白細(xì)胞介素-2的穩(wěn)定組合物的制作方法

專利名稱:白細(xì)胞介素-2的穩(wěn)定組合物的制作方法
本發(fā)明是一種用于藥劑或其他方面的白細(xì)胞介素-2的組合物。
白細(xì)胞介素-2(以下簡(jiǎn)稱為IL-2)是一種蛋白質(zhì)，它具有作為T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞生長(zhǎng)因子的功能，并且認(rèn)為這些細(xì)胞在體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)中起著重要作用，直接或間接地有助于消除癌或從免疫異常狀態(tài)恢復(fù)正常及改善免疫低下狀態(tài)(自然〔Nature〕302，305-〔1983〕)。由于IL-2具有這樣的生理活性，因此人們寄希望于能把它作為一種新型抗瘤劑或?qū)γ庖呷毕莸闹委焺﹣硎褂谩?br>本發(fā)明的發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)，IL-2是不穩(wěn)定的，在對(duì)IL-2進(jìn)行冷凍或冷凍干燥之后的儲(chǔ)藏過程中，以及冷凍干燥之后的儲(chǔ)藏過程中，它的活性很易損失，特別是在冷凍干燥這一步驟中，更是這樣，并且把冷凍干燥的IL-2制劑重新溶解所得的液體一般都是混濁的。這些事實(shí)及其他一些事實(shí)，對(duì)把IL-2作為治療的應(yīng)用，是很不利的。
在這樣的情況下，本發(fā)明的發(fā)明者們進(jìn)行了廣泛深入的研究。成功地制造出了一種穩(wěn)定的IL-2的組合物，并且現(xiàn)已完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供了種種IL-2組合物，它含有血清白蛋白。一種還原化合物，或它們的一種結(jié)合物，并且是一種pH被調(diào)到3至6的溶液。
在實(shí)踐本發(fā)明的過程中，所用的IL-2可以來源于任何哺乳動(dòng)物，但以來源于人類的為更好。所用的IL-2可以是天然的或是DNA技術(shù)重組的產(chǎn)物，盡管用后一種更好。常用的型式為溶液狀的IL-2。
IL-2的最好的例子是用遺傳工程生產(chǎn)出的，非糖基化的人體IL-2，其通式為X-ALa(……見原文，共11行符號(hào)，其中X是甲硫酸氨酸或是氫，其混合物也能用。
在下面的式中，每一個(gè)氨基酸殘基是用(IUPAC-IUB)委員會(huì)生物化學(xué)命名法所規(guī)定的縮寫符號(hào)代表的。
IL-2具有理想的特異活性為20000～80000單位/毫升，具有優(yōu)越性的液體形式的IL-2的活性為1～80000單位/毫升，以活性為10～50000單位/毫升為較好，，以活性為50～5000單位/毫升為更
面上面這種液體形式的IL-2，在實(shí)踐本發(fā)明的過程中是作為原料的，并以不含鹽類，如氯化鈉的為好。如果在提純IL-2的過程中，所說的這種溶液被鹽污染了，那么最好用超濾把鹽除掉，如在使用之前就進(jìn)行超濾。
人體血清蛋白(以下簡(jiǎn)寫為HSA)可以是任意等級(jí)的。然而在本發(fā)明之用于醫(yī)療的組合物中，所說的HSA以用其質(zhì)量適于腸胃外途徑給藥的為好。
例如，用健康人體血漿作為超始物，按照科思(Cohn)的第6種乙醇分法來分離和提純HSA(美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)雜志〔J.Am.chem Soc〕68，459～475(1946)。
所述的HSA也還可以含有作為穩(wěn)定劑的乙酰色氨酸鈉或辛酸鈉。
在上面所述的IL-2的濃度范圍內(nèi)，在每毫升液體IL-2中，所添加的HSA的水平以0.1～50毫克為好，以0.5～20毫克為更好。
還原化合物以生理上相容的還原化合物為好，包括含硫的還原化合物，例如谷胱甘肽)，硫辛酸，N-乙酰半胱氨酸，N-乙酰半胱氨酸，硫二甘醇，硫乙醇胺，單硫甘油，二硫蘇糖醇，含有1-7個(gè)碳原子的硫鏈烷酸類(如巰基乙酸，硫蘋果酸)，抗壞血酸及其上述成份的鹽類以用酸性化合物為好，如谷胱甘肽，硫辛酸，N-乙酰半胱胺酸和抗壞血酸，并且以用谷胱甘肽和抗壞血酸最為適宜。
上述的還原化合物可以單獨(dú)使用，也可以兩個(gè)或兩個(gè)以上結(jié)合使用。
這些還原化合物的用量，在每毫升含有上述IL-2濃度范圍內(nèi)的IL-2溶液中，以不少于0.01毫克為好，以0.05～20毫克為更好。
上述的HSA和還原化合物，在使用時(shí)，它們可以兩者都在上述的范圍內(nèi)，或者其中一個(gè)在上述范圍內(nèi)，以HSA在上述范圍內(nèi)為好。
本發(fā)明之IL-2組合物還可進(jìn)一步含有一種或更多的物質(zhì)，這些物質(zhì)是選自氨基酸中，特別是單氨脂肪族氨基酸和環(huán)氨基酸，如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸和脯氨酸，單糖類，如葡萄糖，甘露糖，糖醇類，如山梨糖醇和甘露糖醇，生理上相容的鹽類及其衍生物。在這些輔助添加劑中，以用甘氨酸為最好。
在每毫升上述IL-2溶液中，上述的輔助添加劑的用量，對(duì)單糖和糖醇類以10～100毫克為好，對(duì)氨基酸類以5～50毫克為好。
本發(fā)明之IL-2組合物還可進(jìn)一步含有等滲劑，氯化鈉，緩沖液，如琥珀酸，酒石酸或檸檬酸，和/或表面活性劑。然而，從冷凍干燥過程中的穩(wěn)定化觀點(diǎn)來看，IL-2組合物中最好不含有氯化鈉。
為了使本發(fā)明的IL-2組合物的pH為3-6，較好的3～5.5，最好的3.5～4.5，要用以下的物質(zhì)把組合物的pH調(diào)至這里所特定的范圍之內(nèi)，可以用酸性還原化合物或酸性氨基酸，如谷氨酸，或者是有進(jìn)一步需要時(shí)而又不含有酸性化合物時(shí)，可用礦物酸，如鹽酸或磷酸，或可用有機(jī)酸緩沖液。如琥珀酸，酒石酸或檸檬酸。
上述IL-2的穩(wěn)定性可以進(jìn)一步地提高，即把放有IL-2組合物的容器中的空氣抽干或在其中充滿氮。
本發(fā)明之IL-2組合物以溶液，冰凍，冷凍干燥或類似的形式為好，尤其是冷凍干燥的形式為好。
本發(fā)明之組合物的制備，可按如下的方式進(jìn)行在濃度為1～80000單位/毫升的IL-2溶液中，加入HSA和/或還原化合物至預(yù)定的濃度，接著用上述的方式調(diào)整pH值。
還可以加入上述相應(yīng)濃度的單糖，糖醇和氨基酸。如有必要，還可以進(jìn)一步加入等滲劑，表面活性劑等等。如果除了HSA以外，還添加了其他物質(zhì)，就要依上述方法調(diào)整pH值，以使最終之溶液的pH保持在上述的范圍內(nèi)。這樣獲得的IL-2組合物，還可以作為依下述方式制造冰凍材料或冷凍干燥物的原料。
例何，對(duì)上述溶液在-80℃至-20℃冷凍，一般可制成冰凍形式的IL-2組合物。所述的冰凍組合物最好儲(chǔ)藏在-80℃～-10℃條件下。
例如，冷凍干燥形式的IL-2組合物可以這樣制造，把上述的冰凍組合物在減壓條件下以常規(guī)方式干燥，或?qū)ι鲜鋈芤?、或?qū)ι鲜霰鶅鼋M合物解凍所得之溶液以上述之相同方式進(jìn)行冷凍，接著依所需進(jìn)行分布，最后在減壓條件下，以常規(guī)方法對(duì)所得冰凍組合物進(jìn)行干燥處理。
進(jìn)而言之，本發(fā)明之液體形式的IL-2組合物還可以這樣制備，把含有IL-2，HSA或/和還原化合物，pH調(diào)節(jié)劑等等的用上述方法制得的冷凍干燥物重新溶解于一種溶劑中，該溶劑含有單糖，糖醇氨基酸等，以及需要時(shí)還含有pH調(diào)節(jié)劑，如鹽酸。
在把本發(fā)明之冷凍干燥的IL-2組合物制成可注射的制劑時(shí)，最好是把一種含有IL-2的溶液和一種含有添加劑的溶液結(jié)合起來，各自分別進(jìn)行消毒過濾，或?qū)@兩種液體之混合物用消毒過濾等方式提純?nèi)缓蟀鸦旌衔镆詿o菌操作分放入小玻璃瓶或類似物中，并對(duì)小玻璃瓶或其類似物中的混合物進(jìn)行上述的冷凍干燥處理在把冷凍干燥物溶解于一種含有氨基酸，單糖或糖醇的溶液中時(shí)，最好這種溶液經(jīng)過消毒過濾，接著分裝入安瓿瓶或其類似物中，并且在把它作為溶劑使用之前先進(jìn)行高壓消毒。
本發(fā)明之IL-2組合物具有比其他更為優(yōu)越的特征，其特征在于在儲(chǔ)存、冰凍，冷凍干燥的過程中，IL-2活性的降低為最小值，而當(dāng)其為冷凍干燥物時(shí)，把它重新溶解所得到的液體為清澈透明的。
本發(fā)明之IL-2組合物，特別是冷凍干燥形式的，具有改善的外觀，而且有效地防止了容器壁對(duì)其的吸收。
含有氨基酸的組合物，當(dāng)冷凍干燥時(shí)也呈現(xiàn)改善的外觀，在用于注射時(shí)也可有效地減輕病人的疼痛。
含有單糖的組合物，在用于注射時(shí)，還達(dá)到了減痛的效果。
在本發(fā)明所提供的IL-2組合物中，與其他形式相比，在作為非腸胃道制劑來說冷凍干燥形式優(yōu)于其他，它可以制成穩(wěn)定的IL-2的粉末。在作為注射劑使用時(shí)，冷凍干燥物被溶解于0.5～100毫升的注射用蒸溜水中，或溶于生理鹽水中，或溶于為其特殊用途而制的0.5～100毫升溶劑中，該溶劑為這樣一種溶液，含有氨基酸如甘氨酸，單糖如葡萄糖，或糖醇如甘露糖醇，如果需要的話還有pH調(diào)節(jié)劑，而且這種溶液是用于肌肉或靜脈注射的。所述的組合物還可以在配有合適的載體，賦形劑或稀釋劑時(shí)，制成用于口服，用于鼻腔，用于耳朵或眼睛的制劑。
本發(fā)明之IL-2組合物的毒性低，并且可以與已知的IL-2制劑一樣，以相同的方式用于相同的目的。
本發(fā)明說明書中所用的，以單位(Unite)所表示的有關(guān)IL-2活性的資料，是用下述方式得到的把含有IL-2的試驗(yàn)樣品加入懸浮培養(yǎng)液中，其中含有小鼠細(xì)胞株，這種細(xì)胞株能以依靠IL-2濃度的方式生長(zhǎng)。在對(duì)細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)之后，以攝取的氚化胸苷為指數(shù)來測(cè)定該細(xì)胞株的生長(zhǎng)。在進(jìn)行分析時(shí)，總是用標(biāo)準(zhǔn)的IL-2(1單位/毫升)作為試驗(yàn)樣品的平行對(duì)照并且用它與試驗(yàn)樣品之間的活性比計(jì)算樣品的活性(以單位表示)。
特別是，用傳代的方法，在RPMI1640培養(yǎng)基中保護(hù)依賴IL-2的鼠細(xì)胞株〔NRC3，黑紐瑪?shù)热?、生物化學(xué)及生物物理研究通訊，109，363(1982)(Hinuma et al，Biochemical and Biophysical Research Communications)〕在RPMI1640培養(yǎng)基中還含有人體IL-2的經(jīng)過處理的培養(yǎng)基加入20%的FCS〔牛血清(fetal calf Serum)〕，保持溫度為37℃，并且使用了5%的二氧化碳(CO2)。用不含血清的RPMI1640培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞2次，并把細(xì)胞以6×105細(xì)胞/毫升的濃度再次懸浮于加有FCS的RPMI1640培養(yǎng)基中。
全部含有IL-2的試驗(yàn)樣品，以50微升為一份，分別放入96孔平底微量滴定板〔Nune Denmark〕的第一排孔中，接著用一系列的信比稀釋直至第12排，每個(gè)孔中用50微升20%的加有FCS的RPMI1640培養(yǎng)基，接著每孔中加入50微升上述的NKC3細(xì)胞懸浮液。在通有5%二氧化碳的條件下，以37℃的溫度培養(yǎng)24小時(shí)，在此期間，把1微居(μCi)的氚化胸苷(Amersham Great Britain)在培養(yǎng)20小時(shí)的時(shí)候分別加入每個(gè)孔中。用細(xì)胞收集器(Flow，U.S.A)在玻璃濾器上使細(xì)胞回收，并且用液閃計(jì)數(shù)儀器定氚化胸苷的吸收。
對(duì)活性以單位計(jì)的計(jì)算，是按免疫學(xué)雜志〔Journal of lmmunology〕120，2027，〔1978〕所述的方法計(jì)算的，在由標(biāo)準(zhǔn)IL-2樣品經(jīng)稀釋而得到的一系列稀釋液中(培養(yǎng)基上清液經(jīng)48小時(shí)培養(yǎng)條件是溫度為37℃，通入5%的二氧化碳，含有濃度為5×105毫升/個(gè)淋巴細(xì)胞的人類外周血液，人類外周血液10%的FCS加入到RPMI1640培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基中還含有40微克的刀豆素A和15毫微克/毫升12-鄰位-四癸酰咐
乙酸鹽(12-0-tetra-deomroylphorbl-13-acetate)，并將此確定為每毫升具有一個(gè)單位的活性)，最大的吸收值被計(jì)為100%，并計(jì)算每一個(gè)稀釋液的吸收百分?jǐn)?shù)1%)。所得的各個(gè)值繪制在普通概率紙上，相應(yīng)于吸收值為50%的稀釋因子是由圖上確定的。對(duì)每一個(gè)含有著IL-2的試驗(yàn)樣品的，相應(yīng)于吸收值為50%的稀釋因子是以同樣的方法確定的。
試驗(yàn)樣品的IL-2濃度(單位/毫升)是用下式計(jì)算的試驗(yàn)樣品吸收值為50%時(shí)的稀釋因子標(biāo)準(zhǔn)IL-2樣品吸收值為50%時(shí)的稀釋因子在此后實(shí)施例中所述的轉(zhuǎn)化型大腸桿菌DH1/pTF4(Escherichia coli DH1/pTF4)已經(jīng)儲(chǔ)存于大阪發(fā)酵所(Fermentation Institute，Osaka)，儲(chǔ)存號(hào)為IFO-14299，儲(chǔ)存日是1984年4月6日，并以儲(chǔ)存號(hào)為FERMBP-628儲(chǔ)存于國(guó)際貿(mào)易工業(yè)部，工業(yè)科技社的發(fā)酵研究所(Fermentation Research Institnte，Agency of Industreal Science and Technology，Ministy of International Trade and Indnstry)。
實(shí)施例以下各工作實(shí)例以及參考實(shí)例更為詳細(xì)地解釋了本發(fā)明。然而，無論如何它們都不限制本發(fā)明。
在工作實(shí)例中所用的原液，是用在參考實(shí)例中給出的方法制得的非糖基化人類IL-2蛋白溶液。
實(shí)施例1在一種溶液(0.5毫升中，該溶液含有2450單位的人類IL-2，即用注射蒸溜水把原液稀釋并經(jīng)過消毒過濾而制成的，消毒過濾后再加入另一種含有10毫克谷胱甘肽或抗壞血酸并經(jīng)消毒過濾的液體(0.5毫升)。這樣所得的兩種溶液(每份1毫升)(pH分別為3.4和3.5)分別放入一個(gè)小瓶中，在-40℃冰凍，并進(jìn)行冷凍干燥。此外，小瓶中的空間要充滿氮?dú)獠研∑可w嚴(yán)。
取相同量的不含谷胱甘肽或抗壞血酸的溶液和等量的含有25毫克甘露糖醇的溶液作為空白對(duì)照，并以同樣的方式進(jìn)行冷凍干燥，所用的甘露糖醇經(jīng)常用在冷凍干燥制劑中替代谷胱甘肽或抗壞血酸。
這些冷凍干燥物分別重新溶解于1毫升的注射用蒸溜水中，并檢測(cè)每個(gè)溶液的可溶性(清晰度)和其效力。就效力而言，以冷凍干燥前溶液的效力為100%，并依此計(jì)算出各溶液殘留效力的百分?jǐn)?shù)。結(jié)果在表1中給出了，并且顯示出來本發(fā)明之IL-2組合物的可溶性和殘留效力都極大地優(yōu)于空白對(duì)照。
表1添加劑(mg) 可溶性 殘留效力無 混濁 47%甘露糖醇 25 混濁 58%谷胱甘肽 10 清晰 97%抗壞血酸 10 清晰 100%實(shí)施例2用一種含有7680單位人類IL-2的溶液(0.5毫升)，該溶液是用注射蒸溜水稀釋原液并經(jīng)消毒過濾制得，消毒過濾后加入一種含有2毫克谷胱甘肽或抗壞血酸的溶液。這樣所得的兩種溶液(每份1毫升)(PH分別為3.6和3.7)以同實(shí)施例1相同的方法冷凍干燥，將剛制得的冷凍干燥產(chǎn)物進(jìn)行可溶性檢查，以及在制造后以25℃條件儲(chǔ)存1個(gè)月的產(chǎn)物，進(jìn)行可溶性及殘留效力的檢驗(yàn)。
所得結(jié)果在表2中給出。
表2
實(shí)施例3在含有7680單位人類IL-2的溶液0.5毫升中，該溶液是用注射蒸溜水稀釋原液并經(jīng)消毒過濾制得，消毒過濾后加入含有5毫克HSA及2毫克谷胱甘肽或抗壞血酸的溶液(0.5毫升)。這樣所得的兩種溶液(每種1毫升)(pH分別為4.1和4.2)，用與實(shí)施例1相同的方法冷凍干燥，并以與實(shí)施例2相同的方法檢驗(yàn)冷凍干燥產(chǎn)物的可溶性和殘留效力。
所得結(jié)果在表3中給出。
在含有7680單位人類IL-2的溶液0.5毫升中，該溶液是用注射蒸溜水稀釋原液并經(jīng)消毒過濾制得，消毒過濾后加入一種含HSA5毫克，氯化鈉9毫克，2毫克谷胱甘肽或抗壞血酸的溶液(0.5毫升)這樣所得的兩種溶液(每種1毫升)(pH值分別為4.1和4.2)，以與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行干燥處理，并以與實(shí)施例2相同的方法測(cè)定冷凍干燥產(chǎn)物的可溶性和殘留效力。
所得結(jié)果在表4中給出。
實(shí)施例5在含有7680人類IL-2的溶液(0.5毫升)中，該溶液是用注射蒸溜水稀釋原液并經(jīng)消毒過濾制得，消毒過濾后加入含有50毫克甘露糖醇、2毫克谷胱甘肽或抗血酸的溶液(0.5毫升)。這樣所得的兩種溶液(每種1毫升)(pH值分別為3.4和3.6)以與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行冷凍干燥，并以與實(shí)施例2相同的方法測(cè)定冷凍干燥產(chǎn)物的可溶性和殘留效力。
所得結(jié)果在表5中給出。
表5
＊此數(shù)據(jù)是在25℃保存6天之產(chǎn)物的。
實(shí)施例6在含有23350單位人類IL-2的溶液(0.5毫升)中，該溶液是用注射蒸溜水稀釋原液并經(jīng)消毒過濾制成，消毒過濾后加入含有5毫克谷胱甘肽和23毫克甘氨酸的溶液(0.5毫升)。這樣所得的溶液(1毫升)(pH3.7)用與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行冷凍干燥處理，并以與實(shí)施例1相同的方法對(duì)剛制得的及在40℃保存三星期的冷凍干燥產(chǎn)物進(jìn)行可溶性和殘留效力的測(cè)定。
所得結(jié)果在表6中給出。
表6
實(shí)施例7
在含有1790單位或130單位人類IL-2的溶液(0.5毫升)中，該溶液是用注射蒸溜水稀釋原液并經(jīng)過消毒過濾制得，消毒過濾后加入含有2毫克谷胱甘肽，5毫克MSA，9毫克氯化鈉的溶液(0.5毫升)。這樣所得的兩種溶液(每種1毫升)(pH均為3.9)。以與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行冷凍干燥處理，并用與實(shí)施例1相同的方法，對(duì)剛制成的及在40℃保存1個(gè)星期的冷凍干燥產(chǎn)物進(jìn)行可溶性和殘留效力的測(cè)定。
所得結(jié)果在表7中給出。
表7
實(shí)施例8在含有1860單位或116單位人類IL-2的溶液(0.5毫升)中，該溶液是用注射蒸溜水稀釋原液并經(jīng)消毒過濾制成的，消毒過濾后加入含有2毫克谷胱甘肽，1毫升MSA和23毫克甘氨酸的溶液(0.5毫升)，這兩種液體(每種1毫升，pH分別為3.8和3.9)，用與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行冷凍干燥處理，并且以實(shí)施例1的方法對(duì)剛制成的40℃保存1星期的冷凍干燥產(chǎn)物分別測(cè)定它們的可溶性和殘留效力。
結(jié)果在表8中給出。
表8
人類IL-2 添加劑(mg) 剛制成產(chǎn)物 40℃保存1周后(單位) 可溶性 效力 可溶性 效力1860 谷胱甘肽(2) 清晰 90% 清晰 98%+HAS(1)+甘氨酸(23)116 同上 同上 清晰 110% 清晰 108%實(shí)施例9在含有17600單位人類IL-2的溶液(0.5毫升)中，該溶液是以注射用蒸溜水稀釋原液并經(jīng)消毒過濾制成，消毒過濾后加入含有5毫克HSA、9毫克氯化鈉、并且pH為4(用鹽酸調(diào)整)的溶液(0.5毫升)。這樣所得的兩種溶液(每種1毫升)被放入小瓶中，以-40℃冰凍，并且進(jìn)行冷凍干燥，并且在小瓶的空間充滿氮?dú)?，把小瓶蓋嚴(yán)。
把剛制成的及在40℃保存了半個(gè)月的冷凍干燥產(chǎn)物重新溶解于1毫升的注射用蒸溜水中，并測(cè)定它們的可溶性(清晰度)和效力。就效力而言，以冷凍干燥前之液體的效力為100%，并在此基礎(chǔ)上計(jì)算出殘留百分?jǐn)?shù)。如表9中的結(jié)果所指出的那樣，本發(fā)明之IL-2組合物具有極為優(yōu)越的可溶性和殘留效力。
表9剛制成產(chǎn)物 40℃保存半個(gè)月后添加劑(mg) 可溶性 效力 可溶性 效力HSA(5)用鹽酸調(diào)節(jié)pH 清晰 102.3% 清晰 100.6%HSA(5)+氯化鈉(9) 清晰 113.6% 清晰 110.2%用鹽酸調(diào)節(jié)pH
實(shí)施例10在含有4115單位/毫升人類IL-2的溶液(0.5毫升)，該溶液是以注射用蒸溜水稀釋原液并經(jīng)過消毒過濾制成，消毒過濾后再加入含有5毫克HSA，5毫克HSA加9毫克氯化鈉，5毫克HSA加23毫克甘氨酸，或5毫克HSA加50毫克甘露糖醇的pH為4.0(用鹽酸調(diào)整)的溶液(0.5毫升)。這樣所得的4種溶液(每種1毫升)分別放入小瓶中，以-40℃冷凍并進(jìn)行冷凍干燥處理，小瓶的空間充滿氮?dú)獠研∑可w嚴(yán)。用作對(duì)照的是等量的，只含人類IL-2的液體，不同IL-2的溶液其中不含pH調(diào)節(jié)劑，并以上述的方法進(jìn)行冷凍干燥。
測(cè)定這些冷凍干燥物的外觀，并把它們分別重新溶于1毫升的注射用蒸溜水，0.9%的生理鹽水，5%的葡萄糖溶液，5%的山梨糖醇溶液，或5%的甘露糖醇溶液中，并測(cè)定它們的PH值和可溶性(清晰度)。
正如表10中結(jié)果所示，本發(fā)明之IL-2組合物在可溶性方面比對(duì)照具有極大的優(yōu)越性。特別是摻合HSA和甘氨酸所得的冷凍干燥產(chǎn)物，其PH為4，在可溶性方面更為優(yōu)越。
實(shí)施例11由實(shí)施例9的方法得到的兩種溶液(各1毫升)，并用過濾除去細(xì)菌，其中含有1620或128單位的人類IL-2，5毫克HSA和23毫克甘氨酸，PH為4.0(用鹽酸調(diào)整)，以實(shí)施例9之方法進(jìn)行冷凍干燥，對(duì)剛制成的及在40℃保存了1.2和4周的產(chǎn)物，以實(shí)施例9之方法測(cè)定它們的可溶性及殘留效力。
所得結(jié)果在表11中給出。
實(shí)施例12在含有2450單位人類IL-2的溶液(0.5毫升)中該溶液是以注射用蒸溜水稀釋原液并經(jīng)過消毒過濾制成，加入(5毫升)注射用蒸溜水，消毒濾液(0.5毫升)，該濾液中含有10毫克谷胱甘肽，谷胱甘肽二鈉鹽，抗壞血酸或抗壞血酸鈉鹽，或是被用鹽酸調(diào)至酸性的消毒濾液(0.5毫升)，該濾液中含有10毫克的谷胱甘肽二鈉鹽或抗壞血酸鈉鹽。把這樣制得的7種溶液分別放入小瓶中，以-40℃冷凍并進(jìn)行干燥處理人瓶的空間充滿氮?dú)?，并把小瓶蓋嚴(yán)。把它們的冷凍干燥產(chǎn)物分別再溶于1毫升的注射用蒸溜水中，并測(cè)試這些溶液的pH值和可溶性(清晰度)。正如表12中的結(jié)果所指出的那樣，本發(fā)明之IL-2組合物，在可溶性方面極明顯地優(yōu)于對(duì)照組。
表12pH添加劑 (mg) 調(diào)節(jié)劑 pH 可溶性 注無 無 5.4 混濁 對(duì)照谷胱甘肽 (10) 無 3.4 清晰谷胱甘肽二鈉鹽 (10) 無 9.2 混濁 對(duì)照谷胱甘肽二鈉鹽 (10) HCl＊ 4.2 清晰抗壞血酸 (10) 無 3.5 清晰抗壞血酸鈉鹽 (10) 無 6.5 微混 對(duì)照抗壞血酸鈉鹽 (10) HCl＊ 4.3 清晰＊鹽酸參考例制備非糖基化人類IL-2蛋白質(zhì)溶液1.帶有人類IL-2基因的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體DH1/pTF4被接種到50毫升液體培養(yǎng)基(pH7.0)中培養(yǎng)，其中含有1%細(xì)菌用胰化胨(Bactotryptone Difco Labratories，U.S.A)，0.5%酵母菌提取物(Bacto yeast extract.Difco Laboratories，U.S.A)0.5%氯化鈉及7微克/毫升的四環(huán)素，把它們放在一個(gè)250毫升的錐形燒瓶中，接著用搖動(dòng)法進(jìn)行過夜培養(yǎng)，溫度為37℃。然后把培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到一個(gè)5升的發(fā)酵罐中，其中裝有2.5升的M9培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中含有0.5%酪蛋白氨基酸，0.5%葡萄糖以及7微克/毫升的四環(huán)素，接著在37℃通風(fēng)攪拌培養(yǎng)24小時(shí)，然后加入3-β-吲哚-丙烯酸(25微克/毫升)。并在同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。把這樣所得到的培養(yǎng)液(2.5升)進(jìn)行離心，所收集到的細(xì)胞以-80℃冷凍并儲(chǔ)存。
2.在步驟1所得的冷凍狀態(tài)的細(xì)胞(37.5克)均勻地懸溶于500毫升的提取劑(pH7.0)中，該提取液含有濃度為7摩爾的鹽酸胍及0.1摩爾二羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，把此懸液以4℃條件攪拌7小時(shí)。將所生成的溶胞液以28000×g離心20分鐘，得到453毫升上清液。
3.在上述步驟2所得到的上清液，以0.01摩爾的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液pH8.5進(jìn)行透析，然后以19000xg離心10分鐘。這樣得到的上清液(458毫升，通過一個(gè)DE 52柱(即二乙氨基乙基纖維素52柱，柱的容積為50毫升)，并預(yù)先用0.01摩爾的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH8.5)平衡以獲得有效的蛋白質(zhì)吸咐。用一個(gè)氯化鈉的殘性濃度梯度對(duì)IL-2進(jìn)行洗脫(0～0.15摩爾氯化鈉，1升)。把有活性的組分合在一起(105毫升)，用YM-5膜(Amicon U.S.A)濃縮至10.2毫升，再用葡聚糖丙烯酰胺凝膠(Sephacry S200)(Pharmacia.Sweden)進(jìn)行凝膠過濾(柱的容積為500毫升)，該柱是0.1摩爾的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH8.0)-1摩爾氯化鈉緩沖溶液平衡的?；钚越M分(56毫升)用YM-5膜濃縮至4.9毫升。所得之濃縮物通過高效液相層析，所用的是超孔(Ultrapore)RPSC柱和三-氟乙酸-乙腈洗脫系統(tǒng)。
Ultrapore RPSC柱的大小分4.6×75cm;柱的溫度為30℃;洗脫液A為0.1%三氟乙酸-99.9%水;洗脫液B為0.1%三氟乙酸-99.9%乙腈;洗脫程序?yàn)榈?分鐘，用68%A+32%B;第25分鐘，用55%A+45%B;第35分鐘，用45%A+55%B;第45分鐘用30%A+70%B;第48分鐘用100%B;洗脫流速為0.8毫升/每分鐘，測(cè)定波長(zhǎng)為230nm。在上述條件下，在39分鐘左右出現(xiàn)停滯的活性組分被收集起來，從而得到了15毫升溶液。其中含有7.5毫克的非糖基化人類IL-2蛋白質(zhì)(特別活性為30000單位/毫克;自起始物的活性回收率為48.2%;蛋白質(zhì)純度為99%(由光密度測(cè)定法所測(cè)定)。
權(quán)利要求
1.一種制備白細(xì)胞介素-2組合物的方法，其特征在于該組合物含有人血清白蛋白，還原化合物或它們的結(jié)合物，并且作為溶液其PH值被調(diào)節(jié)為3～6，該方法包括將人血清白蛋白，還原化合物或它們的結(jié)合物混制成白細(xì)胞介素-2的水溶液并將該溶液的PH值調(diào)至上述范圍。
2.根據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的方法，其特征在于，所述的白細(xì)胞介素-2是人類白細(xì)胞介素-2。
3.根據(jù)權(quán)項(xiàng)1或2所述的方法，其特征在于，所述的白細(xì)胞介素-2是重組白細(xì)胞介素-2。
4.根據(jù)權(quán)項(xiàng)2所述的方法，其特征在于，所述的人類白細(xì)胞介素-2是非糖基化的人類白細(xì)胞介素-2。
5.根據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的方法，其特征在于，人類白細(xì)胞介素-2的特異活性為20000～80000單位/毫克。
6.根據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的方法，其特征在于，所述的白細(xì)胞介素-2是濃度為1至80000單位/毫升的水溶液。
7.根據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的方法，其特征在于，所述的組合物是不含鹽類的。
8.根據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的方法，其特征在于，所述的組合物含有人血清白蛋白。
9.根據(jù)權(quán)項(xiàng)8所述的方法，其特征在于，所述的人血清白蛋白是一種濃度為0.1至50毫克/毫升的水溶液。
10.根據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的方法，其特征在于，所述的組合物含有還原化合物。
11.根據(jù)權(quán)項(xiàng)10所述的方法，其特征在于，所述的還原化合物是酸性還原化合物。
12.根據(jù)權(quán)項(xiàng)11所述的方法，其特征在于，所述的酸性化合物是谷胱甘肽，硫辛酸，N-乙酰半胱氨酸，具有1至7個(gè)碳原子的硫代鏈烷酸或抗壞血酸。
13.根據(jù)權(quán)項(xiàng)10所述的方法，其特征在于，所述的還原化合物是濃度為0.05～20毫克/毫升的水溶液。
14.根據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的方法，其特征在于，所述的組合物包括人血清白蛋白與還原化合物的結(jié)合。
15.根據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的方法，其特征在于，所述的組合物還進(jìn)一步包括單氨基脂肪族氨基酸，環(huán)氨基酸，單糖，糖醇或它們的結(jié)合物。
16.根據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的方法，其特征在于，所述的組合物還進(jìn)一步含有單氨基脂肪族氨基酸。
17.根據(jù)權(quán)項(xiàng)16所述的方法，其特征在于，所述的單氨基脂肪族氨基酸是濃度為5至50毫克/毫升的水溶液。
18.根據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的方法，其特征在于，組合物的PH值為3至5.5。
19.根據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的方法，其特征在于，所述的組合物是水溶液形式，冰凍形式或冷凍干燥形式。
20.根據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的方法，其特征在于，所述的組合物是冷凍干燥形式的。
21.根據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的方法，其特征在于，所得的溶液經(jīng)進(jìn)一步冰凍以獲得冰凍的組合物。
22.根據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的方法，其特征在于，所得的溶液經(jīng)進(jìn)一步冷凍干燥以獲得冷凍干燥形式的組合物。
23.根據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的方法，其特征在于，所述的組合物水溶液是用酸性還原化合物，酸性氨基酸，礦物酸或有機(jī)酸緩沖液調(diào)節(jié)。
24.根據(jù)權(quán)項(xiàng)23所述的方法，其特征在于，所述的組合物水溶液是用礦物酸調(diào)節(jié)的。
25.根據(jù)權(quán)項(xiàng)23所述的方法，其特征在于，所述的組合物水溶液是用酸性還原化合物調(diào)節(jié)的。
專利摘要
本發(fā)明是一種白細(xì)胞斤素-2的組合物，它包括人體血清白蛋白，還原化合物或它們的結(jié)合物，并且溶液調(diào)至PH為3至6。本發(fā)明的組合物之特征在于，其白細(xì)胞斤素-2的活性在儲(chǔ)存，冷凍及冷凍干燥的過程中損失很小。
文檔編號(hào)A61K35/14GK85101301SQ85101301
公開日1986年7月23日 申請(qǐng)日期1985年4月1日
發(fā)明者三倉(cāng)泰, 淺田賢輔, 戶口始 申請(qǐng)人:武田藥品工業(yè)株式會(huì)社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan