細菌細胞壁提取物在制備預防,治療或排除原生動物或寄生蟲疾病的藥物組合物上的應用的制作方法

專利名稱：:細菌細胞壁提取物在制備預防,治療或排除原生動物或寄生蟲疾病的藥物組合物上的應用的制作方法相關申請的交叉參考本申請要求以1997年4月2日遞交的美國暫定申請號60/040,908為優先權。發明領域本發明涉及微生物學和免疫學領域，更具體地說涉及細菌細胞壁提取物在制備預防，治療或排除原生動物或寄生蟲疾病的藥物組合物上的應用。發明背景動物的原生動物和寄生蟲疾病是難于治療的。已經利用各種藥劑治療各種原生動物和寄生蟲疾病，成功的例子有限。在很大程度上，這些藥劑的安全性和有效性取決于給藥的途徑和原生動物或寄生蟲疾病的類型和嚴重性。巴貝蟲病是這樣的疾病的一個例子。在熱帶地區，巴貝蟲病是感染家養動物包括，但不限于，馬、牛和狗的最流行的疾病。巴貝蟲在紅細胞中寄生和增倍。受感染動物抵抗這一生物體的固有防御機制包括通過吞噬作用特別是通過巨噬細胞和毒性淋巴細胞裂解感染的紅細胞。感染馬的巴貝蟲的兩個最普通的種類是卡巴利巴貝蟲(babesiacaballi)和馬巴貝蟲。馬巴貝蟲是這兩個種類的中更有致病性的致病原。幾個載體如壁虱，蚊子和一些種類的吸盤蠅將馬巴貝蟲生物體從馬轉移到馬。巴貝蟲病的臨床現象包括發燒，不適，厭食，貧血，黃疸和血紅蛋白尿。在南美國家，估計全部賽馬的50％感染了巴貝蟲，導致賽跑性能的下降。許多藥劑已經用于治療巴貝蟲病。所以至今，利用化學治療劑咪多卡(3，3’-二-2-咪唑啉-2-基對稱二苯脲)已經獲得了最好的結果。咪多卡在治療B.卡巴利時是非常有效的，但在治療馬巴貝蟲時只有適度效果，不幸的是，以咪多卡給藥引起一些不想要的副作用如過量的分泌唾液，流淚，排便次數增加，呼吸急促和腹痛，導致毒性起源的絞痛。非常重要的是用于治療巴貝蟲病的藥物不僅減輕了疾病的癥狀，而且還能完全去除動物的感染。動物傳播巴貝蟲盡管沒有癥狀，但載體的遺留，可以將疾病傳播給健康動物，所以抑制這種傳播是必要的。血吸蟲病是感染動物的原生動物(扁蟲)疾病的一個例子，并且是一個巨大比例人群的健康問題。該疾病是感染了血吸蟲如曼氏血吸蟲，日本血吸蟲和尿路血吸蟲種類引起的。該疾病的特征是肺炎，不適，發燒，貧血，腹瀉和腹痛。大多數感染的個體經過了可能導致死亡的慢性感染的變弱的過程。已經將許多藥劑用于治療血吸蟲病。所以，至今利用藥物吡喹酮(2-(環己基碳酰基)一1，2，3，6，7-11b-六氫化-4H-吡嗪并[2，1-a]異喹啉-4-酮])已經獲得最好結果。但是，由于這一藥物不能預防再感染，所以它不能防止這一疾病的進一步轉移和傳播。旋毛蟲病是原生動物(線蟲)疾病的例子。旋毛蟲屬成員引起的旋毛蟲病感染了100多種脊椎動物，包括人，并且具有世界范圍的分布。旋毛蟲在感染的動物的大腸中引起嚴重的炎癥反應。這一炎癥反應似乎是從非特異免疫應答產生的。這一免疫應答是依賴T細胞(Miller，HRP.1984，獸醫免疫學和免疫病理學，6167)。已知原生動物和寄生蟲疾病的許多其它病例具有各種后遺癥，并且在感染的個體中導致虛弱。另外，因為在世界的一些地方，這些疾病是地方性的，導致這些地方社會和經濟發展的明顯破壞。所以，需要的是通過各種給藥途徑，將安全，有效，并且引起的副作用最小或無不利副作用的治療試劑給動物給藥，預防，治療或排除各種原生動物和寄生蟲疾病的方法。發明概要正如本文所用，術語“疾病”是指中斷或修飾動物或它的成分的性能或功能的活動物或任何它的成分的正常狀態的損傷，并且對特異的感染試劑如原生動物和寄生蟲的應答。提供了細菌細胞壁提取物在制備預防，治療或排除原生動物或寄生蟲疾病的藥物組合物上的應用。根據該應用，對動物給藥足夠的預防，治療或排除疾病量的細菌細胞壁提取物。細菌細胞壁提取物是安全的，具有最小或沒有不利的副作用，可以對動物，但不限于哺乳動物，包括人，鳥，魚，兩棲動物和甲殼動物給藥，所述動物已經感染了原生動物或寄生蟲生物體。由于免疫應答涉及整個身體并且是調節的，和受許多復合物反應的影響，非特異免疫刺激能夠加速和擴增許多免疫應答。不限于酵母，細菌，病毒，植物，生物技術和化學起源的制劑都能夠非特異地刺激免疫系統。來自但不限于分支桿菌，棒狀桿菌(丙酸桿菌)，諾卡氏菌，紅球菌，博得特氏菌，利斯特氏菌，和卡介苗(BCG)的制劑已經用于非特異地刺激免疫活性。分支桿菌，紅球菌和諾卡氏菌是優選的細菌。草分支桿菌是最優選的細菌。通過本領域已知的途徑包括，但不限于局部，口服，鼻，靜脈內，皮下，和肌肉內給藥可以給藥細菌細胞壁提取物。當給藥動物時，細菌細胞壁提取物的作用是非特異免疫刺激物。即，由于免疫應答涉及整個身體，并且是調節的，并且受許多復合物相互作用的影響，非特異免疫刺激能夠加速和擴增許多免疫應答。所以是預防，治療或排除各種原生動物或寄生生物體引起的疾病的有效治療試劑，所述原生動物或寄生生物體如但不限于，邊蟲屬，巴貝蟲屬，腸袋蟲屬，貝諾蟲屬，衣原體，球蟲，似隱孢菌(Cryptospondiun)，胞質蟲，艾美球蟲屬，內變形蟲屬，上紅蟲屬，艾利氏蟲屬(Erlichia)，賈第鞭毛蟲屬(Giardia)，血巴爾通體屬，哈芒球屬，等孢屬，利什曼蟲，新立克次氏體，瘧原蟲，肺炎球菌(Pneumocystis)，立克次氏體，血吸蟲，肉孢子蟲，泰勒氏梨漿蟲(Theileria)，旋毛蟲，弓漿蟲，毛滴蟲，錐體蟲屬，單齲蟲屬(Unicaria)，復孔絳蟲屬，棘球絳蟲屬，絳蟲，鉤蟲(Ancylostoma)，蛔蟲，蟯蟲(Enterobius)，類園線蟲，園線蟲，弓蛔蟲，弓蛔線蟲和鞭蟲屬。簡要地說，如下制備了細菌細胞壁提取物。將細菌生長在液體培養基中并且收集。裂解細菌制備細胞壁，然后離心沉降收集裂解的細菌。利用蛋白酶消化將細胞壁部分(來自離心步驟的沉淀)去蛋白質，利用去垢劑處理，洗滌和凍干。這一組分可以吸附到懸浮于適當佐劑/穩定劑的脂類小滴用于對感染動物或接觸原生動物疾病的動物給藥。本文敘述的細菌細胞壁提取物的給藥在治療血液滋生的原生動物和寄生蟲疾病中特別有用。本文敘述的細菌細胞壁提取物的給藥與傳統的治療區別在于它非特異地引起免疫系統活化。這增強了免疫系統的防御能力，從而減輕了各種原生動物和寄生蟲疾病。所以，細菌細胞壁提取物在治療動物的原生動物和寄生蟲疾病中是有效的，所述動物沒有抗感染生物體的抗體。因此，本發明的一個目的是提供細菌細胞壁提取物在制備預防或治療原生動物或寄生蟲疾病的藥物組合物中的應用。本發明的另一個目的是提供細菌細胞壁提取物在制備預防原生動物或寄生蟲疾病再現的藥物組合物中的應用。本發明的另一個目的是提供細菌細胞壁提取物在制備預防原生動物或寄生蟲疾病再感染的藥物組合物中的應用。本發明的另一個目的是提供細菌細胞壁提取物在制備排除原生動物或寄生蟲疾病的藥物組合物中的應用。本發明的另一個目的是通過排除動物中的原生動物或寄生蟲疾病來降低原生動物或寄生蟲疾病的傳播的有效的方法。本發明的另一個目的是提供刺激免疫系統的有效的方法。本發明的另一個目的是提供在受體中不引起不利的副作用包括過敏反應的方法。本發明的另一個目的是提供對受體非毒性的方法。本發明的另一個目的是提供使受體對結核菌素皮膚測試不敏感的方法。本發明的另一個目的是提供可以成功利用的各種給藥途徑的方法。在研究下列公開的實施方案和附加的權利要求的詳細說明后，本發明的這些和其它目的，特征和優點將顯而易見。發明的詳細說明本文敘述了細菌細胞壁提取物在制備預防，治療或排除動物的原生動物或寄生蟲疾病的藥物組合物中的應用。根據采用本藥物組合物的方法，對感染原生動物或寄生蟲的動物以足以預防，減弱或排除感染的量的細菌細胞壁提取物給藥。對動物，如但不限于人和其它哺乳動物，鳥，魚，兩棲動物，和甲殼動物以細菌細胞壁提取物給藥以便治療或預防原生動物或寄生蟲感染。將細菌細胞壁提取物通過本領域技術人員已知的途徑包括但不限于，局部，口服，鼻，靜脈內，皮下和肌肉內給藥。原生動物或寄生蟲感染的治療方法對于各種原生動物和寄生生物體如但不限于邊蟲屬，巴貝蟲屬，腸袋蟲屬，貝諾蟲屬，衣原體，球蟲，似隱孢菌，胞質蟲，艾美球蟲屬，內變形蟲屬，上紅蟲屬，艾利氏蟲屬，賈第鞭毛蟲屬，血巴爾通體屬，哈芒球屬，等孢屬，利什曼蟲，新立克次氏體，瘧原蟲，肺炎球菌，立克次氏體，血吸蟲，肉孢子蟲，泰勒氏梨漿蟲，旋毛蟲，弓漿蟲，毛滴蟲，錐體蟲屬，單齲蟲屬，復孔絳蟲屬，棘球絳蟲屬，絳蟲，鉤蟲，蛔蟲，蟯蟲，類園線蟲，園線蟲，弓蛔蟲，弓蛔線蟲和鞭蟲屬引起的疾病的預防，治療或排除是有效的。該方法對于治療血液滋生的原生動物和寄生蟲疾病是特別有用。采用了本文敘述的藥物組合物的方法與常規治療的區別在于非特異地刺激或導致原生動物或寄生蟲感染的動物的免疫系統的活化。這一免疫系統的活化增強了免疫系統的防御能力，從而減輕了各種原生動物和寄生蟲疾病。所以，該方法在治療預先沒有接觸和沒有抗感染生物體的抗體的動物中的原生動物和寄生蟲疾病是有效的。采用本發明的藥物組合物的治療方法在受體中沒有引起陽性結核菌素反應，甚至在重復給藥細菌細胞壁提取物時很少引起過敏應答，并且具有最小的或沒有不利的副作用。有待理解的是給藥細菌細胞壁提取物不是免疫接種過程，而是一般的刺激免疫系統的過程，所以受體自身的免疫系統可以排除原生動物或寄生蟲疾病。像這樣，本發明的采用了上述藥物組合物的原生動物和寄生蟲疾病治療方法是理想地適于治療原生動物和寄生蟲疾病的，并且提供了新的方法，該方法中沒有利用常規的藥劑或免疫接種。細菌細胞壁都提取物的制備任何細菌種類都可以用于制備本發明的細菌細胞壁提取物，包括但不限于分支桿菌，棒狀桿菌，丙酸桿菌，諾卡氏菌，紅球菌，博得特氏菌，利斯特氏菌，和卡介苗(BCG)屬。分支桿菌，紅球菌和諾卡氏菌是優選的細菌。草分支桿菌是最優選的細菌。引入本文作為參考的美國專利號4,744,984敘述了生產細菌細胞壁提取物的優選的方法。分支桿菌細胞壁提取物可以從Bioniche(London，Ontario)公司買到。簡要地說，如下制備細菌細胞壁提取物。將細菌生長在液體培養基中并且收集。通過裂解細菌然后通過離心沉降收集裂解的細菌制備細胞壁。利用蛋白酶消化利用去垢劑處理，洗滌和凍干將來自離心步驟的沉淀的細胞壁組分去蛋白質。在給藥感染動物或接觸原生動物或寄生蟲感染的動物之前，可以將這一組分吸附到懸浮于適當的佐劑或穩定劑中的脂質小滴。可替代地，使用之前可在佐劑中乳化細菌細胞壁提取物。佐劑可以是本領域技術人員已知的許多佐劑中的任何一種。優選的佐劑是油和水乳劑，可以通過混合油和細菌細胞壁提取物，加入具有去垢劑的含水緩沖液，和通過本領域技術人員已知的幾種方法中的任意一種乳化混合物制備。這些方法包括但不限于在高速混合器或Potter-Elvehjem勻漿器中勻漿，超聲波處理和微液體化。另外，可以在許多油包括但不限于礦質油(Drakeol6-VR，Penreco，Butler，PA)，角鯊烷，角鯊烯，和合成礦質油正十六烷乳化細菌細胞壁提取物。本領域技術人員將理解制備乳狀液的方法不是關鍵。油和水相的組合物，它們的比例和乳化方法的許多變化是本領域技術人員顯而易見的，并且可以在實施本發明中與細菌細胞壁提取物一起使用。將約5克和15之間的干燥，去蛋白質的細菌細胞壁加入到干燥，1升大燒杯中可以制備細菌細胞壁提取物的優選的乳狀液。在以每克細胞壁約10毫升和50毫升之間的量加入礦質油，角鯊烯、角鯊烷，或正十六烷。覆蓋懸浮液，并且混合約30分鐘，過夜。將約10毫升細胞壁/油混合物等分試樣轉移到1升大燒杯中。在每個等分試樣中加入500毫升無菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。利用M110-Y型MicrofluidicsTabletopMicrofluidizerTM在約20,000psi到30,000psi一次流量通過微液體化勻漿約6毫升到7毫升混合物等分試樣，轉移到無菌瓶中，儲藏在4℃。非強制性地，可以在細菌細胞壁提取物乳狀液中加入氫氧化鋁穩定劑。從Reheis化學公司(BerkeleyHeights，NJ)獲得以9.4％壓縮凝膠形式的氫氧化鋁，通過加入去離子水水合成1.3％氧化鋁。在它加入到細菌細胞壁提取物乳狀液中之前，在高壓滅菌器中120℃滅菌凝膠20分鐘。1升最后的乳狀液含有約900毫升乳化細菌細胞壁提取物，50毫升1.3％氧化鋁和40毫升加入的PBS。硫柳汞鈉(乙基汞硫代水楊酸鈉，西格瑪化學公司，St.Louis，MO)和抗生素包括但不限于慶大霉素和兩性霉素B可以作為防腐劑加入細菌細胞壁提取物乳狀液中。硫柳汞鈉的優選的濃度是約0.1克/每升，慶大霉素是約30微克/毫升，兩性霉素B是約2.5微克/毫升。在本應用中給藥的細菌細胞壁提取物的已知活性成分包括胞壁酰二肽和海藻糖二霉菌酸，以及可以存在于細菌的去蛋白質細胞壁主鏈中的任何未知活性成分。本發明在治療寄生或原生動物紊亂中是有效的，其中存在身體的免疫成分包括但不限于嗜中性白細胞，淋巴細胞和巨嗜細胞。雖然不愿意結合下面的假說，但認為該方法在預防，治療和排除原生動物或寄生蟲疾病中是有效的，因為感染生物體不斷接觸身體的免疫系統的細胞。另外，還認為細菌細胞壁提取物對免疫系統的這些細胞起作用以刺激細胞因子的生產增強。細菌細胞壁提取物配制和給藥利用本領域技術人員已知的配制方法可以提供藥物可接受組合物形式的細菌細胞壁提取物。例如在引入本文作為參考的H.C.Ansel等人，藥物劑量形式和藥物遞送系統，第6版(Williams和Wilkins，Philadelphia1995)中可以發現配制方法的例子。也可以利用本領域技術人員已知的其它配方。配方包括但不限于那些適于口服，直腸，尿道，眼的(包括玻璃體內，或形成層內)，鼻內，局部(包括頰和舌下)，陰道或腸胃外(包括皮下，肌肉內，靜脈內，真皮內，氣管內，和硬膜外)給藥的制劑。配方便于以常規藥物技術制備的單位劑量形式存在。這樣的技術包括導致活性成分和藥物載體或賦形劑結合的步驟。通常，通過均一地和密切地導致活性成分與液體載體或細碎的固體載體或兩者結合制備成配方，如果需要，使產品成型。不管用于在對應的免疫細胞中表現它們的載體/媒介物，該方法可以與這些成分的任何一個，所有或任何聯合一起使用，其中媒介物包括但不限于載體如脂質體，各種非降解多聚體和等滲微泵。另外，聯合成分可摻入可生物降解多聚體，以允許化合物持續釋放，在鄰近藥物遞送的地方植入多聚體是需要的。例如在Brem，等人1991，神經外科雜志，74441-446中敘述了可生物降解的多聚體和它們的用途，該文獻引入本文作為參考。適于口服給藥的本方法的配方可以以分立的單位提供，所述單位包括但不限于膠囊，扁囊劑或片劑，各含預定量的活性成分；粉末或顆粒；以水成液或非水溶液形式的溶液或懸浮液；水包油液體乳劑或油包水乳劑和大丸藥。片劑可通過壓制或模壓非強制性地用一種或幾種必需的成分制成。通過用合適的機械壓縮可制備壓制片劑。可以將自由流動形式的活性成分如粉末或顆粒非強制性地與粘合劑，潤滑劑，惰性稀釋劑，防腐劑，表面活性或分散劑混合。通過用適當的機器模壓用惰性液體稀釋劑濕潤的粉末化合物的混合物可以制成模制片劑。片劑可以非強制性地被包衣或標記，并且經過配制以提供其活性成分緩慢的或控制釋放。適于在口腔局部給藥的本發明的配方包括含有調味組分，通常是蔗糖和金合歡油或黃氏膠的成分的錠劑，含有惰性組分如明膠和甘油，或蔗糖和金合歡油的活性成分的錠劑；和含有以適當的液體載體給藥的活性成分的漱口劑。適于皮膚局部給藥的本方法的配方可以如本領域技術人員已知的這樣的載體中含有活性成分的乳化劑，軟膏，奶液，凝膠，洗液和膏劑形式提供。用于直腸給藥的本方法的配方可以以含有活性成分與適當組分例如可可黃油或水楊酸的栓劑提供。其中載體是固體的適于鼻內給藥的本方法的配方，包括具有粒輕例如在范圍20到500微米的粗粉末，它的給藥方式是嗅，即通過從靠近鼻的粉末的容器中經鼻通道快速吸入給藥。對于給藥的其中載體是液體的適當的配方，如鼻用噴霧劑或鼻用滴劑包括活性成分的水溶液或油溶液。適于陰道給藥的本方法的配方可以是陰道藥栓，棉塞，奶液，凝膠，膏劑，泡沫或噴霧劑配方形式提供，所述制劑除了活性成分另外含有如本領域已知適當的載體。適于腸胃外給藥的配方包括水溶液和非水溶液無菌注射溶液，所述溶液可以含有抗氧化劑，緩沖液，制菌劑和使配方與目的受體的血液等滲的溶質，可以包括含水和非含水的無菌懸浮液，其中包括懸浮劑和增稠劑。腸胃外給藥的配方可以單位劑量或多個劑量容器存在，例如在封口的安瓿和小瓶中，并且可以儲藏在只需要在使用之前加入無菌液體載體，例如注射用水的冷凍干燥(凍干)條件下。即時注射的溶液和懸浮液可以從無菌粉末，顆粒和前面敘述的種類的片劑制備。待給藥的細菌細胞壁提取物的最適劑量根據待處理的動物的大小和給藥的方法而變化。只需要足以刺激免疫系統的量。單個劑量是約0.01到10毫克細菌細胞壁提取物/毫升，更優選地從約0.05到6毫克細菌細胞壁提取物/毫升和最優選地是約0.1到4.0毫克細菌細胞壁提取物/毫升。細菌細胞壁提取物以總體積約0.01到10毫升，更優選地從約0.05到7.5毫升，最優選地是從約0.1到5.0毫升的量給藥。本應用的細菌細胞壁提取物可以對同樣的受體給藥一次或多次。通過本領域的技術人員可以容易地確定劑量和劑量供應方式。優選的劑量配方是那些含有一個劑量或單位，亞劑量或亞單位的那些，或在不限于本文公開的配方中的細菌細胞壁提取物的其它部分。另外，應該理解除了本文特別提到的成分，本方法可以包括涉及待利用的配方類型的本領域的常規其它試劑。下面的實施例用于進一步解釋本發明而同時不構成任何限制。實施例1制備草分支桿菌細胞壁提取物正如實施例l中概括的草分支桿菌細胞壁提取物的制備是從其它細菌種類制備細胞壁提取物的代表。從實驗生物學和醫學研究院，Borstel，西德獲得草分支桿菌，并且以懸浮液形式儲藏在-60℃的無菌牛奶中。在1976和1985之間約11次轉移分離物而沒有任何修飾細胞壁的生物活性的減小。在Petragnani培養基上培養草分支桿菌(Difco實驗室，Detroit，MI)。利用XL2015型熱系統超聲波處理器(前面稱為Branson超聲波處理器)制備草分支桿菌細胞壁。約將400克潮濕細胞團放置于容量約為1200毫升的清潔混合器中。在30到60秒的時間內高速混合細胞團。在混合后，在細胞混合物中加入6毫升吐溫80和200到400毫升之間的無菌水。然后在混合器中以低速將全部細胞懸浮液混合約10秒。利用熱系統超聲波處理器和3/4角制杯(tappedhorn)超聲波細胞裂解完成細胞裂解。將其中細胞含有約50％到70％體積的500毫升細胞懸浮液放置于1升大燒杯中，在設定8上超聲波處理約5分鐘。將超聲波處理物在分級分離過程中儲藏在冰上的無菌燒瓶中。將超聲波處理物轉移到250毫升離心瓶中，在具有GSA離心管的中速離心機中，在15℃，以27,500×g離心1小時。潷去和丟棄來自離心的上清液液體。丟棄最下的，未破碎的細胞的白色沉淀。將沉降的粗細胞壁部分轉移到混合器中，并且通過在低速混合懸浮于無菌，去離子水中。通過再懸浮和在15℃在27,500×g離心1小時洗滌粗制細胞提取物組分。再次，丟棄最下的未破碎的細胞的白色沉淀。在洗滌粗細胞壁組分后，在無菌，去離子水中再懸浮沉淀，并且在350×g離心5分鐘沉降未破碎的細胞，而在上清液液體中保留細胞壁。潷去上清液液體，并且在15℃在27,500×g離心1小時沉降粗細胞壁部分。利用蛋白酶消化將粗細胞壁組分分去蛋白。將起源于約400克完全細胞的粗細胞壁組分通過在低速混合再懸浮于1升0.05摩爾/升的Tris-HCl，pH7.5。在粗細胞壁組分完全再懸浮于Tris緩沖液后，加入50毫克胰蛋白酶(胰腺蛋白酶，西格瑪化學公司，St.Louis，MO)，利用磁性攪拌棒在35℃攪拌懸浮液6小時。在胰蛋白酶處理后，在每升胰蛋白酶處理的細胞壁懸浮液中加入50毫克鏈霉蛋白酶(灰色鏈霉菌蛋白酶，西格瑪化學公司，St.Louis，MO)。利用磁性攪拌棒在35℃攪拌懸浮液12到18小時。利用去垢劑和苯酚處理蛋白酶消化的細胞壁組分。在每升細胞壁懸浮液中，加入60克(J.T.Baker化學公司，Phillipsburg，NJ)，2.0毫升100％TritonX-100(聚氧化乙烯醚，西格瑪化學公司，St.Louis，MO)，和100克苯酚結晶(Fisher科學公司，FairLawn，NJ)。利用鋁箔松弛覆蓋含有懸浮液的燒瓶，加熱到60-80℃，攪拌1小時。在16,000×g在GSA離心管中離心去蛋白質細胞壁部分10分鐘。潷去和丟棄上清液部分，利用可任意處置的吸管移出沉淀下面的暗色液體。通過在約1升無菌水中再懸浮將細胞壁沉淀洗滌3次，并且在GSA離心管中在16,000×g離心10分鐘。轉移懸浮液到具有小量去離子無菌水凍干燒瓶凍干經洗滌，修飾的分支桿菌細胞壁提取物(MCWE)或細胞壁沉淀。每30克濕細胞壁起始物質利用一個300毫升的凍干燒瓶。在已經利用固體二氧化碳冷凍的乙醇中旋轉燒瓶冷凍使細胞壁懸浮液剝落。在冷凍燒瓶的內容物后，將燒瓶連接到凍干儀器(Virtis公司，Gardiner，NY)和凍干。在凍干后，將樣品轉移到無菌，有螺旋帽的容器中，在含有無水硫酸鈣的干燥瓶中在-20℃儲藏。實施例2細菌細胞壁提取物的乳化分四個步驟制備分支桿菌細胞壁提取物(MCWE)的乳化劑(1)將干燥，去蛋白質的分支桿菌細胞壁提取物和角鯊烷加入到乳化容器中，(2)在油中懸浮細胞壁提取物，(3)在細胞壁提取物和油的混合物中加入含有去垢劑的緩沖鹽溶液，和(4)將油細胞壁提取物混合物乳化成為含水去垢劑鹽溶液。利用M-110Y型Microfluidicstabletopmicrofluidizer以10,700-23，000psi一次流量通過微液體化完成乳化。典型的體積流動是每次流動6到7升。在干燥，無菌，1升大燒杯中加入幾克凍干MCWE(如上述實施例1中所述制備)。以每克MCWE20毫升的濃度加入角鯊烷，覆蓋混合物，并且允許停留過夜。油和水懸浮液中油的最適濃度在約1％和7％之間。將10毫升油MCWE混合物的等分試樣轉移到無菌的1升大燒杯中。在每10毫升等分試樣的油MCWE中加入500毫升無菌，磷酸鹽緩沖鹽水(0.05摩爾/升磷酸鈉，pH7.2，9克NaCl，和2毫升吐溫80/每升去離子水)。通過微液體化勻漿混合物和轉移到無菌，帶帽的瓶中儲藏在4℃。在光學顯微鏡的蓋玻片下檢測乳狀液樣品以便證實油滴是小的，并且顆粒的外觀因邊界暗不清楚。出現小滴的顆粒表明細胞壁正確吸附到油載體。在無菌混合容器中合并瓶裝水包油乳狀液中的細胞壁制劑，并且肌肉內使用，在每升細胞壁乳狀液中加入50毫升的1.3％氧化鋁，50毫升磷酸鹽緩沖鹽水，30微克/毫升慶大霉素和2.5微克/毫升兩性霉素B作為防腐劑。利用FilamaticVialFiller(國家儀器公司，Baltimore，MD)無菌空氣層流條件下將1.5毫升到10毫升穩定乳狀液充滿無菌1型玻璃小瓶和塑料針筒。小瓶和針筒蓋上帽子，封口和儲藏在4℃。實施例3利用MCWE治療馬巴貝蟲馬的治療在本研究中，利用了在補充固定測試中馬巴貝蟲陽性的5匹母馬。在72小時的間隔肌肉內給予一匹母馬四個劑量的4毫克/公斤咪多卡。約14天間隔肌肉內注射給予四匹母馬兩個劑量的1500克MCWE(如上面實施例2中所述制備)。在給藥MCWE后24小時的期間每6小時監測一次每個動物的體溫。體溫增加從不超過1.0℃到1.2℃，并且在18到24小時內是正常的。母馬1-咪多卡在利用咪多卡治療之前，在1/20稀釋度時母馬1具有馬巴貝蟲抗體效價++++。在利用咪多卡治療后6個月，母馬1再次測試對馬巴貝蟲呈陽性。母馬2-MCWE母馬2在利用MCWE治療之前，在1/5稀釋度時馬巴貝蟲抗體效價是+。在利用MCWE治療后6個月，測試的母馬2對馬巴貝蟲呈陰性。母馬3-MCWE在利用MCWE處理之前，在1/20稀釋度時母馬3具有馬巴貝蟲抗體效價為++++。在利用MCWE治療5個月后，測試的母馬3對馬巴貝蟲呈陰性。母馬4-MCWE在利用MCWE治療之前，在1/5的稀釋度時母馬4具有的馬巴貝蟲抗體效價為+++。在利用MCWE治療后3個月，測試的母馬4對馬巴貝蟲呈陰性。母馬5-MCWE在利用MCWE治療之前，在1/40稀釋度時母馬5具有的馬巴貝蟲抗體效價為++++。在利用MCWE治療后3個月，測試的母馬5對馬巴貝蟲呈陰性。牛的治療在這一研究中利用20頭馬巴貝蟲呈陽性的母牛。在Medellin，哥倫比亞畜牧學校利用肌肉內MCWE(按實施例2敘述制備)治療動物。在MCWE治療后，測試動物對馬巴貝蟲呈陰性。這些數據顯示MCWE是治療馬巴貝蟲，和從動物中排除馬巴貝蟲有效的治療試劑。實施例4利用MCWE治療錐蟲病在這一研究中利用感染了錐蟲病的30頭馬。將馬分成三組，并且利用醋尿酸重氮氨苯脒(diminazine)MCWE(按實施例2中所述制備)或MCWE(按實施例2中所述制備)加醋尿酸重氮氨苯脒肌肉內治療馬。單獨MCWE和MCWE加醋尿酸重氮氨苯脒在排除馬中的錐體蟲時是同樣有效的。單獨醋尿酸重氮氨苯脒與MCWE或MCWE加醋尿酸重氮氨苯脒相比在排除馬中的錐體蟲的效果低些。這些數據顯示MCWE是治療錐蟲病和排除動物中的錐蟲的有效治療試劑。實施例5利用MCWE治療里氏埃里希氏體在這一研究中，利用單個劑量的MCWE治療感染了里氏埃里希氏體的馬。在治療的4天內，動物從里氏埃里希氏體感染中恢復。利用常規的藥劑，恢復時間通常為2到3星期。這些數據顯示MCWE是治療錐蟲里氏埃里希氏體的有效的治療試劑。實施例6用MCWE治療曼氏血吸蟲(S.mansoni)病在這一研究中利用了6星期大的C57BL/5小鼠(CharlesRiver，Quebec)。將小鼠分成4組，并且如表1所示治療。表1治療組C＝曼氏血吸蟲尾蚴，從Biomphalariaglabrata螺(Lowell大學，Lowell，MA)收集，濃縮和計數。在小鼠的腹腔皮下注射溶于0.1毫升鹽水中的200曼氏血吸蟲尾蚴等分試樣。M＝MCWE，在角鯊烷和水中乳化(如上面實施例2中所述制備)，以劑量0微克，20微克，或100微克腹膜內注射到小鼠。T＝終止。通過頸錯位殺死小鼠，從每個小鼠回收蟲，確定它們的數目和性別。表2顯示了在感染的小鼠中MCWE對蟲負載量的影響。表2MCWE對曼氏血吸蟲蟲負載量的影響*如學生t-測試確定的顯著性在圓括號中表明了每個組的小鼠的數目和標準誤差。如[對照蟲一實驗蟲]/對照蟲×100％計算a蟲的減少。*如學生t-測試確定的顯著性。在組1(接觸后)，對照(A)小鼠的蟲負載量，20微克MCWE(B)處理小鼠和100微克MCWE處理(C)的小鼠沒有明顯不同。在組2(接觸后)，在20微克MCWE處理(B)小鼠蟲負載量中有明顯減少，但在100微克MCWE處理(C)小鼠時不明顯。在組3(接觸前)，在20微克MCWE處理(B)小鼠和100微克MCWE處理(C)小鼠中蟲負載量明顯減少。在組4(接觸前和接觸后)，在100微克MCWE處理(C)小鼠蟲負載量有明顯減少，但在20微克MCWE處理小鼠中不明顯。這些數據證明在利用血吸蟲屬曼氏血吸蟲感染之前和之后，給藥MCWE明顯減少蟲負載量。在尾蚴攻擊之后，確定組IV(接觸前和接觸后)的小鼠的生存率。在16星期感染后，組IV-A小鼠(PBS)的生存率是55％，組IV-B小鼠(20微克MCWE)是80％，和組IV-C小鼠(100微克MCWE)是85％。這些數據證明MCWE對曼氏血吸蟲感染的小鼠的生存率具有明顯的效果，并且這個效果是依賴劑量的。這些數據顯示了MCWE是治療血吸蟲屬曼氏血吸蟲的有效治療試劑。實施例7利用MCWE預防旋毛蟲(Trichinellaspiralis)感染在這一研究中，將28個重20-25克的無寄生蟲的近親交配NIH雌性小鼠分成四組。組FCA腹膜內接受溶于0.1毫升磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，pH7.2中的0.1毫升弗氏完全佐劑(西格瑪化學公司，St.Louis，MO)。組ConA腹膜內接受20微克ConconavalinA(西格瑪化學公司，St.Louis，MO)。組MCWE腹膜內接受100微克MCWE(實施例II)。對照組腹膜內接受0.1毫升PBS。7天后，利用300個感染性的旋毛蟲幼蟲口服感染每個動物。42天后，殺死動物，并且確定了每克肌肉組織中幼蟲的數目。利用ANOVA進行統計分析。表3顯示了在組FCA，組ConA，組MCWE和對照組在利用旋毛蟲感染后42天每克肌肉組織中幼蟲的數目。表3每克肌肉幼蟲數目這些數據顯示對比對照小鼠組，組ConA和組MCWE小鼠組中每克肌肉組織中幼蟲明顯減少。在對照組和FCA小鼠組之間每克肌肉組織幼蟲沒有明顯減少。這些數據顯示MCWE是預防旋毛蟲感染的有效的治療試劑。實施例8制備馬紅球菌細胞壁提取物(RCWE)如實施例1制備以前命名為馬棒狀桿菌的棒狀桿菌生物體馬紅球菌細胞壁提取物。實施例9馬紅球菌細胞壁提取物(RCWE)的免疫刺激特性利用溶于正常鹽水乳狀液中的0.5毫升2％油中的200微克RCWE腹膜內注射32個CD1遠交小鼠(RCWE小鼠)。利用0.5毫升正常鹽水(鹽水對照小鼠)腹膜內注射16個CD1遠交小鼠并且8個CD1小鼠維持為環境對照(環境對照小鼠)。在72小時后，利用出血敗血性巴斯德氏菌的5XLD50攻擊16RCWE小鼠和8個鹽水對照小鼠并且利用腦心肌炎(EMC)病毒的20XLD50攻擊16RCW小鼠和8個鹽水對照小鼠。在攻擊后14天，10/32RCWE小鼠，0/16鹽水對照小鼠和8/8環境對照小鼠存活。這些數據證明RCWE是非特異免疫刺激劑。實施例10RCWE和MCWE刺激氧化氮的產生在24孔組織平板中平板培養小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞。當細胞形成融合的單層，從孔中除去培養基，利用含有5-80微克RCW或5-80微克MCW的新鮮培養基1ml取代。在含有5％CO2的大氣中37℃溫育24小時后，利用Griess的比色反應確定氧化氮(NO)的產生(Griess，P.DemerkungenzuderAbhandlungderHH.WesdlskyundBenedikt.UEBEREINIGEAZOVERDINDUNGEN.Chem.Ber.12426-428，1987)。表4平均氧化氮(NO)的生產率(nMo1/106細胞/24小時)1針對RCWE的所有樣品的平均值2針對MCWE的所有樣品的平均值表4中的數據證明非特異免疫刺激劑RCWE在促進由RAW264.7細胞產生NO時與MCWE非特異刺激劑具有同樣的非特異免疫刺激特性。瘡皰丙酸桿菌的細菌細胞制劑(Eqstim，Immunomed，Florida)，卡介苗(BCG)，百日咳博得特氏菌和其它博得特氏菌種類以及麻疹病毒產物RVI(Eudaemonic，Omaha，NE)已經用作非特異免疫刺激劑，并且具有與非特異免疫刺激劑RCWE和MCWE相似的非特異免疫刺激特性。利用非特異免疫刺激劑MCWE獲得的結果可作為利用其它非特異免疫刺激劑獲得的結果的代表。當然，應該理解的是前面的內容只涉及本發明的優選實施方案，正如附加的權利要求中所述，不脫離本發明的精神和范圍，可以制備許多改進或更替方案。權利要求1.細菌細胞壁提取物在制備用于刺激動物的免疫系統以預防原生動物或寄生蟲疾病的藥物組合物中的應用。2.根據權利要求1所述的應用，其中細菌細胞壁提取物選自包括分支桿菌細胞壁提取物和紅球菌細胞壁提取物的組。3.根據權利要求2所述的應用，其中分支桿菌種類是草分支桿菌。4.根據權利要求2所述的應用，其中紅球菌種類是馬紅球菌。5.根據權利要求1所述的應用，其中動物的疾病是選自包括邊蟲屬，巴貝蟲屬，腸袋蟲屬，貝諾蟲屬(Besnoitia)，衣原體，球蟲，似隱孢菌(Cryptospondium)，胞質蟲，艾美球蟲屬，內變形蟲屬，上紅蟲屬，艾利氏蟲屬(Erlichia)，賈第鞭毛蟲屬(Giardia)，血巴爾通體屬，哈芒球屬，等孢屬，利什曼蟲，新立克次氏體，肺炎球菌(Pneumocystis)，瘧原蟲，立克次氏體，血吸蟲，肉孢子蟲，泰勒氏梨漿蟲(Theileria)，旋毛蟲，弓漿蟲，毛滴蟲，錐體蟲屬，單齲蟲屬(Unicaria)，復孔絳蟲屬，棘球絳蟲屬，絳蟲，鉤蟲(Ancylostoma)，蛔蟲，蟯蟲(Enterobius)，類園線蟲，園線蟲，弓蛔蟲，弓蛔線蟲和鞭蟲屬的組中的生物體引起的。6.根據權利要求5所述的應用，其中動物的疾病是由選自包括旋毛蟲，巴貝蟲屬，錐體蟲屬，立克次氏體和血吸蟲的組的生物體引起。7.細菌細胞壁提取物在制備用于刺激動物的免疫系統以治療原生動物或寄生蟲疾病的藥物組合物中的應用。8.根據權利要求7所述的應用，其中細菌細胞壁提取物選自包括分支桿菌細胞壁提取物和紅球菌細胞壁提取物的組。9.根據權利要求8所述的應用，其中分支桿菌種類是草分支桿菌。10.根據權利要求8所述的應用，其中紅球菌種類是馬紅球菌。11.根據權利要求7所述的方法，其中動物疾病是由選自包括邊蟲屬，巴貝蟲屬，腸袋蟲屬，貝諾蟲屬，衣原體，球蟲，似隱孢菌，胞質蟲，艾美球蟲屬，內變形蟲屬，上紅蟲屬，艾利氏蟲屬，賈第鞭毛蟲屬，血巴爾通體屬，哈芒球屬，等孢屬，利什曼蟲，新立克次氏體，肺炎球菌，瘧原蟲，立克次氏體，血吸蟲，肉孢子蟲，泰勒氏梨漿蟲，旋毛蟲，弓漿蟲，毛滴蟲，錐體蟲屬，單齲蟲屬，復孔絳蟲屬，棘球絳蟲屬，絳蟲，鉤蟲，蛔蟲，蟯蟲，類園線蟲，園線蟲，弓蛔蟲，弓蛔線蟲和鞭蟲屬的組中的生物體引起的。12.根據權利要求11所述的應用，其中動物疾病是由選自包括旋毛蟲，巴貝蟲屬，錐體蟲屬，立克次氏體和血吸蟲的組的生物體引起。13.細菌細胞壁提取物在制備用于刺激動物的免疫系統以消除原生動物或寄生蟲疾病的藥物組合物中的應用。14.根據權利要求13所述的應用，其中細菌細胞壁提取物是選自包括分支桿菌種類細胞壁提取物和紅球菌種類細胞壁提取物的組。15.根據權利要求14所述的應用，其中分支桿菌種類是草分支桿菌。16.根據權利要求14所述的應用，其中紅球菌種類是馬紅球菌。17.根據權利要求13所述的應用，其中疾病是利用選自包括邊蟲屬，巴貝蟲屬，腸袋蟲屬，貝諾蟲屬，衣原體，球蟲，似隱孢菌，胞質蟲，艾美球蟲屬，內變形蟲屬，上紅蟲屬，艾利氏蟲屬，賈第鞭毛蟲屬，血巴爾通體屬，哈芒球屬，等孢屬，利什曼蟲，新立克次氏體，肺炎球菌，瘧原蟲，立克次氏體，血吸蟲，肉孢子蟲，泰勒氏梨漿蟲，旋毛蟲，弓漿蟲，毛滴蟲，錐體蟲屬，單齲蟲屬，復孔絳蟲屬，棘球絳蟲屬，絳蟲，鉤蟲，蛔蟲，蟯蟲，類園線蟲，園線蟲，弓蛔蟲，弓蛔線蟲和鞭蟲屬的組中的生物體引起的。18.根據權利要求17的應用，其中動物疾病是由選自包括旋毛蟲，巴貝蟲屬，錐體蟲屬，立克次氏體和血吸蟲的組的生物體引起。專利摘要細菌細胞壁提取物在制備用于刺激動物的免疫系統以預防、治療或排除原生動物或寄生蟲疾病的藥物組合物中的應用。細胞壁提取物優選地是分支桿菌細胞壁提取物或棒狀桿菌細胞壁提取物。細胞壁提取物最優選的是草分支桿菌細胞壁提取物。文檔編號A61P17/02GKCN1153574SQ98803893公開日2004年6月16日申請日期1998年4月2日發明者斯坦利·J·奧爾克梅德,斯坦利J奧爾克梅德,E希爾德布蘭德,凱瑟琳·E·希爾德布蘭德,C菲利普斯,奈杰爾·C·菲利普斯,R羅根,德拉貢·R·羅根申請人:比奧尼斯生命科學公司導出引文BiBTeX,EndNote,RefMan