫，洗脫部分的光密度在波長280毫微米處，檢測在含4克分子濃度尿素溶液正常存在的纖維結合素的量，含纖維結合素的部分光密度大于0.1。洗脫液對含有0.145克分子濃度氯化鈉的0.180克分子濃度磷酸緩沖液(氫離子濃度7.2)透析，再對含4.5克分子濃度尿素的0.05克分子濃度三羥甲基氨基甲烷-鹽酸鹽(氫離子濃度7.2)透析。并在室溫下加到DEAE(二乙基氨基乙基纖維素)離子交換柱子，用含4.5克分子濃度尿素的、0.05克分子濃度三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(氫離子濃度7.2)洗脫，洗脫液具有0到3克分子濃度氯化鈉直線梯度。洗脫的纖維結合素，對含0.145克分子濃度氯化鈉和1.0克分子濃度尿素的0.180克分子濃度磷酸鹽透析，并于-20攝氏度冰凍保存。
例 3制備昆布氨酸昆布氨酸從C57/6J小鼠膠原松介的EHS腫瘤制備，腫瘤切碎并在含50毫克分子三羥甲基氨基甲烷鹽酸(氫離子濃度調到7.4)及蛋白酶抑制的3.4克分子濃度氯化鈉溶液中勻漿。并在16，000×(g)重力加速度離心60分鐘，收集沉淀，并重懸浮于3.4克分子濃度氯化鈉中，再在16，000×重力加速度第二次離心60分鐘。勻漿物懸浮于0.5克分子濃度氯化鈉含50毫克分子三羥甲基氨基甲烷-鹽酸鹽，氫離子濃度7.4，和蛋白酶抑制劑溶液中，于4℃攬拌18到24小時。再在16，000×重力加速度離心60分鐘。上清液加入固體氯化鈉至3.5克分子濃度，于4℃攬拌過夜。離心后收集沉淀，進一步純化。將昆布氨酸重溶于0.5克分子氯化鈉含50毫克分子濃度三羥甲基氨基甲烷-鹽酸鹽，氫離子濃度7.4的溶液中。再于10，000×重力加速度離心60分鐘。上清液對2克分子濃度尿素含2.5克分子濃度氯化鈉和50毫克分子濃度三羥甲基氨基甲烷-鹽酸鹽、氫離子濃度為8.6的溶液透析。并進行DEAE纖維素柱層析。柱2.5×2.5厘米，用相同的緩沖液在4℃下平衡，未結合部分對2克分子尿素含50毫克分子濃度三羥甲基氨基甲烷-鹽酸鹽、氫離子濃度8.6的溶液透析。然后在DEAE柱上再層析。用相同緩沖液平衡。未結合部分經真空透析濃縮，并在葡聚糖丙烯酰胺凝膠S-300柱層析。用1.0克分子濃度氯化鈣，50毫克分子濃度三羥甲基氨基甲烷-鹽酸鹽(氫離子濃度7.5)的溶液，在22℃下平衡。收集空間體積部分并對0.4克分子濃度氯化鈉，50毫克分子濃度三羥甲基氨基甲烷-鹽酸鹽，氫離子濃度7.4的溶液透析，于4℃下保存。昆布氨酸(Laminin)重溶于0.1克分子濃度氫氧化銨氫離子濃度11.0的溶液中，然后，將氫離子濃度調至7.2。
例 4制備基礎膠原海綿或紙頁可溶或不溶性膠原(1.2克)加到120毫升稀鹽酸溶液，氫離子濃度3.0溶液中。混合物于瓦倫勻漿器(Waring Blender)中低速研磨一分鐘，然后高速磨一分鐘。溶液或懸浮液再倒入真空瓶中，于100毫乇減壓抽氣10分鐘，轉變成海綿狀的膠原懸液或溶液。然后在-65℃10毫乇以下真空度冰凍干燥之前，在0℃冷卻，再在-100℃冰凍。加工成紙頁狀的膠原溶液或懸浮液放于無菌罩中于22℃中干燥24到48小時。
例 5制備琥珀酸鹽，琥珀二亞胺酯交聯的基礎膠原襯質中間物9克琥珀酐，溶于80毫升蒸餾水中，在37℃下混合30分鐘。琥珀酸酐溶介后，氫離子濃度調到7.2，體積加到100毫升，放于勻漿器中(Waring Blender)，加入1克膠原研磨2分鐘，22℃下放1小時后，放在華特曼4號濾紙上，除去未反應的琥珀酐，再用100毫升蒸餾水洗。
剩余物放于20毫升磷酸緩沖液(0.182克分子濃度磷酸鹽和0.145克分子濃度氯化鈉)中，加入2克N-羥基琥珀亞胺和2克氨基氰溶液的氫離子濃度調到7.2，室溫反應3小時，用蒸餾水在布氏漏斗中在14英吋汞柱減壓洗滌，膠原-基礎襯質中間物經琥珀酸鹽，琥珀亞胺酯交聯的海綿和紙頁形成過程，與例4所述過程相同。
例 6制備含有纖維結合素的基礎膠原襯質1.2克可溶性或不溶性膠原在120毫升鹽酸氫離子濃度3.0的溶液中，再加0.12克纖維結合素(2.5毫克纖維結合素/毫升)與0.1克分子尿素含0.182克分子濃度磷酸鹽和0.145克分子濃度氯化鈉的溶液混合，混合物在勻漿器中攪拌2分鐘，紙頁及海綿按例4所述過程制備。
例 7用昆布寧(Laminin)纖維結合素Ⅳ型膠原做Ⅰ型膠原的外膜制成海綿及紙頁按例4及6做成的膠原紙頁及海綿在0.1M乙酸銨氫離子濃度7.2，含1到5%昆布氨酸，纖維結合素或Ⅳ型膠原的溶液中溶脹，溶脹的海綿或紙頁冰凍，再于-65℃50毫乇以下真空度冰凍干燥。
例 8制備含有透明質酸鹽和蛋白多糖的基礎膠原襯質1.2克可溶性及不溶性膠原于氫離子濃度3.0的鹽酸溶液中，加入到0.12克透明質酸鹽和蛋白多糖(西格馬化學公司，Ⅲ P級，Sigma Chemical Campany Grade Ⅲ-P)復合物氫離子濃度2.0的鹽酸溶液中，經體積120毫升，混合物于勻漿器中被散開，冰凍干燥或空氣干燥與例4過程相同。
例 9制備含Ⅳ型膠原的基礎膠原襯質1.2克可溶及不溶性Ⅰ型膠原及氫離子濃度2.0的鹽酸溶液加到0.012克Ⅳ型膠原的0.1克分子濃度乙酸銨，氫離子濃度7.2溶液中，終體積120毫升，混合物于勻漿器中勻漿2分鐘使成分散開，按例4相同的過程制成海綿或紙頁。
例 10氨基氰交聯基礎膠原襯質例4、6及9的產物，浸入含1%重量的氨基氰，氫離子濃度5.5的水溶液中，在22℃，24小時使其交聯。除去試劑以后，海綿和紙頁被徹底清洗24小時，換幾次水，冰凍并在50毫乇真空度以下于-65攝氏度冰凍干燥。
例 11基礎膠原襯質經嚴格脫水交聯例4、6及10產物于室溫放于真空爐上減壓至50毫乇以下，1小時后，加熱至110℃，并維持72小時，在此期間溫度降低至40℃，然后自爐上移出，于-20℃保存。
例 12基礎膠原襯質用琥珀亞胺活性酯交聯按例5制備的琥珀亞胺基活性酯、2克被放入有400毫升氫離子濃度2的鹽酸溶液的勻漿器中，研磨二分鐘，混合物于300毫乇真空下抽氣。再放在100%相對濕度的環境中，室溫放24小時，然后冷卻到0℃，并在50毫乇真空度，-65℃下冰凍干燥。或空氣干燥。分別做為海綿或紙頁形。
例 13含有蛋白酶抑制劑的基礎膠原襯質的制備按例4到9制備的海綿和紙頁放于20毫升氫離子濃度2.0的鹽酸中，含25%半脫氨酸或1%(重量/體積)α-2巨球蛋白，混合物冰凍，并在50毫乇以下的真空中，-65℃下冰凍干燥，或室溫空氣干燥。
例 14體外酶降介取上述各例中的產物1平方厘米，放入2毫升10毫克分子濃度三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，氫離子濃度7.4含25毫克分子濃度氯化鈣溶液中。每毫克樣品加入100單位自溶組織授菌來源的Ⅳ型膠原酶(西格馬化學公司)，放于37℃下保溫，每10分鐘用肉眼檢查每樣品的完整性，當樣品可見降介成0.5微米以下的碎片時，記錄時間，結果見表1。
例 15體外測定溶脹率變性膠原的溶脹率，與交聯度成反比，上述實例中的產物在蒸餾水中煮沸2分鐘，放在二層餐巾之間吸去水份，在夾有實驗材料的餐巾的上部放1公斤重量壓20秒鐘，記下濕樣的重量
再于110℃干燥3小時，再記錄干燥后的重量，自下列關系式計算溶脹率(r)r＝1/VfV f =D W / P C( D W )( P C )+( WW - D W )( P H2O )]]>DW及WW為干重及濕重，Pc和PH2O分別為實驗材料及水的密度，結果在前面所列的表1中。
例 16基礎膠原襯質的機械性質在以上實例中制備的海綿及紙頁，切成直角形(4.0厘米×1.0厘米)的小條，在機械試驗之前浸入氫離子濃度7.5的磷酸緩沖液中20分鐘，在22℃下，用Instron型1122測試儀每分鐘10%的張力率測試小條的單軸張力，小條的末端放在充氣的夾子上，夾子有-20毫米長的口徑在40磅/英吋(計示)(Psig)壓力下可關緊。張力-應力曲線可測得，從曲線上可計算在高(HSM)和低張力時的楊氏系數。在低系數區終點的張力標志為eL，張力破碎時標示為lf。張力計算結果在上面的表1中。
例 17基礎膠原襯質的皮下生物適應性按上述實例制備的海綿和紙頁在用2.5百萬拉得(Mrads)的r-射線滅菌后，測試其在皮下的生物適應性。在滅菌條件下用350g重的雌性白豚鼠為實驗動物進行植入。
在背部側切一厘米長的皮膚切口，并與筋膜層分開，放入1厘米×1厘米大小的植入物，用外傷夾子從植入物上邊將皮膚邊緣夾緊，在植入后第六、第九，第十二天殺死動物，將含有載體的組織放入卡森氏(Carsons)固定液中，并進行組織學研究，結果在表11中。
例 18在襯質層上制備擴散控制層應用在例4到例10中制備的海綿及紙頁，用刮刀在襯質層表面放上一層1毫米厚的硅橡膠醫用級粘合劑。擴散控制層經22℃100毫乇減壓處理2小時。得到的擴散控制及襯質層復合物與全厚度皮膚創傷接觸。
例 19在全厚度皮膚傷口上擴散控制與襯質層的生物適應性按例18制備的海綿及紙頁，照射滅菌后在雌性阿拜腦(Hartley Albino)350克白豚鼠的皮膚傷口上做為敷料，進行測試。每只動物分別喂養，測試前連續稱體重4天，測試前一天用電動刮刀去毛，再用納氏脫毛機(Nair)脫毛，并洗凈，用乙醚麻醉，背部用碘-聚乙烯氮五環酮復合物和乙醇洗凈，浸在磷酸緩沖液中(0.182克分子濃度磷酸鹽和0.154克分子濃度氯化鈉)，由襯質及擴散控制層組成的2厘米×2厘米大小的被測材料，敷在全厚度切除的皮膚傷口上，與襯質層一樣，與肌層的位置相對應。
襯質與擴散控制層，用鞣化鉻腸線在敷料邊緣處縫合到傷面上。在傷面敷料上放以消毒棉敷料，用繃帶包扎，用彈性膠條(約翰森和約翰森產品公司)圍繞頸部固定，在實驗過程中動物每三個放在一個籠中。
每天監視繃帶撕裂情況，在植入后第6
9、12天殺死動物，切下植入物及傷面，固定，并做組織學研究。結果在表Ⅲ中。
在上述講授的方法中，本發明中可能有許多修改和變化。因此，在附屬權利要求
的范圍內，本發明根據其特殊的敘述來實施。
權利要求
1.一種制備新的基礎膠原襯質的方法，其特征包括(1)用液體基質與從一組包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原中選出的一種膠原混合，形成基礎膠原底物。(2)在步驟(1)的產物中加入自碳化二亞胺及雙功能琥珀亞胺基活性酯組中選出的交聯劑。(3)將步驟(2)中所述產物在真空條件下升高溫度，產生所述基礎膠原襯質。
2.根據權利要求
1所述方法，其中步驟(3)在步驟(2)之前進行。
3.根據權利要求
1或2所述方法，其中所述液體基質是所述膠原的溶劑。
4.根據權利要求
1或2所述的方法，其中所述液體基質是所述膠原的分散劑。
5.根據權利要求
1或2所述的方法，其中所述交聯劑是碳化二亞胺，并在溶液中，其濃度大約自0.1至10%(重量/體積)。
6.根據權利要求
5所述的方法，其中所述碳化二亞胺溶液及基礎膠原底物在進一步加工前，保持在2到40℃，2到96小時。
7.根據權利要求
6中所述的方法，其中所述碳化二亞胺溶液的氫離子濃度自2到11。
8.根據權利要求
1或2的方法，其中所述交聯劑為雙功能琥珀亞胺活性酯，是在濃度自大約0.1至大約15.0%(重量/體積)的溶液中。
9.根據權利要求
8所述的方法，其中所述雙功能琥珀亞胺活性酯溶液及基礎膠原底物，在進一步加工前，保持于2到40℃，2到96小時。
10.根據權利要求
1或2所述的方法，其中的過剩的交聯劑在步驟(3)之前除去。
11.根據權利要求
1或2所述的方法，其中步驟(3)在50毫乇以下的真空中，自50到大約200℃的溫度條件下進行。
12.根據權利要求
11所述方法，其中的步驟(3)是在2到96小時的時間內進行的。
13.根據權利要求
1或2中所述的方法，其中所述基礎膠原底物在步驟(2)之前，經冰凍干燥。所述方法使基礎膠原襯質形成海綿狀。
14.根據權利要求
13中所述的方法，其中所述基礎膠原底物在冰凍干燥步驟之前固化。
15.根據權利要求
14所述的方法，其中的冰凍干燥步驟在50毫乇以下的真空中，溫度自大約22到-100℃下進行的。
16.根據權利要求
15所述的方法，其中所述基礎膠原底物是在0℃到-100℃下固化的。
17.根據權利要求
13所述的方法，其中所述基礎膠原襯質中間物在步驟(3)之前進行冰凍干燥。
18.根據權利要求
17所述的方法，其中所述基礎膠原襯質中間物在步驟(3)之前的冰凍干燥之前固化。
19.根據權利要求
17所述的方法，其中冰凍干燥的步驟在50毫乇以下的真空條件下，溫度自大約22℃到-100℃間進行的。
20.根據權利要求
17所述的方法，其中所述基礎膠原底物在溫度自0℃到-100℃間固化。
21.根據權利要求
1或2所述的方法，其中所述基礎膠原底物在步驟(2)之前干燥。所述方法形成紙頁形基礎膠原襯質。
22.根據權利要求
21所述的方法，其中干燥步驟是在溫度自4℃到40℃，時間自2到96小時的條件下進行的。
23.根據權利要求
1或2所述的方法，其中載體復合物在所述基礎膠原襯質形成時加到所述基礎膠原襯質中。所述載體復合物是從一組包括有Ⅳ型膠原、Ⅴ型膠原、纖維結合素、昆布氨酸、透明質酸鹽、蛋白多糖、表皮生長因子、血小板衍生的生長因子、血管發生因子、抗菌素、抗真菌因子、殺精劑、酶和酶的抑制劑中選擇的。
24.根據權利要求
23所述的方法，其中所述基礎膠原襯質在步驟(2)之前冰凍干燥，所述方法形成海綿形式的基礎膠原襯質。
25.根據權利要求
24所述的方法，其中所述基礎膠原襯質在冰凍干燥步驟之前固化。
26.根據權利要求
25所述的方法，其中冰凍干燥的步驟在50毫乇以下的真空中，溫度自22℃到-100℃之間進行。
27.根據權利要求
26所述的方法，其中所述基礎膠原襯質在溫度自0℃到-100℃下固化。
28.根據權利要求
24所述的方法，其中所述基礎膠原襯質中間物在步驟(3)之前冰凍干燥。
29.根據權利要求
28所述的方法，其中所述基礎膠原襯質在步驟(3)之前的冰凍干燥之前固化。
30.根據權利要求
28所述的方法，其中冰凍干燥步驟是在50毫乇以下的真空中，溫度自22℃到-100℃間進行的。
31.根據權利要求
28所述的方法，其中所述的基礎膠原襯質在溫度自0℃到-100℃之間固化。
32.根據權利要求
23所述的方法，其中所述的基礎膠原襯質在步驟(2)之前干燥。所述方法形成紙頁形基礎膠原襯質。
33.根據權利要求
32所述的方法，其中所述的干燥在溫度4℃到40℃，時間2到96小時之間進行。
34.根據權利要求
33所述的方法，進一步包括在所述紙頁形基礎膠原襯質上安置擴散層的步驟。
35.根據權利要求
34所述的方法，其中所述擴散層是無孔的。
36.根據權利要求
34所述的方法，其中所述無孔的擴散層是可被生物降介的。
37.根據權利要求
34所述的方法，所述擴散層是由不被生物降介的多聚物制成的。
38.一種基礎膠原襯質，其特征是構成這種襯質的膠原由包括有其分子量至少為1.0×106的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型一組膠原中選擇的。
39.根據權利要求
36所述的基礎膠原襯質，其中分子量大于50×106的部分。
40.根據權利要求
39所述的基礎膠原襯質，基于通過共價鍵交聯之間的分子量從1000到100，000。
41.根據權利要求
38所述的基礎膠原襯質，具有自3到100微米孔度的孔隙。
42.根據權利要求
38所述的基礎膠原襯質，進一步包含從下列一組材料中選出的載體復合物，包括有Ⅳ型膠原，Ⅴ膠原、纖維結合素、昆布氨酸、透明質酸鹽、蛋白多糖、表皮生長因子、血小板衍生的生長因子、血管發生因子、抗菌素、抗真菌因子、殺精子劑(Spermacidal)酶及酶的抑制劑。
43.根據權利要求
38或42所述的基礎膠原襯質，其特征是呈紙頁形。
44.根據權利要求
43所述的基礎膠原襯質，其特征是進一步包括擴散層。
45.根據權利要求
44所述的基礎膠原襯質，其特征是進一步包括非孔擴散層，它可應用于所述基礎膠原襯質的兩側。
46.根據權利要求
45所述的基礎膠原襯質，其中所述無孔度擴散層是可被生物降介的。
47.根據權利要求
44所述的基礎膠原襯質，其中所述擴散層緊密粘合在所述的基礎膠原襯質上。
48.根據權利要求
47所述的基礎膠原襯質，其中所述基礎膠原襯質及所述擴散層具有至少每平方英吋有100磅的結合張力強度。
49.根據權利要求
47所述的基礎膠原襯質，其中所述基礎膠原襯質和擴散層應有至少10%的變形性。
50.根據權利要求
43所述的基礎膠原襯質，具有至少約為2.5的溶脹比。
專利摘要
制備一種新的可被生物降介的基礎膠原襯質的方法，包括把液體基質與從一組包括I、II、III型膠原中選出的一種膠原混合形成基礎膠原底物，再與碳化二亞胺及雙功能琥珀亞胺基活性酯選出的交聯劑接觸，嚴格脫水而成。在基礎膠原襯質中加入載體化合物，這些化合物從下列物質中選擇IV、V型膠原，纖維結合素，昆布氨酸，透明質酸鹽，蛋白多糖，表皮生長因子，血小板衍生生長因子，血管發生因子，抗菌素，抗真菌因子，殺精子因子，酶及酶的抑制劑。
文檔編號A61L15/42GK85101396SQ85101396
公開日1987年1月31日 申請日期1985年4月1日
發明者費雷德里克·里爾弗, 理查德·伯格, 戴維·伯克, 凱文·威克, 康拉德·懷恩 申請人:新澤西州口腔醫學院導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan