專利名稱:磁性分子靶向超聲造影劑微球及其制備方法
磁性分子靶向超聲造影劑微球及其制備方法
發明領域
本發明涉及的是一種具有磁性的新型分子靶向超聲造影劑，即具有磁性的包裹氟碳類不溶性氣體的脂質體微球，微球表面裝配有對靶分子具有特異親和力的配體，并涉及其組分和制備方法。磁性的靶向超聲造影劑包括造影劑微球的脂質層中和/或造影劑微球的脂質層的表面連接有磁響應材料的情況。
發明背景
早在許多重要疾病出現明顯臨床表現之前，在細胞和分子水平均已存在明顯的病理生理改變，并且貫穿于疾病的全過程。因此，從分子水平評價各種疾病病變組織和器官的病理影像特征，無疑將具有非常重大的臨床價值。超聲分子影像技術是應用對靶分子有特異親和力的靶向性超聲微泡作為示蹤劑，這種靶向性超聲微泡既具有與紅細胞相似的流變學特征，可順利的通過組織微循環又可與特異性靶向分子有效的結合，通過對粘附在血管內皮細胞特異靶向分子上的靶向性微泡進行超聲對比成像，從而實現特異性地評價血循環內皮細胞上分子學變化(或血循環內固定的靶分子)的目的。同時，與臨床其它無創影像技術比較，超聲影像具有無輻射及價格低廉等獨特的優點，因此超聲分子影像技術是評價血循環內固定的靶分子變化的理想手段，具有廣泛的應用前景，而且其與超聲發射相結合在治療方面也有良好的應用前景。
毫無疑問，要實現靶向超聲分子成像必須要有一定數量的特異靶向性超聲微泡與組織細胞靶分子有效結合。然而，按目前國內外專利公開的制備方法、組分和工藝(例如a、國際專利申請號PCT/US00/01277/公開號W000/42988 ；b、國際專利申請號PCT/ US2003/021712/ 公開號 W02004/006964A1 ；C、國際專利申請號 PCT/US98/10745/ 公開號 W098/53857 ；d、國際專利申請號 PCT/US2008/004358/公開號 W02008/150326 ；e、中國專利申請號03114567. 1/公開號CN1438037A ；f、中國專利申請號200610105195. 1/公開號 CN 1985996A ；g、中國專利申請號02133720. 9/公開號CN 1404878A ；h、中國專利申請號 2008100069831. 9/ 公開號 CN 101314049A ；i、中國專利申請號 200510127996. 3/ 公開號 CN 1814305A。)所構建的靶向性超聲微泡，以及文獻報道的靶向性超聲微泡僅能與血流速度慢、切應力小(< ldyne/cm2)的微循環(通常是微靜脈)上的靶向分子有效結合，難以與血流速度快、切應力大(> ldyne/cm2)的動脈系統(尤其是大中動脈)上的靶向分子有效結合，難以實現動脈部位的超聲分子成像。
其主要原因是①在血管中，靶向超聲微泡與紅細胞一樣具有趨向管腔中軸分布的特性，即“軸流現象”，尤其是在血流速度快的動脈系統。靶向超聲微泡的軸向分布趨勢使得其與血管內皮上的靶分子接觸的機會大大降低，從而阻礙和減少了靶向超聲微泡與血管內皮上靶分子的結合；②動脈系統(尤其是大中動脈)的血流速度快、切應力大，使得靶向微泡與靶分子結合的時間短，靶向微泡與靶分子尚未形成牢固結合前就被沖刷走。
鑒于上述原因，要實現動脈系統的超聲分子成像的策略應該是①使靶向超聲微泡與血管內皮上的靶分子有足夠的接觸時間，使靶向微泡與靶分子之間形成牢固的結合， 抵抗高血流剪切應力的沖刷；②使靶向超聲微泡向管壁趨附，增加其與血管內皮上的靶分子接觸的機會。為此，近年來人們進行了不懈的努力獲得了一些成功，例如最近Weller等巧妙的提出了“雙配體”連接技術，同時將抗小鼠VCAM-I或抗人ICAM-I單抗和P-SLex連接在同一微泡上。平行板流動腔實驗顯示，通過快速結合配體一P-SLex的介導，這種攜帶雙配體的靶向性微泡在高速流動的狀態下，可以與包被人內皮細胞ICAM-I抗原的平行板形成穩定結合，然而用其在活體動物中進行大中動脈內病變的超聲分子成像，成像效果尚不理想。另外，從理論上說攜帶“雙配體”的靶向超聲微泡沒有改變超聲微泡的軸向分布趨勢， 沒有增加靶向超聲微泡與血管內皮上的靶分子接觸的機會，因此，該技術也存在明顯不足。
磁性靶向導航技術已廣泛用于藥物靶向釋放及腫瘤治療。既往研究顯示在足夠強的磁場和磁場梯度下，通過磁性靶向載體能將使藥物在所預定的部位聚集，并有較多相關的專利公開，例如a、中國專利申請號200610081252. 7/公開號CN 101077417A ;b、中國專禾IJ 申請號03150818. 9/公開號CN 1522763A ；C、中國專利申請號200610104757. 0/ 公開號 CN 101164621A。
是否能將磁性靶向導航的理念引入靶向超聲微泡的制備中，進而改善動脈系統的靶向超聲分子成像？從理論上說是可行的，第一，攜帶磁粒和配體的靶向性超聲微泡在磁場力的作用下，通過磁性導航可以改變靶向性超聲微泡在大中動脈中的軸向分布特征，弓丨導靶向性超聲微泡向成像目標(動脈)的管壁貼近，增加靶向性超聲微泡與血管內皮上的靶分子接觸的機會，進而有助于實現動脈部位的靶向超聲分子成像；第二，山于增加了靶向性超聲微泡與血管內皮上的靶分子接觸的機會，故而可以減少靶向性超聲微泡應用劑量。 在這樣的背景下，經過不懈探索，我們發明和成功研制出了一種具有磁性的新型分子靶向超聲造影劑，并包括其組分和制備方法，應用這種新型分子靶向超聲造影劑可實現動脈和靜脈系統的超聲分子成像，并且其與超聲發射相結合在治療方面也有良好的應用前景。
發明內容
本發明的目的是提供一種穩定性好、微泡粒徑適宜、靶向顯影效果佳、可用于評價動脈和靜脈系統血管內皮分子變化的分子靶向超聲造影劑及合理的制備方法。
本發明的磁性氣乳劑型分子靶向超聲造影劑，為平均直徑1 4微米的包裹氣體的脂質體磁性微球混懸液，由含脂質體的成膜材料包裹生物相容的水不溶性氣體構成，微球的脂質層內或表面連接有磁響應材料，且微球表面裝配有特異性的配體(單克隆抗體、 多肽或多糖等)，溶劑為水介質(蒸餾水)。
上述磁響應材料，包括造影劑微球的脂質層中含有磁響應材料(包括磁珠或脂質體磁珠等)和/或造影劑微球的脂質層的表面連接有磁響應材料(包括聚乙二醇聚合磷脂磁珠或親和素磁珠)的情況。最好是選用磷脂磁珠或親和素磁珠，如此微球的磁性穩定和易于控制，磷脂磁珠含量以0. 004 0. 2重量％為最佳，或親和素磁珠含量以0. 004 0. 1重量％為最佳。
上述特異性的配體，包括單克隆抗體、多肽或多糖等。通常采用單克隆抗體和多肽，因它們的特異性好和靶向結合效能高。生物素化的單克隆抗體含量以0. 002 0. 1重量％為最佳，多肽(多肽修飾的PEG聚合磷脂)含量以0. 01 0. 4重量％為最佳。
上述同時攜帶磁粒和配體的靶向性超聲微泡在磁場力的作用下，通過磁性導航可以改變靶向性超聲微泡在大中動脈中的軸向分布特征，引導靶向性超聲微泡向成像目標(動脈)的管壁貼近，增加靶向性超聲微泡與血管內皮上的靶分子接觸的機會，進而有助于實現動脈部位的靶向超聲分子成像。
上述溶劑為蒸餾水。
本發明的磁性氣乳劑型分子靶向超聲造影劑，該超聲造影劑球壁材料還包括磷月旨、聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇聚合磷脂、生物素化的PEG聚合磷脂或多肽修飾的PEG聚合磷月旨、泊洛沙姆。
上述磷脂選自卵磷脂，大豆磷脂，大豆卵磷脂，磷脂酰膽堿，磷脂酰乙醇胺，磷脂酸，磷脂酰絲氨酸和磷脂酰甘油，上述磷脂為人體天然細胞膜成分，無毒，無免疫原性。其中，最好是選用卵磷脂，原料易得，成本低，含量以0. 02 0. 5重量％為最佳。
上述聚乙二醇聚合磷脂包括聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)，聚乙二醇-磷脂酰膽堿(PEG-PC)，最好是選用PEG2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。聚乙二醇(PEG)聚合磷脂含量以0. 001 0. 04重量％為最佳。
上述聚乙二醇(PEG)含量為0. 05 2. 0重量％。PEG的加入，使微球表面被柔順而親水的聚乙二醇長鏈覆蓋，能有效地阻止血液中許多不同組分特別是調理素對微球的吸附，從而降低了單核吞噬細胞對微球的親和力，延長了微球在血液循環中的駐留時間。
上述生物素化的PEG聚合磷脂，最好是選用PEG4000- 二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺-生物素，其含量以0. 01 0. 2重量％為最佳。生物素化的PEG聚合磷脂的加入，是為了與鏈親和素結合，進而通過親和素橋連方式，將生物素化單克隆抗體連接到微泡表面。
上述多肽修飾的PEG聚合磷脂，其含量以0. 01 0. 4重量％為最佳。
上述泊洛沙姆含量以0. 004 0. 2重量％為最佳。泊洛沙姆的加入，有利于氣乳劑微球的形成和穩定。
本發明的磁性氣乳劑型分子靶向超聲造影劑，被包裹在微球中的氣體在造影劑中發揮超聲反射層的功效。所述氣體為生物相容的水不溶性氣體，選自全氟甲烷、全氟乙烷、 全氟丙烷、全氟丁烷、全氟環丁烷、全氟戊烷和六氟化硫，優選全氟丙烷氣體。全氟丙烷沸點低，在常溫下為氣體，不溶于水，不易從微球中逸出，可保持微球在水性介質中的完整性。全氟丙烷無毒，為生物惰性氣體，可安全應用于人體。
1、本發明的上述超聲造影劑的制備方法之一如下
(1)將磷脂、聚乙二醇(PEG)、PEG聚合磷脂、多肽修飾的PEG聚合磷脂、磷脂磁珠、 泊洛沙姆加入水介質(蒸餾水)中以50 80°C充分溶解和混勻；
(2)將將氟碳氣體通入步驟(1)所述溶液；然后，
a)應用超聲波處理器超聲振蕩處理溶液和氣體的混合物使混合物乳化，形成粒徑合乎要求的包裹氣體的微球混懸液；
或b)應用剪切設備處理溶液和氣體的混合物，通過機械剪切力作用使混合物乳化，形成粒徑合乎要求的包裹氣體的微球混懸液；
(3)通過以上步驟(1)和O)，可獲得包裹氣體的微球混懸液；
(4)將以上步驟( 所獲微球混懸液靜置24h后，棄掉下清液并加入等量蒸餾水洗滌、純化3次，即可獲得含多肽的磁性靶向超聲造影劑混懸液。
2、本發明的上述超聲造影劑的制備方法之二如下
(1)將磷脂、聚乙二醇(PEG)、PEG聚合磷脂、生物素化的PEG聚合磷脂、磷脂磁珠、泊洛沙姆加入水介質(蒸餾水)中以50 80°C充分溶解和混勻；
(2)將將氟碳氣體通入步驟(1)所述溶液；然后，
a)應用超聲波處理器超聲振蕩處理溶液和氣體的混合物使混合物乳化，形成粒徑合乎要求的包裹氣體的微球混懸液；
或b)應用剪切設備處理溶液和氣體的混合物，通過機械剪切力作用使混合物乳化，形成粒徑合乎要求的包裹氣體的微球混懸液；
(3)通過以上步驟(1)和O)，可獲得包裹氣體的微球混懸液；
(4)將以上步驟( 所獲微球混懸液靜置24h后，棄掉下清液并加入等量蒸餾水洗滌純化3次制備出生物素脂質微泡，加入一定比例的鏈親和素，冰上孵育30min，按以上方法洗滌純化3次后，加入一定比例的生物素化單克隆抗體，冰上孵育30min后按以上方法洗滌純化3次即可獲得含單克隆抗體的磁性靶向超聲造影劑混懸液。
本發明所述制備方法，包括配體與超聲造影劑微球連接的兩種方法配體可通過共價連接和非共價連接(親和素橋連)的方法與造影劑微球表面連接。多肽類配體采用共價連接方法與微球連接為宜；而單克隆抗體類配體采用非共價連接方法與微球連接為宜。 我們在微泡和配體之間插入一種分子橋(如PEG)，有利于保證配體的完整性和最大程度的提高靶向微泡的效能。非共價連接(親和素橋連)的方法可以在生理條件下完成，同時親和素具有四個獨立的生物素結合位點，可極大的提高配體的結合效率，但是親和素橋連的方法具有抗原性(親和素是一個外源性蛋白為潛在性抗原)，因此該方法只適用于早期研究測試階段和動物實驗的靶向性超聲微泡的制備。共價連接的方法步驟簡單、沒有抗原性的弊端，是構建符合臨床需求的系列靶向性超聲微泡的適宜方法。
本發明采用超聲振蕩和機械剪切方法制備造影劑微球設備投入少，操作簡易。其中應用高速液體剪切機、勻漿器或膠體磨的機械剪切作用來制備造影劑微球為優選方法， 與超聲法比較，更容易進行工藝放大用于擴大生產，設備的剪切分散轉速為該方法主要參數，可根據需要來調節該參數，以制備出濃度、粒徑適宜的造影劑產品。
圖1、本發明造影劑在普通光鏡所見。磁性生物素化微泡(A)、加入鏈親和素后(B) 和加入單克隆抗體后(C)，均顯示微泡大小均一(圖中標尺為ΙΟμπι)。(詳見實例2說明)
圖2、熒光顯微鏡體外觀察本發明造影劑的磁響應性良好。圖2Α為裝置示意圖； 圖2Β在磁場作用下ΡΕ50管的熒光強度明顯增強，而圖2C在沒有磁場作用下ΡΕ50管的熒光強度極弱或無。(詳見實例4說明)。
圖3、腹主動脈模型上觀察本發明造影劑的磁響應性。無磁場作用下，磁性靶向 VCAM-I微泡注射后即刻㈧和4分鐘后⑶；磁場作用下，磁性靶向VCAM-I微泡注射后即刻(C)和10分鐘后(D)。(詳見實例5說明)。
圖4、腹主動脈斑塊靶向超聲成像的彩色編碼圖。磁性靶向VCAM-I微泡㈧，非磁性靶向VCAM-I微泡⑶，非磁性同型對照微泡(C)。(詳見實例6說明)。
下面結合實施例詳細說明本發明。
具體實施方式
[0044]實施例1 剪切速率對微球產率和粒徑的影響
按0. 1重量％稱取磷脂，1重量％稱取聚乙二醇(PEG)，0.01重量％ PEG聚合磷脂， 0. 045重量％稱取生物素化的PEG聚合磷脂，0. 01重量％稱取磷脂磁珠，0. 03重量％稱取泊洛沙姆的混合物，加至水介質(蒸餾水)中于50 80°C條件下充分混勻，通入全氟丙烷氣體，將高速液體剪切機分散刀頭伸入液面下，以不同轉速對溶液進行高速剪切分散，制得微球的濃度和粒徑數據見表1。
表1剪切速率對微球濃度及粒徑的影響
權利要求
1.一種具有磁性的分子靶向超聲造影劑，為平均直徑1 4微米的包裹氣體的脂質體微球混懸液，由含脂質體的成膜材料包裹生物相容的水不溶性氣體構成，微球的脂質層內或表面連接有磁響應材料，且微球表面裝配有特異性的單克隆抗體、多肽或多糖；其特征在于成膜材料包括磷脂、聚乙二醇、PEG聚合磷脂、生物素化的PEG聚合磷脂或多肽修飾的 PEG聚合磷脂、泊洛沙姆；微球球壁包含磁響應材料、單克隆抗體和/或親和素橋連材料；被包裹在微球中的氣體為生物相容的水不溶性氣體，溶劑為蒸餾水；所述水不溶性氣體選自全氟甲烷、全氟乙烷、全氟丙烷、全氟丁烷、全氟環丁烷、全氟戊烷和六氟化硫；所述磷脂選自卵磷脂，大豆磷脂，大豆卵磷脂，磷脂酰膽堿，磷脂酰乙醇胺，磷脂酸，磷脂酰絲氨酸和磷脂酰甘油；所述氣體25°C時在水中的溶解度為每ml水中少于0. Olml氣體；其中磷脂含量為0. 02 0. 5重量％，聚乙二醇含量為0. 05 2. 0重量％，PEG聚合磷脂含量為0. 001 0. 04重量％，生物素化的PEG聚合磷脂含量為0. 01 0. 2重量％或多肽修飾的PEG聚合磷脂含量為0. 01 0. 4重量％，泊洛沙姆含量為0. 004 0. 2重量％，磁響應材料含量為 0. 004 0. 2重量％，單克隆抗體含量為0. 002 0. 1重量％，親和素含量為0. 001 0. 05 重量％。
2.如權利要求
1所述的磁性的分子靶向超聲造影劑，其中所述PEG聚合磷脂選自聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺.。
3.如權利要求
1所述的磁性的分子靶向超聲造影劑，其中所述的生物素化的PEG聚合磷脂為PEG4000- 二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺-生物素。
4.如權利要求
1所述的磁性的分子靶向超聲造影劑，其中所述的PEG聚合磷脂為 PEG2000- 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺或PEG2000- 二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺。
5.如權利要求
1所述的磁性的分子靶向超聲造影劑，其中所述的磁響應材料為磁珠。
6.如權利要求
5所述的磁性的分子靶向超聲造影劑，其中所述的磁響應材料為磷脂磁珠。
7.如權利要求
5所述的磁性的分子靶向超聲造影劑，其中所述的磁響應材料為親和素磁珠。
8.如權利要求
5所述的磁性的分子靶向超聲造影劑，其中所述的磁響應材料為PEG聚合磷脂磁珠。
9.如權利要求
6所述的磁性的分子靶向超聲造影劑，其中所述的磷脂磁珠為二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺-磁珠，其含量為0. 004 0. 2重量％。
10.如權利要求
1所述的磁性的分子靶向超聲造影劑，其中所述的氣體為全氟丙烷。
11.一種制備磁性靶向超聲造影劑的方法，其特征步驟包括(1)將0.02 0. 5重量％的磷脂、0. 05 2. 0重量％的聚乙二醇、0. 001 0. 04重量％ 的PEG聚合磷脂、多肽修飾的PEG聚合磷脂、0. 004 0. 2重量％的磷脂磁珠、0. 004 0. 2 重量％的泊洛沙姆加入蒸餾水中以50 80°C充分溶解和混勻；(2)將氟碳氣體通入步驟(1)所述溶液；然后，a)應用超聲波處理器超聲振蕩處理溶液和氣體的混合物使混合物乳化，形成粒徑合乎要求的包裹氣體的微球混懸液；或b)應用剪切設備處理溶液和氣體的混合物，通過機械剪切力作用使混合物乳化，形成粒徑合乎要求的包裹氣體的微球混懸液；(3)通過以上步驟(1)和O)，可獲得包裹氣體的微球混懸液；(4)將以上步驟C3)所獲微球混懸液靜置24h后，棄掉下清液并加入等量蒸餾水洗滌、 純化3次，即可獲得含多肽的磁性靶向超聲造影劑混懸液，所述氟碳氣體選自全氟甲烷、全氟乙烷、全氟丙烷、全氟丁烷、全氟環丁烷、全氟戊烷和六氟化硫；所述磷脂選自卵磷脂，大豆磷脂，大豆卵磷脂，磷脂酰膽堿，磷脂酰乙醇胺，磷脂酸，磷脂酰絲氨酸和磷脂酰甘油。
12.—種制備磁性靶向超聲造影劑的方法，其步驟包括(1)將0.02 0. 5重量％的磷脂、0. 05 2. 0重量％的聚乙二醇、0. 001 0. 04重量％ 的PEG聚合磷脂、0. 01-0. 2重量％生物素化的PEG聚合磷脂、0. 004 0. 2重量％的磷脂磁珠、0. 004 0. 2重量％的泊洛沙姆加入蒸餾水中以50 80°C充分溶解和混勻；(2)將氟碳氣體通入步驟(1)所述溶液；然后，a)應用超聲波處理器超聲振蕩處理溶液和氣體的混合物使混合物乳化，形成粒徑合乎要求的包裹氣體的微球混懸液；或b)應用剪切設備處理溶液和氣體的混合物，通過機械剪切力作用使混合物乳化，形成粒徑合乎要求的包裹氣體的微球混懸液；(3)通過以上步驟(1)和O)，可獲得包裹氣體的微球混懸液；(4)將以上步驟C3)所獲微球混懸液靜置Mh后，棄掉下清液并加入等量蒸餾水洗滌去掉未結合的脂質、純化3次制備出生物素脂質微泡，加入0. 001 0. 05重量％的鏈親和素， 冰上孵育30min，按以上方法洗滌去掉未結合的鏈親和素后，加入0. 002 0. 1重量％的生物素化單克隆抗體，冰上孵育30min后按以上方法洗滌去掉未結合在微泡上的生物素化單克隆抗體，即可獲得含單克隆抗體的磁性靶向超聲造影劑混懸液，所述氟碳氣體選自全氟甲烷、全氟乙烷、全氟丙烷、全氟丁烷、全氟環丁烷、全氟戊烷和六氟化硫；所述磷脂選自卵磷脂，大豆磷脂，大豆卵磷脂，磷脂酰膽堿，磷脂酰乙醇胺，磷脂酸，磷脂酰絲氨酸和磷脂酰甘油。
13.如權利要求
11或12的制備造影劑方法，其中所述超聲波處理器為聲振頻率10 50KHz的探頭型超聲波儀。
14.如權利要求
11或12的制備造影劑方法，其中所述剪切設備為液體高速剪切機、勻漿器或膠體磨。
專利摘要
本發明涉及的是一種具有磁性的新型分子靶向超聲造影劑，即平均直徑為1～4微米的包裹氣體的磁性脂質體微球混懸液及其制備方法。具有磁性的分子靶向超聲造影劑微球，包括微球的脂質層中和/或脂質層的表面含(或連接)有磁響應材料的情況。本發明的造影劑微球球壁材料包含磷脂、聚乙二醇(PEG)、PEG聚合磷脂、生物素化的和/或多肽修飾的PEG聚合磷脂、泊洛沙姆、對靶分子有特異親和力的配體(單克隆抗體或多肽等)、磁響應材料和/或親和素橋連材料，被包裹氣體為氟碳類氣體，溶劑為水介質(蒸餾水)。本發明還記載了磁性分子靶向超聲造影劑微球的制備方法，包括特異性配體以共價和親和素橋連方式與微球連接的情況。本發明造影劑靶向顯影效果良好，其可用于評價器官組織動脈和靜脈系統的血管內皮分子變化，并且其在治療方面也有良好的應用前景。
文檔編號A61K49/22GKCN101780284 B發布類型授權 專利申請號CN 200910036680
公開日2012年5月30日 申請日期2009年1月15日
發明者侯連兵, 劉伊麗, 吳爵非, 賓建平, 廖旺軍, 廖禹林, 李貴平, 楊莉, 查道剛, 王月剛, 蔡晶晶, 高方 申請人:南方醫科大學南方醫院導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (4),