專利名稱:抑制人類免疫缺陷綜合征病毒感染和增殖的藥劑的用途的制作方法
發(fā)明背景1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及抑制人類免疫缺陷綜合征病毒(HIV-1)感染和增殖的藥劑，HIV-1感染免疫活性細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞或樹突細(xì)胞，并導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的破壞。更具體而言，本發(fā)明涉及抑制人類免疫缺陷綜合征病毒感染和增殖的藥劑的用途，該藥劑抑制人類免疫缺陷綜合征病毒感染來源于人單核細(xì)胞的M型巨噬細(xì)胞及其增殖。
2.相關(guān)技術(shù)描述有超過4000萬人感染人類免疫缺陷綜合征病毒(HIV-1)，其中估計(jì)約有500萬患者發(fā)展為獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)。AIDS是一種世界范圍的傳染病。對(duì)HIV-1感染患者的高活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(HAART)在二十世紀(jì)九十年代早期出現(xiàn)。由于其在臨床領(lǐng)域的應(yīng)用，獲得了較好的治療效果，如降低AIDS患者血漿中的病毒計(jì)數(shù)，導(dǎo)致CD4數(shù)量的回復(fù)。
然而，另一方面，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，針對(duì)巨噬細(xì)胞(MΦ)的病毒仍在網(wǎng)狀內(nèi)皮組織中存在1)，2)，并且在接受HAART的患者中在HAART約半年到幾年后發(fā)現(xiàn)HAART抗性株。此外，由于HAART治療成本昂貴，發(fā)達(dá)國家的患者得以優(yōu)先治療，而發(fā)展中國家的患者不能接受這種治療，因?yàn)榘l(fā)達(dá)國家與發(fā)展中國家(具有80％以上的HIV患者)的經(jīng)濟(jì)實(shí)力存在差異，而且這種治療不能幫助中斷病毒的國際分布，因此，為了抑制抗性株的出現(xiàn)，需要多種聯(lián)合治療，而且還有患者由于腹部綜合征和造血損傷不能接受這種治療的報(bào)道，因而指出了HAART的醫(yī)學(xué)和社會(huì)應(yīng)用的限制。
HIV-1是一種感染免疫活性細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞)，破壞免疫系統(tǒng)的病毒。根據(jù)最近的研究，逐漸清楚了HIV-1在巨噬細(xì)胞中的感染和增殖對(duì)于HIV-1傳染力的保持和致病機(jī)理的發(fā)展起重要作用3)，因此，希望研制可抑制HIV-1在巨噬細(xì)胞中感染和增殖的新藥。
盡管進(jìn)行了關(guān)于HIV-1感染巨噬細(xì)胞的大量實(shí)驗(yàn)，還用巨噬細(xì)胞株進(jìn)行了許多研究，結(jié)果是，采用這些細(xì)胞株的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不總是反映體內(nèi)組織巨噬細(xì)胞的功能。Akagawa等人成功地由單核細(xì)胞分別誘導(dǎo)了發(fā)生HIV-1增殖的巨噬細(xì)胞和抑制HIV-1增殖的巨噬細(xì)胞這兩種類型，進(jìn)一步證實(shí)了抑制增殖的巨噬細(xì)胞可能是人肺泡巨噬細(xì)胞的一種模型，因此，在這種類似于體內(nèi)巨噬細(xì)胞的系統(tǒng)中有可能分析HIV-1的感染、增殖和抑制其增殖的機(jī)制4)-9)。
另外，眾所周知大環(huán)內(nèi)酯類可有效治療彌漫性全細(xì)支氣管炎(DPB)和耳鼻科疾病，其作用機(jī)制已知，除了抗菌作用外，還可誘發(fā)抗炎癥作用10)。特別是，有一篇報(bào)道指出，通過檢查大環(huán)內(nèi)酯類在組織中的積累，在巨噬細(xì)胞中觀察到幾百到一千倍于外周淋巴細(xì)胞的積累，因此，認(rèn)為大環(huán)內(nèi)酯類對(duì)巨噬細(xì)胞的作用是重要的。
根據(jù)上述背景，我們認(rèn)為，研制可以彌補(bǔ)HAART的缺點(diǎn)、抑制HIV-1在巨噬細(xì)胞中的感染和增殖、旨在從淋巴網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中去除針對(duì)巨噬細(xì)胞的HIV-1的藥物，特別是根據(jù)世界水平基于AIDS治療策略的觀點(diǎn)研制便宜的化療劑，對(duì)于HIV-1患者的治療是有用的。
我們研究了已知的大環(huán)內(nèi)酯類衍生物是否具有抑制HIV-1感染和增殖的作用，驚奇地發(fā)現(xiàn)，它們對(duì)HIV-1在巨噬細(xì)胞中的感染和增殖具有抑制作用，并且證實(shí)對(duì)增殖的抑制作用表現(xiàn)為抑制巨噬細(xì)胞中酪氨酸激酶Hck蛋白的表達(dá)(這是病毒生長必需的)，并抑制P38MAPK的激活，于是形成了本發(fā)明。
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供抑制人類免疫缺陷綜合征病毒感染和增殖的藥劑的用途，它可用于用便宜的化療劑治療HIV-1感染患者，以及用作HAART的輔藥。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及大環(huán)內(nèi)酯類衍生物抑制人類免疫缺陷綜合征病毒在來源于人單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞中感染和增殖的用途。來源于人單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞是M型巨噬細(xì)胞。病毒增殖的抑制基于大環(huán)內(nèi)酯類對(duì)酪氨酸激酶Hck蛋白的抑制作用和對(duì)巨噬細(xì)胞P38MAPK激活(這是病毒增殖必需的)的抑制。對(duì)HIV-1增殖具有這種抑制作用的已知大環(huán)內(nèi)酯類衍生物均包含于本發(fā)明中。
本發(fā)明使用的大環(huán)內(nèi)酯類衍生物的優(yōu)選實(shí)例有氧雜環(huán)十四烷-2，10-二酮，4[(2，6-雙脫氧-3-O-甲基-α-L-核糖-吡喃己糖基)氧]-14-乙基-7，12，13-三羥基-3，5，7，9，11，13-六甲基-6-[[3，4，6-三脫氧-3-(二甲氨基)-β-D-木糖-吡喃己糖基]氧；11-(1’-羥丙基)-3-[2，6-雙脫氧-3-C-甲基-α-L-核糖-吡喃己糖基]氧]-5-[(3，4，6-三脫氧-3-(二甲氨基)-β-D-木糖-吡喃己糖基)氧]-2，4，6，8，11，14-六甲基-10，13，15-三-氧雜三環(huán)[9.2.1.1.9.6]-十五烷-1-酮；6，15，16-三氧雜三環(huán)[10.2.1.11，4]十六烷，紅霉素衍生物；4，13-二氧雜雙環(huán)[8.2.1]十三-12-烯-5-酮，7-[(2，6-雙脫氧-3-C-甲基-α-L-核糖-吡喃己糖基)氧]-3-(1，2-二羥基-1-甲丁基)-2，6，8，10，12-五甲基-9-[[3，4，6-三脫氧-3-(二甲氨基)-β-D-木糖-吡喃己糖基]氧]；氧雜環(huán)-十四烷-2，10-二酮，4-[(2，6-雙脫氧-3-O-甲基-α-L-核糖-吡喃己糖基)氧]-14-乙基-12，13-二羥基-7-甲氧基-3，5，7，9，11，13-六甲基-6-[[3，4，6-三脫氧-3-(二甲氨基)-β-D-木糖-吡喃己糖基]氧]；脫(3’-N-甲基)-8，9-脫水-假紅霉素A6，9-半縮酮或其鹽；脫(3’-N-甲基)-3’-N-磺?；?8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；脫(3’-N-甲基)-[3’-N-(3-羥基-1-丙基)]-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；脫(3’-N-甲基)-3’-N-(2-乙酰氧基乙基)-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；脫(3’-N-甲基)-3’-N-氰甲基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；脫(3’-N-甲基)-3’-N-(2-氟乙基)-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；雙-脫(3’-N-甲基)-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；雙-脫(3’-N-甲基)-3’-N-乙基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；雙-脫(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二乙基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；雙-脫(3’-N-甲基)-3’-N-烯丙基-8，9-脫水-假紅霉素A6，9-半縮酮或其鹽；雙-脫(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二烯丙基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；雙-脫(3’-N-甲基)-3’-N-炔丙基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；雙-脫(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二炔丙基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；雙-脫(3’-N-甲基)-3’-N-丙基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；雙-脫(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二丙基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；雙-脫(3’-N-甲基)-3’-N-己基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；雙-脫(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二己基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；雙-脫(3’-N-甲基)-3’-N-芐基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；雙-脫(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二芐基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；雙-脫(3’-N-甲基)-3’-N-(2-丙基)-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；雙-脫(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二-(10-溴-1-癸基)-8，9-脫水-假紅霉素A6，9-半縮酮或其鹽；雙-脫(3’-N-甲基)-3’-N-乙?；?8，9-脫水-假紅霉素A6，9-半縮酮或其鹽；脫(3’-二甲氨基)-3’-哌啶基-8，9-脫水-假紅霉素A6，9-半縮酮或其鹽；脫(3’-二甲氨基)-3’-吡咯烷基-8，9-脫水-假紅霉素A6，9-半縮酮或其鹽；脫(3’-二甲氨基)-3’-嗎啉基-8，9-脫水-假紅霉素A6，9-半縮酮或其鹽；脫(3’-二甲氨基)-3’-[六氫-1(1H)-氮雜基]-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；脫(12-羥基)-脫[12-(1-羥丙基)]-12-羥基-肟-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；脫[12-(1-羥丙基)]-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；脫(12-羥基)-脫[12-(1-羥丙基)]-12-氨基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；脫(3’-N-甲基)-脫[12-(1-羥丙基)]-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；脫(3-O-克拉定糖基)-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；和脫(3-O-克拉定糖基)-脫[3’-N-甲基)-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽。
為了理解本發(fā)明，解釋了抑制針對(duì)巨噬細(xì)胞的HIV-1在來源于人單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞中增殖的機(jī)制。
實(shí)驗(yàn)材料與方法(1-1)來源于人單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞的制備如以前所報(bào)道的11)，利用人CD14抗體微珠(Miltenyi Biotec，德國)、磁性細(xì)胞分離系統(tǒng)(MACS)(Miltenyi Biotech，德國)和lymphoprep(Nycome Inc.，挪威)從健康志愿者的棕黃層分離人外周血單核細(xì)胞(PMBC)，然后通過正選擇從PMBC中分離單核細(xì)胞。
來源于單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞如下制備在M-CSF(巨噬細(xì)胞集落刺激因子)(104U/ml，Morinaga Milk Co.提供)、粒細(xì)胞和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)(500U/ml，日本Scheling Plough Co.，Osaka提供，或購自R&S Genzyme-TECHNE Inc.)存在下，用含有10％FCS(Nissui Seiyaku Co.，東京)的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)回收的單核細(xì)胞7-8天。
由人單核細(xì)胞通過M-CSF的不同誘導(dǎo)制備的巨噬細(xì)胞稱為M型巨噬細(xì)胞(M型MΦ或M-MΦ)，由人單核細(xì)胞通過GM-CSF的不同誘導(dǎo)制備的巨噬細(xì)胞稱為GM型巨噬細(xì)胞(GM型MΦ或GM-MΦ)。此外，肺泡巨噬細(xì)胞(肺泡MΦ或M-MΦ)如下制備?；厥沼山】抵驹刚叻闻莨嘞传@得的肺泡灌洗液中的細(xì)胞，懸浮并附著于塑料上，然后洗掉未附著的細(xì)胞，剩下的附著細(xì)胞稱為肺泡MΦ。
(1-2)HIV-1對(duì)巨噬細(xì)胞的感染HIV-1感染巨噬細(xì)胞如下進(jìn)行。針對(duì)巨噬細(xì)胞的病毒株HIV-1JR-FL和HIV-1BAL以低濃度(p24抗原滴度50ng/ml，TCID50＝3000/ml病毒，終濃度100pg/ml)與MΦ、GM-MΦ和A-MΦ(調(diào)節(jié)為2.5×105/孔，F(xiàn)lacon No3043Becton Dickinson Labware，Inc.U.S.)接觸感染2小時(shí)，洗掉未與巨噬細(xì)胞吸附的病毒，添加新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)。含M-MΦ的培養(yǎng)基添加M-CSF(104U/ml)，含GM-MΦ的培養(yǎng)基添加GM-CSF(500U/ml)。
本實(shí)驗(yàn)中，接觸感染使用的病毒量調(diào)節(jié)為攜帶病毒階段患者的病毒水平，攜帶HIV-1階段患者的肺組織的病毒水平為幾個(gè)到十個(gè)pg/ml-幾百個(gè)pg/ml，肺泡MΦ感染的病毒水平為104個(gè)細(xì)胞中幾個(gè)拷貝12)。
(1-3)感染和增殖的HIV-1的測(cè)定使用兩種抗-p24抗體(Nu24和10B5)13)通過夾心ELISA，根據(jù)感染后培養(yǎng)上清液中釋放的病毒顆粒檢測(cè)病毒的增殖。用下列JAM62和JAM65作為LTR(HIV長末端重復(fù))-缺口基因引物。下列JAM63和JAM64作為巢式PCR的內(nèi)部引物。
JAM625′-GCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTG-3′JAM655′-AATCGTTCTAGCTCCCTGCTTGCCC-3′JAM635′-GTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCC-3′JAM645′-CCGCTTAATACTGACGCTCTCGCAC-3′(1-4)酪氨酸激酶Hck蛋白和轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ蛋白的表達(dá)的測(cè)定將巨噬細(xì)胞在SDS-PAGE樣品緩沖液中溶解，進(jìn)行10％SDS-聚丙烯酰胺電泳，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到immobilon P膜(MilliporeInc.U.S.)上，并通過Western blotting檢測(cè)這些蛋白質(zhì)的抗體，之后檢測(cè)巨噬細(xì)胞中酪氨酸激酶Hck蛋白和轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ蛋白的表達(dá)。酪氨酸激酶Hck蛋白(N-30)的抗體和C/EBPβ(C-19)的抗體購自Santacluse Inc.(U.S.)。Western blotting用Amersham ELC試劑(Amersham International plc，Buckinghamshire，UK)檢測(cè)。條帶強(qiáng)度表示為PSL(光刺激發(fā)光)值(A/mm2)。
(1-5)用反義酪氨酸激酶Hck蛋白和轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞的處理Hck蛋白和C/EBPβ蛋白的反義寡核苷酸探針(AS)、對(duì)應(yīng)于它們的有義寡核苷酸探針(S)以及與轉(zhuǎn)錄和翻譯無關(guān)的非有義寡核苷酸探針(NS)如下使用。
硫代磷酸酯-修飾的AS-Hck5′-TTCATCGACCCCATCCTGGC-3′
硫代磷酸酯-修飾的S-Hck；5′-GCCAGGATGGGGTCGATGAA-3′硫代磷酸酯-修飾的NS-Hck；5′-CCATATTTCCCGCTCGCGTG-3′硫代磷酸酯-修飾的AS-C/EBPβ；5′-CAGGCGTTGCATGAACGCGG-3′硫代磷酸酯-修飾的S-C/EBPβ；5′-CCGCGTTCATGCAACGCCTG-3′硫代磷酸酯-修飾的NS-C/EBPβ；5′-CCAGAGAGGGCCCGTGTGGA-3′這些探針溶解于不含血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，其中l(wèi)ipofectin(Life Technology Inc.，U.S.)以5μm濃度在室溫下溶解30分鐘，向巨噬細(xì)胞中加入含有10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)基(終濃度2μm)，37℃溫育24小時(shí)。之后用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，加入含有10％FCS、不含寡核苷酸的RPMI1640培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24小時(shí)，之后用HIV-1感染。
(1-6)P38MAPK和ERK1/2激活的測(cè)定用P38MAPK抗體、抗ERK1/2抗體、抗酪氨酸磷酸化P38MAPK抗體和抗酪氨酸磷酸化ERK1/2抗體(New England Biolabs，Inc.U.S.)檢測(cè)P38MAPK和ERK1/2的激活，通過Western blotting檢測(cè)這些分子的磷酸化反應(yīng)。
結(jié)果(2-1)針對(duì)巨噬細(xì)胞的HIV-1株在M-MΦ和GM-MΦ中的增殖反應(yīng)(2-1-1)培養(yǎng)上清液中HIV-1感染的M-MΦ和GM-MΦ上p24蛋白的量M-MΦ和GM-MΦ用HIV-1JR-FL株和HIV-1BAL株感染，溫育14天。以恒定時(shí)間檢測(cè)巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中p24蛋白的含量。對(duì)于任一種HIV-1株，檢測(cè)M-MΦ培養(yǎng)上清液中的p24蛋白[見
圖1(A)和(B)]。
(2-1-2)HIV-1感染的M-MΦ和GM-MΦ中的細(xì)胞病變以時(shí)間依賴的方式觀察HIV-1JR-FL株和HIV-1BAL株感染的M-MΦ和GM-MΦ的形態(tài)學(xué)改變。只在產(chǎn)病毒的M-MΦ中從溫育第二天起觀察到細(xì)胞簇的形成和細(xì)胞融合，在培養(yǎng)的第4-7天可見多核巨細(xì)胞的形成[見圖2(A)]。另一方面，在不產(chǎn)生病毒的GM-MΦ中，觀察到形態(tài)學(xué)(nomorphological)改變[見圖2(B)]。該結(jié)果表明，針對(duì)巨噬細(xì)胞的HIV-1感染時(shí)巨噬細(xì)胞中的細(xì)胞病變作用，如聚簇、細(xì)胞融合和MGC形成，能作為測(cè)定病毒增殖的指標(biāo)。
(2-1-3)HIV-1感染的M-MΦ和GM-MΦ中胞內(nèi)p24蛋白分布的分析M-MΦ和GM-MΦ用HIV-1JR-FL株和HIV-1BAL株感染，在感染第8天用p24抗體免疫染色。在M-MΦ中，在MGC及其周圍細(xì)胞中觀察到p24蛋白的表達(dá)[見圖3(A)]。在GM-MΦ中未見p24蛋白表達(dá)[見圖3(B)]。這些結(jié)果判斷，GM-MΦ中的病毒產(chǎn)生抑制機(jī)制可能是病毒顆粒胞內(nèi)形成和芽殖階段之前的抑制機(jī)制。
(2-1-4)HIV-1感染的M-MΦ和GM-MΦ中病毒DNA的檢測(cè)M-MΦ和GM-MΦ用HIV-1JR-FL株和HIV-1BAL株感染，在感染第2天用LTR-gag引物通過巢式PCR檢測(cè)病毒DNA的形成。檢測(cè)了M-MΦ和GM-MΦ中的病毒DNA形成，M-MΦ中可見病毒增殖，GM-MΦ中未見病毒DNA形成[見圖4(A)和(B)]。該結(jié)果表明，甚至在不可見病毒增殖的GM-MΦ中也發(fā)生病毒向細(xì)胞中的滲入和RNA向DNA的轉(zhuǎn)化，表明在病毒DNA形成之后GM-MΦ中存在病毒形成的抑制機(jī)制。
(2-1-5)M-MΦ和GM-MΦ中酪氨酸激酶Hck蛋白和C/EBPβ蛋白的表達(dá)和HIV-1感染引起的表達(dá)改變由于來源于人單核細(xì)胞的M-MΦ強(qiáng)烈誘導(dǎo)HIV-1的增殖，而GM-MΦ抑制病毒增殖，我們檢測(cè)了HIV-1感染敏感性的差異是否取決于宿主蛋白質(zhì)表達(dá)的差異。結(jié)果證明這兩種巨噬細(xì)胞中酪氨酸激酶Hck蛋白和轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ的表達(dá)不同。
當(dāng)未感染病毒時(shí)，酪氨酸激酶Hck蛋白在M-MΦ中高表達(dá)，在GM-MΦ中低表達(dá)(見圖5)。盡管在HIV-1BAL株感染第2天，M-MΦ表達(dá)酪氨酸激酶Hck蛋白增多，但GM-MΦ表達(dá)酪氨酸激酶Hck蛋白反而降低(見圖5)。另一方面，對(duì)于未感染病毒的C/EBPβ蛋白的表達(dá)，高分子型(37kDa)只在M-MΦ中表達(dá)，但在GM-MΦ中可見高分子型和低分子型(23kDa)蛋白質(zhì)的表達(dá)(見圖6)。盡管在HIV-1BAL株感染后的第2天，未見M-MΦ表達(dá)C/EBPβ蛋白的改變，但在GM-MΦ中低分子量C/EBPβ蛋白的表達(dá)顯著提高，并且誘發(fā)高分子型與低分子型比例(L/S比)的改變(見圖6)。
(2-1-6)人肺泡MΦ的HIV-1感染敏感性和酪氨酸激酶Hck蛋白和C/EBPβ蛋白的表達(dá)的檢測(cè)用GM-CSF由人單核細(xì)胞誘導(dǎo)的GM-MΦ證明在形態(tài)學(xué)、表面標(biāo)志的表達(dá)、活性氧生產(chǎn)力和過氧化氫酶的表達(dá)上類似于人肺泡巨噬細(xì)胞13)14)。我們檢測(cè)了來源于人單核細(xì)胞的GM-MΦ與人肺泡MΦ的HIV-1傳染敏感性是否相似。
用HIV-1BAL株感染肺泡MΦ(A-MΦ)后，通過巢式PCR測(cè)定病毒DNA，并通過ELISA根據(jù)培養(yǎng)上清液中p24蛋白的含量測(cè)定病毒的增殖。在感染后的任何檢測(cè)時(shí)間都可見病毒DNA[見圖7(B)]，但到溫育14天時(shí)既未檢測(cè)到p24蛋白也未見病毒產(chǎn)生[見圖7(A)]。
通過Western印跡檢測(cè)肺泡MΦ酪氨酸激酶Hck蛋白和C/EBPβ蛋白的表達(dá)，結(jié)果是酪氨酸激酶Hck蛋白的表達(dá)降低，C/EBPβ蛋白同工型的表達(dá)改變，即低分子型C/EBPβ蛋白(23kDa)的表達(dá)顯著增強(qiáng)，并且L/S比降低(見圖8)。這些結(jié)果提示，來源于人單核細(xì)胞的人肺泡MΦ和GM-MΦ中病毒生產(chǎn)的抑制機(jī)制可能十分相同。
(2-1-7)針對(duì)酪氨酸激酶Hck蛋白的反義寡核苷酸處理的M-MΦ中酪氨酸激酶Hck蛋白表達(dá)的降低，和HIV-1增殖的抑制M-MΦ用針對(duì)酪氨酸激酶Hck蛋白的反義寡核苷酸(Hck-AS)處理24小時(shí)，M-MΦ再溫育24小時(shí)，檢測(cè)酪氨酸激酶Hck蛋白的表達(dá)。結(jié)果是，與對(duì)照組(L)相比，酪氨酸激酶Hck蛋白的表達(dá)顯著降低(見圖9)。然而，在用有義探針(Hck-S)或無關(guān)探針(Hck-NS)處理的M-MΦ中，可見酪氨酸激酶Hck蛋白表達(dá)的抑制(見圖9)。
用不同寡核苷酸預(yù)處理的這些M-MΦ用HIV-1BAL株感染，感染2天后檢測(cè)酪氨酸激酶Hck蛋白的表達(dá)，只在反義探針(Hck-AS)添加組中見到酪氨酸激酶Hck蛋白表達(dá)的降低，在有義探針(Hck-S)或無關(guān)探針(Hck-NS)處理的M-MΦ中未見酪氨酸激酶Hck蛋白表達(dá)的抑制(見圖10)。在感染后第4、7、10天檢測(cè)培養(yǎng)上清液中p24蛋白的含量。在反義探針(Hck-AS)處理的M-MΦ中，在任何時(shí)間均可見明顯含量的p24蛋白，但在有義探針(Hck-S)和無關(guān)探針(Hck-NS)處理的M-MΦ中，可見p24蛋白以時(shí)間依賴的方式增多(見圖10)，這類似于只用lipofectin處理的對(duì)照組(L)。該結(jié)果表明，M-MΦ中酪氨酸激酶Hck蛋白的表達(dá)是HIV-1增殖所必需的。
(2-1-8)C/EBPβ反義寡核苷酸處理的GM-MΦ中C/EBPβ的表達(dá)和HIV-1的生長反應(yīng)在用C/EBPβ反義寡核苷酸(C/EBPβ-AS)處理24小時(shí)并再培養(yǎng)24小時(shí)的GM-MΦ中，在用HIV-1BAL株感染2天后的GM-MΦ中，高分子同工型(37kDa)的表達(dá)相對(duì)恒定，但低分子同工型(23kDa)的表達(dá)顯著降低，L/S比升高(見圖11)。HIV-1進(jìn)一步感染C/EBPβ-AS預(yù)處理的GM-MΦ誘導(dǎo)病毒增殖，并且在培養(yǎng)上清液中可見p24蛋白(見圖12)。在添加C/EBPβ-S和C/EBPβ-NS的組中未見HIV-1生長促進(jìn)作用和C/EBPβ表達(dá)的改變(見圖11和圖12)。
根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，清楚地表明來源于人單核細(xì)胞的M-MΦ和GM-MΦ對(duì)針對(duì)巨噬細(xì)胞的HIV-1有不同的傳染敏感性，在M-MΦ中強(qiáng)烈誘導(dǎo)病毒增殖，反之，在GM-MΦ中抑制病毒增殖。此外，M-MΦ與GM-MΦ增殖模型的差異等同于酪氨酸激酶Hck蛋白和轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ蛋白的高分子同工型與低分子同工型在這些細(xì)胞中表達(dá)的差異。用反義寡核苷酸特異調(diào)節(jié)酪氨酸激酶Hck蛋白和C/EBPβ蛋白同工型的表達(dá)的結(jié)果是，M-MΦ的病毒產(chǎn)生被完全調(diào)節(jié)，反之，在GM-MΦ中能誘導(dǎo)病毒的產(chǎn)生。
根據(jù)這些結(jié)果，清楚地表明，酪氨酸激酶是HIV-1在M-MΦ中增殖所必需的，C/EBPβ的低分子型同工型在抑制HIV-1在GM-MΦ中增殖方面起重要作用。此外，根據(jù)對(duì)人肺泡MΦ的HIV-1感染敏感性和酪氨酸激酶Hck蛋白和C/EBPβ表達(dá)的分析結(jié)果，并且由于在來源于人單核細(xì)胞的人肺泡MΦ和GM-MΦ中HIV-1生長抑制的機(jī)制相同，對(duì)GM-MΦ的分析可能與對(duì)體內(nèi)肺泡MΦ的分析高度相關(guān)。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，來源于人單核細(xì)胞的M-MΦ中HIV-1增殖機(jī)制的分析可用作研制具有HIV-1生長抑制作用的藥物的基本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。
根據(jù)以上結(jié)果，對(duì)來源于人單核細(xì)胞的M-MΦ表達(dá)酪氨酸激酶Hck蛋白和對(duì)P38MAPK激活(這是病毒增殖必需的)具有抑制作用的大環(huán)內(nèi)酯類衍生物的優(yōu)選實(shí)例可包括下列物質(zhì)，這些物質(zhì)可以購得，或根據(jù)參考文獻(xiàn)所述的方法獲得。
氧雜環(huán)十四烷-2，10-二酮，4[(2，6-雙脫氧-3-O-甲基-α-L-核糖-吡喃己糖基)氧]-14-乙基-7，12，13-三羥基-3，5，7，9，11，13-六甲基-6-[[3，4，6-三脫氧-3-(二甲氨基)-β-D-木糖-吡喃已糖基]氧(Sigma Inc.，U.S.)；下文稱為EM。
11-(1’-羥丙基)-3-[2，6-雙脫氧-3-C-甲基-α-L-核糖-吡喃己糖基]氧]-5-[(3，4，6-三脫氧-3-(二甲氨基)-β-D-木糖-吡喃己糖基)氧]-2，4，6，8，11，14-六甲基-10，13，15-三-氧雜三環(huán)[9.2.1.1.9.6]-十五烷-1-酮(參見P.Kurath等人，Exoperimentia 27，362，1971)；下文稱為EM201。
6，15，16-三氧雜三環(huán)[10.2.1.11，4]十六烷，紅霉素衍生物，或6，9，12-脫水紅霉素A(參見P.Kurath等人，Exoperimentia 27，362，1971)；下文稱為EM202。
4，13-二氧雜雙環(huán)[8.2.1]十三-12-烯-5-酮，7-[(2，6-雙脫氧-3-C-甲基-α-L-核糖-吡喃己糖基)氧]-3-(1，2-二羥基-1-甲丁基)-2，6，8，10，12-五甲基-9-[[3，4，6-三脫氧-3-(二甲氨基)-β-D-木糖-吡喃己糖基]氧](參見JP-A-7-247299)；下文稱為EM703。
氧雜環(huán)十四烷-2，10-二酮，4-[(2，6-雙脫氧-3-O-甲基-α-L-核糖-吡喃己糖基)氧]-14-乙基-12，13-二羥基-7-甲氧基-3，5，7，9，11，13-六甲基-6-[[3，4，6-三脫氧-3-(二甲氨基)-β-D-木糖-吡喃己糖基]氧](參見S.Morimoto等人，J Antibiotics，43，286，1990或英國Apin ChemicalsLtd.的產(chǎn)品和日本W(wǎng)ako Pure Chemicals，Inc.的產(chǎn)品)；下文稱為CAM。
紅霉素衍生物的例子包括脫(3’-N-甲基)-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；下文稱為EM703。脫(3’-N-甲基)-3’-N-磺?；?8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；下文稱為EM727。脫(3’-N-甲基)-[3’-N-(3-羥基-1-丙基)]-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；下文稱為EM744。脫(3’-N-甲基)-3’-N-(2-乙酰氧基乙基)-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；下文稱為EM745。脫(3’-N-甲基)-3’-N-氰甲基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；下文稱為EM742。脫(3’-N-甲基)-3’-N-(2-氟乙基)-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；下文稱為EM740。雙-脫(3’-N-甲基)-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；下文稱為EM721。雙-脫(3’-N-甲基)-3’-N-乙基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；下文稱為EM722。雙-脫(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二乙基-8，9-脫水-假紅霉素A6，9-半縮酮或其鹽；下文稱為EM723。雙-脫(3’-N-甲基)-3’-N-烯丙基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；下文稱為EM724。雙-脫(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二烯丙基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；下文稱為EM725。雙-脫(3’-N-甲基)-3’-N-炔丙基-8，9-脫水-假紅霉素A6，9-半縮酮或其鹽；下文稱為EM728。雙-脫(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二炔丙基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；下文稱為EM729。雙-脫(3’-N-甲基)-3’-N-丙基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；下文稱為EM730。雙-脫(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二丙基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；下文稱為EM731。雙-脫(3’-N-甲基)-3’-N-己基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；下文稱為EM738。雙-脫(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二己基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；下文稱為EM739。雙-脫(3’-N-甲基)-3’-N-芐基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；下文稱為EM732。雙-脫(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二芐基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；下文稱為EM733。雙-脫(3’-N-甲基)-3’-N-(2-丙基)-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；下文稱為EM736。雙-脫(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二-(10-溴-1-癸基)-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；下文稱為EM749。雙-脫(3’-N-甲基)-3’-N-乙酰基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；下文稱為EM726。脫(3’-二甲氨基)-3’-哌啶基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；下文稱為EM734。脫(3’-二甲氨基)-3’-吡咯烷基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；下文稱為EM735。脫(3’-二甲氨基)-3’-嗎啉基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；下文稱為EM747。脫(3’-二甲氨基)-3’-[六氫-1(1H)-氮雜基]-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；下文稱為EM748。脫(12-羥基)-脫[12-(1-羥丙基)]-12-羥基肟-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；下文稱為EM743。脫[12-(1-羥丙基)]-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；下文稱為EM746。脫(12-羥基)-脫[12-(1-羥丙基)]-12-氨基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；下文稱為EM750。脫(3’-N-甲基)-脫[12-(1-羥丙基)]-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；下文稱為EM751。脫(3-O-克拉定糖基)-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；下文稱為EM737。脫(3-O-克拉定糖基)-脫[3’-N-甲基)-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；下文稱為EM754。
發(fā)明者Satoshi Omura等人發(fā)現(xiàn)了上述不同紅霉素衍生物，并且申請(qǐng)了國際專利申請(qǐng)，國際公開文本W(wǎng)O 02/14338A1，包括假紅霉素，預(yù)期它是一種新型抗炎劑。在WO 02/14338A1說明書中詳述了紅霉素衍生物的合成方法和化學(xué)結(jié)構(gòu)，下面概述了每種紅霉素衍生物的合成方法。
EM701的合成紅霉素(12.4g)的冰醋酸溶液在室溫下攪拌2小時(shí)，緩慢添加碳酸氫鈉水溶液中和。用氯仿抽提反應(yīng)混合物，用芒硝使有機(jī)層脫水，濾除芒硝，通過蒸餾除去溶劑，獲得粗提物。用硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶氨水＝10∶0.5∶0.01 10∶1∶0.05)純化粗提物，獲得EM201(7.7g)。之后，向EM201(7.6g)的甲醇溶液中加入碳酸鉀(1.4g)，回流2小時(shí)。待蒸餾掉溶劑后，將殘余物溶解于碳酸氫鈉水溶液中，用氯仿抽提?；旌弦河妹⑾趺撍?，過濾，除去芒硝，然后通過硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶氨水＝10∶0.5∶0.01→10∶1∶0.05)純化獲得的粗提物，獲得EM701(5.9g，白色粉末)。
脫(3’-N-甲基)-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮(EM703)的合成在室溫下向EM701(6.9g)的甲醇(52.0ml)-水(13.0ml)溶液中依次加入乙酸鈉(3.9g)和碘(2.5g)，在50℃下攪拌3小時(shí)。攪拌過程中加入1N氫氧化鈉水溶液，持續(xù)保持pH 8-9。通過TLC證實(shí)反應(yīng)完成后，反應(yīng)混合液用氨水(7.5ml)-水(200ml)稀釋，并用二氯甲烷抽提。用芒硝使有機(jī)層脫水，濾除芒硝，蒸餾掉溶劑，獲得粗提物。通過硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶氨水＝10∶0.5∶0.01→10∶1∶0.05)純化粗提物，獲得EM703(4.8g，白色粉末)。
雙-脫(3’-N-甲基)-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮(EM721)的合成向甲醇(15ml)中加入鈉(4.5g)制備甲醇鈉的甲醇溶液，在0℃下依次加入EM703(195.4mg)和碘(353.6mg)，攪拌3小時(shí)。通過TLC證實(shí)反應(yīng)完成后，加入硫代硫酸鈉(0.8g)、氨水(0.5ml)和水(80ml)，并用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有機(jī)層脫水，濾除芒硝，除去溶劑，獲得粗提物。通過硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶氨水＝10∶0.5∶0.01→10∶1∶0.05)純化粗提物，獲得EM721(166.3mg，白色粉末)。
雙-脫(3’-N-甲基)-3’-N-乙基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮(EM722)的合成向EM721(21.0mg)的二甲基甲酰胺(1.0ml)溶液中加入N，N-二異丙基乙胺(26.6μl)和乙基碘(12.2μl)，在室溫下攪拌4小時(shí)。通過TLC證實(shí)反應(yīng)完成后，反應(yīng)混合液用水稀釋，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有機(jī)層脫水，濾除芒硝，除去溶劑，獲得粗提物。通過硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶氨水＝10∶0.5∶0.01→10∶1∶0.05)純化粗提物，獲得EM722(7.0mg，白色粉末)。
雙-脫(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二乙基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮(EM723)的合成向EM721(21.0mg)的二甲基甲酰胺(1.0ml)溶液中加入N，N-二異丙基乙胺(26.6μl)和乙基碘(12.2μl)，在室溫下攪拌4小時(shí)。通過TLC證實(shí)反應(yīng)完成后，反應(yīng)混合液用水稀釋，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有機(jī)層脫水，濾除芒硝，除去溶劑，獲得粗提物。通過硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶氨水＝10∶0.5∶0.01→10∶1∶0.05)純化粗提物，獲得EM723(10.3mg，白色粉末)。
雙-脫(3’-N-甲基)-3’-N-烯丙基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮(EM724)的合成在0℃下向EM721(117.8mg)和N，N-二異丙基乙胺(298.6μl)的二氯甲烷(5.7ml)溶液中加入烯丙基溴(148.3μl)，在室溫下攪拌2小時(shí)。通過TLC證實(shí)反應(yīng)完成后，反應(yīng)混合液用水稀釋，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有機(jī)層脫水，濾除芒硝，除去溶劑，獲得粗提物。通過硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶氨水＝10∶0.5∶0.01→10∶1∶0.05)純化粗提物，獲得EM724(21.9mg，白色粉末)。
雙-脫(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二烯丙基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮(EM725)的合成在0℃下向EM721(117.8mg)和N，N-二異丙基乙胺(298.6μl)的二氯甲烷(5.7ml)溶液中加入烯丙基溴(148.3μl)，在室溫下攪拌2小時(shí)。通過TLC證實(shí)反應(yīng)完成后，反應(yīng)混合液用水稀釋，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有機(jī)層脫水，濾除芒硝，除去溶劑，獲得粗提物。通過硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶氨水＝10∶0.5∶0.01→10∶1∶0.05)純化粗提物，獲得EM725(64.3mg，白色粉末)。
雙-脫(3’-N-甲基)-3’-N-乙?；?8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮(EM726)的合成在0℃下向EM721(34.8mg)的二氯甲烷(1.6ml)溶液中加入乙酸酐(8.4μl)，攪拌10分鐘，再在室溫下攪拌30分鐘。通過TLC證實(shí)反應(yīng)完成后，反應(yīng)混合液用水稀釋，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有機(jī)層脫水，濾除芒硝，除去溶劑，獲得粗提物。通過硅膠柱層析(氯仿∶甲醇＝100∶1→20∶1)純化粗提物，獲得EM726(33.4mg，白色粉末)。
脫(3’-N-甲基)-3’-N-磺?；?8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮(EM727)的合成在0℃下向EM703(87.6mg)的二氯甲烷(4.2ml)溶液中加入甲基磺酰氯(9.3μl)，攪拌3小時(shí)。通過TLC證實(shí)反應(yīng)完成后，反應(yīng)混合液用水稀釋，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有機(jī)層脫水，濾除芒硝，除去溶劑，獲得粗提物。通過硅膠柱層析(氯仿∶甲醇＝100∶1 20∶1)純化粗提物，獲得EM727(37.2mg，白色粉末)。
雙-脫(3’-N-甲基)-3’-N-炔丙基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮(EM728)的合成向EM721(106.3mg)和N，N-二異丙基乙胺(269.3μl)的二氯甲烷(5.2ml)溶液中加入3-溴丙炔(137.8μl)，在室溫下攪拌24小時(shí)。通過TLC證實(shí)反應(yīng)完成后，反應(yīng)混合液用水稀釋，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有機(jī)層脫水，濾除芒硝，除去溶劑，獲得粗提物。通過硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶氨水＝10∶0.5∶0.01→10∶1∶0.05)純化粗提物，獲得EM728(41.3mg，白色粉末)。
雙-脫(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二炔丙基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮(EM729)的合成向EM721(106.3mg)和N，N-二異丙基乙胺(269.3μl)的二氯甲烷(5.2ml)溶液中加入3-溴丙炔(137.8μl)，在室溫下攪拌24小時(shí)。通過TLC證實(shí)反應(yīng)完成后，反應(yīng)混合液用水稀釋，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有機(jī)層脫水，濾除芒硝，除去溶劑，獲得粗提物。通過硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶氨水＝10∶0.5∶0.01→10∶1∶0.05)純化粗提物，獲得EM729(27.9mg，白色粉末)。
雙-脫(3’-N-甲基)-3’-N-丙基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮(EM730)的合成向EM721(23.5mg)的乙腈(2.3ml)溶液中依次加入N，N-二異丙基乙胺(59.6μl)和1-碘丙炔(33.3μl)，在80℃下回流20小時(shí)。通過TLC證實(shí)反應(yīng)完成后，反應(yīng)混合液用水稀釋，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有機(jī)層脫水，濾除芒硝，除去溶劑，獲得粗提物。通過硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶氨水＝15∶1∶0.1)純化粗提物，獲得EM730(5.7mg，白色粉末)。
雙-脫(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二丙基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮(EM731)的合成向EM721(23.5mg)的乙腈(2.3ml)溶液中依次加入N，N-二異丙基乙胺(59.6μl)和1-碘丙炔(33.3μl)，在80℃下回流20小時(shí)。通過TLC證實(shí)反應(yīng)完成后，反應(yīng)混合液用水稀釋，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有機(jī)層脫水，濾除芒硝，除去溶劑，獲得粗提物。通過硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶氨水＝15∶1∶0.1)純化粗提物，獲得EM731(12.0mg，白色粉末)。
雙-脫(3’-N-甲基)-3’-N-芐基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮(EM732)的合成在室溫下向EM721(88.8mg)和N，N-二異丙基乙胺(450.1μl)的二氯甲烷(4.3ml)溶液中加入芐基氯(297.3μl)，攪拌96小時(shí)。通過TLC證實(shí)反應(yīng)完成后，反應(yīng)混合液用水稀釋，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有機(jī)層脫水，濾除芒硝，除去溶劑，獲得粗提物。通過硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶氨水＝15∶1∶0.1)純化粗提物，獲得EM732(49.9mg，白色粉末)。
雙-脫(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二芐基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮(EM733)的合成向EM721(26.8mg)的乙腈(1.3ml)溶液中依次加入N，N-二異丙基乙胺(135.9μl)和芐基氯(89.7μl)，在80℃下回流60小時(shí)。通過TLC證實(shí)反應(yīng)完成后，反應(yīng)混合液用水稀釋，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有機(jī)層脫水，濾除芒硝，除去溶劑，獲得粗提物。通過硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶氨水＝20∶1∶0.1)純化粗提物，獲得EM733(19.6mg，白色粉末)。
脫(3’-二甲氨基)-3’-哌啶基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮(EM734)的合成向EM721(16.8mg)的乙腈(4.9ml)溶液中依次加入N，N-二異丙基乙胺(42.5μl)和1，5-二溴戊烷(33.2μl)，在80℃下回流24小時(shí)。通過TLC證實(shí)反應(yīng)完成后，反應(yīng)混合液用水稀釋，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有機(jī)層脫水，濾除芒硝，除去溶劑，獲得粗提物。通過硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶氨水＝15∶1∶0.1)純化粗提物，獲得EM734(13.3mg，白色粉末)。
脫(3’-二甲氨基)-3’-吡咯烷基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮(EM735)的合成向EM721(15.9mg)的乙腈(4.6ml)溶液中依次加入N，N-二異丙基乙胺(40.2μl)和1，4-二溴丁烷(27.6μl)，在80℃下回流24小時(shí)。通過TLC證實(shí)反應(yīng)完成后，反應(yīng)混合液用水稀釋，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有機(jī)層脫水，濾除芒硝，除去溶劑，獲得粗提物。通過硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶氨水＝10∶1∶0.1)純化粗提物，獲得EM735(11.9mg，白色粉末)。
雙-脫(3’-N-甲基)-3’-N-(2-丙基)-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮(EM736)的合成向EM721(90.6mg)的乙腈(4.4ml)溶液中依次加入N，N-二異丙基乙胺(459.2μl)和2-溴丙烷(247.5μl)，在80℃下攪拌72小時(shí)。通過TLC證實(shí)反應(yīng)完成后，反應(yīng)混合液用水稀釋，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有機(jī)層脫水，濾除芒硝，除去溶劑，獲得粗提物。通過硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶氨水＝10∶1∶0.1)純化粗提物，獲得EM736(25.3mg，白色粉末)。原料EM721回收47.1mg。
脫(3-O-克拉定糖基)-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮(EM737)的合成向EM701(201.6mg)的二甲基甲酰胺(5.6ml)溶液中加入一水合對(duì)甲苯磺酸(80.3mg)，在50℃下攪拌8小時(shí)。通過TLC證實(shí)反應(yīng)完成后，反應(yīng)混合液用水稀釋，加入飽和碳酸氫鈉水溶液調(diào)節(jié)為pH8.0，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有機(jī)層脫水，濾除芒硝，除去溶劑，獲得粗提物。通過硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶氨水＝20∶1∶0.1)純化粗提物，獲得EM737(84.7mg，白色粉末)。
雙-脫(3’-N-甲基)-3’-N-己基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮(EM738)的合成向EM721(80.6mg)的乙腈(3.9ml)溶液中依次加入N，N-二異丙基乙胺(408.5μl)和1-溴己烷(328.7μl)，在60℃下攪拌24小時(shí)。通過TLC證實(shí)反應(yīng)完成后，反應(yīng)混合液用水稀釋，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有機(jī)層脫水，濾除芒硝，除去溶劑，獲得粗提物。通過硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶氨水＝15∶1∶0.1)純化粗提物，獲得EM738(33.7mg，白色粉末)。原料EM721回收24.6mg。
雙-脫(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二己基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮(EM739)的合成向EM721(22.9mg)的乙腈(1.1ml)溶液中依次加入N，N-二異丙基乙胺(116.0μl)和1-溴己烷(93.6μl)，在60℃下攪拌72小時(shí)。通過TLC證實(shí)反應(yīng)完成后，反應(yīng)混合液用水稀釋，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有機(jī)層脫水，濾除芒硝，除去溶劑，獲得粗提物。通過硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶氨水＝20∶1∶0.1)純化粗提物，獲得EM739(20.1mg，白色粉末)。
脫(3’-N-甲基)-3’-N-(2-氟乙基)-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮(EM740)的合成在室溫下向EM703(70.0mg)的二甲基甲酰胺(3.3ml)溶液中加入N，N-二異丙基乙胺(347.7μl)和1-溴-2-氟-乙烷(148.6μl)，攪拌48小時(shí)。通過TLC證實(shí)反應(yīng)完成后，反應(yīng)混合液用水稀釋，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有機(jī)層脫水，濾除芒硝，除去溶劑，獲得粗提物。通過硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶氨水＝20∶1∶0.1)純化粗提物，獲得EM740(36.0mg，白色粉末)。原料EM703回收25.5mg。
脫(3’-N-甲基)-3’-N-氰甲基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮(EM742)的合成在室溫下向EM703(64.6mg)的二甲基甲酰胺(3.1ml)溶液中加入N，N-二異丙基乙胺(320.9μl)和溴乙腈(128.3μl)，攪拌4小時(shí)。通過TLC證實(shí)反應(yīng)完成后，反應(yīng)混合液用水稀釋，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有機(jī)層脫水，濾除芒硝，除去溶劑，獲得粗提物。通過硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶氨水＝20∶1∶0.1)純化粗提物，獲得EM742(53.1mg，白色粉末)。
脫(12-羥基)-脫[12-(1-羥丙基)]-12-氧雜-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮(EM705)的合成向EM701(508.0mg)的二氯甲烷(24.0ml)溶液中加入四乙酸鉛(508.0mg)，在室溫下攪拌40分鐘。通過TLC證實(shí)反應(yīng)完成后，反應(yīng)混合液用飽和鹽水-飽和碳酸氫鈉水溶液(1∶1，v/v)稀釋，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有機(jī)層脫水，濾除芒硝，除去溶劑，獲得粗提物。通過硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶氨水＝10∶0.5∶0.01)純化粗提物，獲得EM705(282.7mg，白色粉末)。
脫(12-羥基)-脫[12-(1-羥丙基)]-12-羥基-肟-8，9-脫水-假紅霉素A6，9-半縮酮(EM743)的合成在0℃下向EM705(116.5mg)和鹽酸羥胺(32.0mg)的乙醇(0.9ml)溶液中緩慢加入吡啶(0.9ml)，攪拌3小時(shí)。通過TLC證實(shí)反應(yīng)完成后，反應(yīng)混合液用水稀釋，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有機(jī)層脫水，濾除芒硝，除去溶劑，獲得粗提物。通過硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶氨水＝10∶0.5∶0.01→10∶1∶0.05)純化粗提物，獲得EM743(114.5mg，白色粉末)。
脫(3’-N-甲基)-[3’-N-(3-羥基-1-丙基)]-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮(EM744)的合成在室溫下向EM703(68.1mg)的二甲基甲酰胺(3.3ml)溶液中加入N，N-二異丙基乙胺(338.3μl)和3-溴-1-丙醇(175.6μl)，攪拌48小時(shí)。通過TLC證實(shí)反應(yīng)完成后，反應(yīng)混合液用水稀釋，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有機(jī)層脫水，濾除芒硝，除去溶劑，獲得粗提物。通過硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶氨水＝15∶1∶0.1)純化粗提物，獲得EM744(27.7mg，白色粉末)。原料EM703回收22.5mg。
脫(3’-N-甲基)-3’-N-(2-乙酰氧基乙基)-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮(EM745)的合成在室溫下向EM703(21.5mg)的二甲基甲酰胺(1.0ml)溶液中加入N，N-二異丙基乙胺(106.8μl)和2-溴乙酸乙酯(67.6μl)，攪拌48小時(shí)。通過TLC證實(shí)反應(yīng)完成后，反應(yīng)混合液用水稀釋，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有機(jī)層脫水，濾除芒硝，除去溶劑，獲得粗提物。通過硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶氨水＝20∶1∶0.1)純化粗提物，獲得EM745(6.0mg，白色粉末)。
脫[12-(1-羥丙基)]-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮(EM746)的合成在-78℃下向EM705(37.7mg)的甲醇(2.9ml)溶液中加入硼氫化鈉(21.8mg)，攪拌30分鐘。將反應(yīng)混合液的溫度提高到0℃，再攪拌30分鐘。通過TLC證實(shí)反應(yīng)完成后，加入丙酮(0.5ml)終止反應(yīng)。反應(yīng)混合液用水稀釋，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有機(jī)層脫水，濾除芒硝，除去溶劑，獲得粗提物。通過硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶氨水＝15∶1∶0.1)純化粗提物，獲得EM746(35.8mg，白色粉末)。
脫(3’-二甲氨基)-3’-嗎啉基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮(EM747)的合成向EM721(18.1mg)的乙腈(2.6ml)溶液中依次加入N，N-二異丙基乙胺(45.8μl)和雙(2-溴乙基)醚(33.1μl)，在80℃下攪拌24小時(shí)。通過TLC證實(shí)反應(yīng)完成后，反應(yīng)混合液用水稀釋，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有機(jī)層脫水，濾除芒硝，除去溶劑，獲得粗提物。通過硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶氨水＝20∶1∶0.1)純化粗提物，獲得EM747(12.0mg，白色粉末)。
脫(3’-二甲氨基)-3’-[六氫-1(1H)-氮雜基]-8，9-脫水-假紅霉素A6，9-半縮酮(EM748)的合成向EM721(19.5mg)的乙腈(2.8ml)溶液中依次加入N，N-二異丙基乙胺(49.5μl)和1，6-二溴己烷(43.6μl)，在80℃下攪拌24小時(shí)。通過TLC證實(shí)反應(yīng)完成后，反應(yīng)混合液用水稀釋，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有機(jī)層脫水，濾除芒硝，除去溶劑，獲得粗提物。通過硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶氨水＝20∶1∶0.1)純化粗提物，獲得EM748(11.7mg，白色粉末)。
雙-脫(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二-(10-溴-1-癸基)-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮(EM749)的合成向EM721(18.0mg)的乙腈(2.6ml)溶液中依次加入N，N-二異丙基乙胺(45.6μl)和1，10-二溴癸烷(58.9μl)，在80℃下回流36小時(shí)。通過TLC證實(shí)反應(yīng)完成后，反應(yīng)混合液用水稀釋，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有機(jī)層脫水，濾除芒硝，除去溶劑，獲得粗提物。通過硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶氨水＝20∶1∶0.1)純化粗提物，獲得EM749(14.9mg，白色粉末)。
脫(12-羥基)-脫[12-(1-羥丙基)]-12-氨基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或(EM750)的合成在0℃下向EM743(15.5mg)的乙醇(2.3ml)溶液中加入氧化鉬(IV)(10.0mg)和硼氫化鈉(10.5mg)，攪拌4小時(shí)。通過TLC證實(shí)反應(yīng)完成后，加入丙酮(0.5ml)終止反應(yīng)，反應(yīng)混合液用飽和鹽水-飽和碳酸氫鈉水溶液(1∶1，v/v)稀釋，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有機(jī)層脫水，濾除芒硝，除去溶劑，獲得粗提物。通過硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶氨水＝10∶1∶0.1)純化粗提物，獲得EM750(13.4mg，白色粉末)。
脫(3’-N-甲基)-脫(12-羥基)-脫[12-(1-羥丙基)]-12-氧-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮(EM706)的合成向EM701(508.0mg)的二氯甲烷(24.0ml)溶液中加入四乙酸鉛(508.0mg)，在室溫下攪拌40分鐘。通過TLC證實(shí)反應(yīng)完成后，反應(yīng)混合液用飽和鹽水-飽和碳酸氫鈉水溶液(1∶1，v/v)稀釋，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有機(jī)層脫水，濾除芒硝，除去溶劑，獲得粗提物。通過硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶氨水＝10∶0.5∶0.01)純化粗提物，獲得EM706(71.6mg，白色粉末)。
脫(3’-N-甲基)-脫[12-(1-羥丙基)]-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮(EM751)的合成在0℃下向EM706(38.8mg)的甲醇(3.0ml)溶液中加入硼氫化鈉(22.9mg)，攪拌1小時(shí)。通過TLC證實(shí)反應(yīng)完成后，加入丙酮(0.5ml)終止反應(yīng)，反應(yīng)混合液用飽和鹽水-飽和碳酸氫鈉水溶液(1∶1，v/v)稀釋，并用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有機(jī)層脫水，濾除芒硝，除去溶劑，獲得粗提物。通過硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶氨水＝15∶1∶0.1)純化粗提物，獲得EM751(31.4mg，白色粉末)。
脫(3-O-克拉定糖基)-脫[3’-N-甲基)-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮(EM754)的合成向EM703(132.4mg)的二甲基甲酰胺(3.8ml)溶液中加入一水合對(duì)甲苯磺酸(53.9mg)，在50℃下攪拌6小時(shí)。通過TLC證實(shí)反應(yīng)完成后，反應(yīng)混合液用水稀釋，加入飽和碳酸氫鈉水溶液調(diào)節(jié)為pH8.0，用二氯甲烷抽提。加入芒硝使有機(jī)層脫水，濾除芒硝，除去溶劑，獲得粗提物。通過硅膠柱層析(氯仿∶甲醇∶氨水＝15∶1∶0.1)純化粗提物，獲得EM754(50.2mg，白色粉末)。
附圖簡(jiǎn)述圖1(A)顯示HIV-1JR-FL株感染的M-MΦ和GM-MΦ的培養(yǎng)上清液中p24蛋白的含量，(B)顯示HIV-1BAL株感染的M-MΦ和GM-MΦ的培養(yǎng)上清液中p24蛋白的含量。
圖2(A)顯示HIV-1JR-FL株和HIV-1BAL株感染的M-MΦ的細(xì)胞病變，(B)顯示HIV-1JR-FL株和HIV-1BAL株感染的GM-MΦ的細(xì)胞病變。
圖3(A)顯示HIV-1JR-FL株和HIV-1BAL株感染的M-MΦ中p24蛋白的胞內(nèi)分布，(B)顯示HIV-1JR-FL株和HIV-1BAL株感染的GM-MΦ中p24蛋白的胞內(nèi)分布。
圖4(A)顯示對(duì)HIV-1JR-FL株感染的M-MΦ和GM-MΦ中病毒DNA的檢測(cè)，(B)顯示對(duì)HIV-1BAL株感染的M-MΦ和GM-MΦ中病毒DNA的檢測(cè)。
圖5顯示M-MΦ和GM-MΦ中酪氨酸激酶Hck蛋白表達(dá)的改變和HIV-1BAL株感染引起的表達(dá)。
圖6顯示M-MΦ和GM-MΦ中C/EBPβ蛋白表達(dá)的改變和HIV-1BAL株感染的M-MΦ和GM-MΦ的表達(dá)。
圖7(A)通過檢測(cè)HIV-1BAL株感染人肺泡MΦ(A-MΦ)后培養(yǎng)上清液中的p24蛋白顯示HIV-1生長反應(yīng)，(B)顯示病毒DNA的檢測(cè)。
圖8顯示肺泡MΦ中酪氨酸激酶Hck蛋白和C/EBPβ蛋白表達(dá)的改變，和HIV-1BAL株感染引起的表達(dá)。
圖9顯示在HIV-1BAL株感染之前和之后，酪氨酸激酶Hck蛋白反義寡核苷酸處理的M-MΦ中Hck蛋白的表達(dá)。
圖10顯示在酪氨酸激酶Hck蛋白反義寡核苷酸處理的M-MΦ中HIV-1增殖的抑制。
圖11顯示在HIV-1BAL株感染之前和之后，C/EBPβ蛋白反義寡核苷酸處理的GM-MΦ中C/EBPβ蛋白的表達(dá)。
圖12顯示C/EBPβ蛋白反義寡核苷酸處理的GM-MΦ中HIV-1的增殖。
圖13顯示與添加DMSO相比，添加大環(huán)內(nèi)酯衍生物(如EM、EM201、EM202、EM703或CAM)對(duì)M-MΦ中HIV-1增殖的影響。
圖14顯示與添加DMSO相比，添加大環(huán)內(nèi)酯衍生物(如EM、EM201、EM202、EM703或CAM)對(duì)GM-MΦ中HIV-1增殖的影響。
圖15顯示與添加DMSO相比，添加大環(huán)內(nèi)酯衍生物(如EM、EM201、EM202、EM703或CAM)對(duì)來自不同人(3名患者)的M-MΦ中HIV-1增殖的影響。
圖16顯示與添加DMSO相比，大環(huán)內(nèi)酯(如EM、EM201、EM202、EM703或CAM)的濃度對(duì)M-MΦ中HIV-1增殖的影響。
圖17顯示與添加DMSO相比，添加大環(huán)內(nèi)酯衍生物(EM、EM201、EM202、EM703或CAM)對(duì)HIV-1感染的M-MΦ的細(xì)胞病變的影響。
圖18顯示大環(huán)內(nèi)酯衍生物(如EM、EM201、EM202、EM703或CAM)對(duì)HIV-1感染的M-MΦ中酪氨酸激酶Hck蛋白表達(dá)的影響。
圖19(A)顯示與DMSO相比，大環(huán)內(nèi)酯衍生物(如EM、EM201、EM202、EM703或CAM)對(duì)HIV-1感染的M-MΦ中P38MAPK激活的影響，(B)顯示與DMSO相比，大環(huán)內(nèi)酯衍生物(如EM、EM201、EM202、EM703或CAM)對(duì)HIV-1感染的M-MΦ中ERK1/2激活的影響。
圖20顯示與對(duì)照組相比，p38MAPK(SB203580)抑制劑和ERK1/2(PD98059)抑制劑對(duì)HIV-1BAL株感染的M-MΦ中病毒增殖的影響。
圖21顯示與DMSO相比，不同濃度的大環(huán)內(nèi)酯(如EM722、EM730、EM732或EM736)對(duì)M-MΦ中HIV-1增殖的影響。
圖22顯示與DMSO相比，不同濃度的大環(huán)內(nèi)酯(如EM734、EM735、EM747或EM748)對(duì)M-MΦ中HIV-1增殖的影響。
圖23顯示與DMSO相比，不同濃度的大環(huán)內(nèi)酯(如EM743)對(duì)M-MΦ中HIV-1增殖的影響。
圖24顯示與DMSO相比，不同濃度的大環(huán)內(nèi)酯(如EM746、EM750或EM751)對(duì)M-MΦ中HIV-1增殖的影響。
圖25顯示與DMSO相比，不同濃度的大環(huán)內(nèi)酯(如EM754)對(duì)M-MΦ中HIV-1增殖的影響。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述本發(fā)明將用下列實(shí)施例具體說明，但不限于這些實(shí)施例。
為了顯示本發(fā)明的生長抑制作用，在大環(huán)內(nèi)酯衍生物中，EM、EM201、EM202、EM703、CAM、EM722、EM730、EM732、EM736、EM734、EM735、EM747、EM748、EM743、EM746、EM750或EM751均以100mM的濃度溶解于DMSO中，之后用培養(yǎng)基稀釋使用。對(duì)照組是只用用來溶解大環(huán)內(nèi)酯衍生物的DMSO處理的M-MΦ。
M-MΦ和GM-MΦ與HIV-1BAL株接觸感染2小時(shí)，加入30μMEM、EM201、EM202、EM703、CAM、EM722、EM730、EM732、EM736、EM734、EM735、EM747、EM748、EM743、EM746、EM750或EM751，溫育14天，以時(shí)間依賴的方式測(cè)定培養(yǎng)上清液中p24蛋白的含量。
實(shí)施例1EM、EM201、EM202、EM703或CAM對(duì)M-MΦ和GM-MΦ中HIV-1增殖的影響與對(duì)照組(DMSO)相比，在添加EM201或EM703的M-MΦ中，幾乎未檢測(cè)到p24，在培養(yǎng)第14天病毒的產(chǎn)生受到強(qiáng)烈抑制(見圖13)。在添加CAM的M-MΦ中，可見大約1/2的抑制，但在添加EM或EM202的組中，可見病毒生產(chǎn)的抑制，但不如EM201和EM703強(qiáng)烈(見圖13)。對(duì)于GM-MΦ，在添加EM、EM201、EM202、EM703或CAM的組中，類似于對(duì)照組(DMSO)，在所有測(cè)定點(diǎn)幾乎均未見病毒產(chǎn)生(見圖14)。用采自3名成人志愿者的人單核細(xì)胞衍生的M-MΦ進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，獲得與圖13所示相同的結(jié)果(見圖15)。
EM201和EM703對(duì)M-MΦ中HIV-1BAL的抑制作用是濃度依賴的，在3μM或更高濃度時(shí)完全抑制病毒的產(chǎn)生(見圖16)。盡管不僅在EM201和EM703中而且在EM、EM202和CAM中也觀察到300μM時(shí)的病毒增殖，但由于是在對(duì)照組(DMSO)中觀察的，因此可能是由于用來溶解試劑的DMSO的細(xì)胞毒性，以后的實(shí)驗(yàn)將在30μM下進(jìn)行。
實(shí)施例2EM、EM201、EM202、EM703或CAM對(duì)HIV-1感染的M-MΦ的細(xì)胞病變的影響M-MΦ與HIV-1BAL株接觸感染2小時(shí)，加入30μM EM、EM201、EM202、EM703或CAM，溫育，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)。在對(duì)照組(DMSO)和添加EM、EM202或CAM的組中，略微觀察到MGC的形成，這與實(shí)施例1所示的p24蛋白含量的增多相一致，但在添加EM201和EM703的組中，未見細(xì)胞病變作用，如MCG的形成(見圖17)。
實(shí)施例3EM、EM201、EM202、EM703或CAM對(duì)HIV-1感染的M-MΦ中酪氨酸激酶Hck蛋白的影響如上所述，M-MΦ強(qiáng)烈表達(dá)酪氨酸激酶Hck蛋白，用反義寡核苷酸調(diào)節(jié)酪氨酸激酶Hck蛋白的表達(dá)能抑制HIV-1在M-MΦ中的增殖。該結(jié)果表明，酪氨酸激酶Hck蛋白的表達(dá)是M-MΦ中HIV-1增殖所必需的。由于EM201和EM703抑制M-MΦ中HIV-1的增殖，提示在這些試劑處理的M-MΦ中，酪氨酸激酶Hck蛋白的表達(dá)受到抑制。
因此，M-MΦ與HIV-1BAL株接觸感染2小時(shí)，加入30μM EM、EM201、EM202、EM703或CAM，溫育，在感染后第2天通過Westernblotting檢測(cè)酪氨酸激酶Hck蛋白的表達(dá)。EM、EM202和CAM組顯示對(duì)病毒增殖沒有如此強(qiáng)烈的抑制作用，其中觀察到酪氨酸激酶Hck蛋白的抑制，但不如對(duì)照組(只用DMSO處理)強(qiáng)烈(見圖18)。EM201和EM703組對(duì)病毒增殖顯示強(qiáng)烈抑制作用，其中酪氨酸激酶Hck蛋白的表達(dá)受到強(qiáng)烈抑制(見圖18)。
實(shí)施例4EM、EM201、EM202、EM703或CAM對(duì)HIV-1感染的M-MΦ中p38MAPK和ERK1/2激活的影響p38MAPK和ERK1/2(p42/44MAPK)參與胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制的多種反應(yīng)。利用Western blotting檢測(cè)HIV-1BAL株感染的M-MΦ中p38MAPK和ERK1/2的酪氨酸磷酸化。結(jié)果是，病毒感染強(qiáng)烈誘導(dǎo)p38MAPK的酪氨酸磷酸化，但ERK1/2的酪氨酸磷酸化較弱。該結(jié)果表明，p38MAPK的激活對(duì)于M-MΦ中的病毒增殖至關(guān)重要。
因此，檢測(cè)了EM、EM201、EM202、EM703和CAM對(duì)p38MAPK和ERK1/2激活的影響，它們對(duì)M-MΦ中的病毒增殖具有抑制作用。
向HIV-1BAL株感染的M-MΦ中加入30μM EM、EM201、EM202、EM703或CAM，在培養(yǎng)的第2天利用Western blotting檢測(cè)p38MAPK的酪氨酸磷酸化。在添加EM、EM202和CAM(它們對(duì)病毒增殖的抑制作用不是太強(qiáng))的組中，可見p38MAPK的酪氨酸磷酸化降低，但不如對(duì)照組(DMSO)強(qiáng)。在添加EM201和EM703(它們強(qiáng)烈抑制病毒增殖)的組中，p38MAPK的酪氨酸磷酸化顯著降低[見圖19(A)]。在任何組中，p38MAPK的總量(磷酸化和非磷酸化p38MAPK的總和)相等。這些結(jié)果提示，M-MΦ中EM、EM201、EM202、EM703和CAM對(duì)病毒增殖的抑制參與p38MAPK的抑制。
另一方面，在添加EM、EM202和CAM(它們對(duì)病毒增殖的抑制作用不是太強(qiáng))的組中，與對(duì)照組(DMSO)相同，ERK1/2的酪氨酸磷酸化較弱，但在添加EM201和EM703(它們對(duì)病毒增殖顯示強(qiáng)烈抑制作用)的組中，可見ERK1/2的酪氨酸磷酸化增強(qiáng)。在任何組中，ERK1/2的總量(磷酸化和非磷酸化ERK1/2的總和)相等[見圖19(B)]。
實(shí)施例5p38MAPK抑制劑對(duì)HIV-1感染的M-MΦ中病毒增殖的影響，添加本發(fā)明使用的EM、EM201、EM202、EM703和CAM可以抑制根據(jù)實(shí)施例4的結(jié)果，提示p38MAPK激活對(duì)于M-MΦ中HIV-1的增殖至關(guān)重要，EM、EM201、EM202、EM703和CAM對(duì)HIV-1增殖的抑制作用由這些物質(zhì)對(duì)p38MAPK激活的抑制作用引起。
因此，向HIV-1BAL株感染的M-MΦ中加入濃度為10μM的p38MAPK抑制劑SB203580--(4-[4-氟-苯基]-2-[4-甲基亞磺酰苯基]-5-[4-吡啶基]-1H-咪唑)，和ERK1/2抑制劑PD98059--(2-[2-氨基-3-甲氧苯基]-4H-1-苯并吡喃-4-酮)，并且檢測(cè)對(duì)病毒的影響。
當(dāng)向HIV-1BAL株感染的M-MΦ中加入10μM SB203580并溫育時(shí)，甚至在第14天仍幾乎未檢測(cè)到p24蛋白，而且病毒增殖受到抑制(見圖20)。另一方面，當(dāng)加入10μM ERK1/2抑制劑PD98059時(shí)，對(duì)照組中p24蛋白的含量沒有不同，并且可見病毒增殖(見圖20)。根據(jù)這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果，針對(duì)巨噬細(xì)胞的HIV-1株在M-MΦ中的增殖必須需要p38MAPK的激活，而認(rèn)為ERK1/2的作用較小。
實(shí)施例6本發(fā)明使用的EM722、EM730、EM732和EM736對(duì)M-MΦ中HIV-1增殖的影響M-MΦ與HIV-1BAL株接觸感染2小時(shí)，加入不同濃度的EM722、EM730、EM732或EM736，溫育10天，以時(shí)間依賴的方式測(cè)定培養(yǎng)上清液中p24蛋白的含量。只用用來溶解大環(huán)內(nèi)酯衍生物的DMSO處理的組作為對(duì)照組。
根據(jù)培養(yǎng)天數(shù)，觀察到在只添加DMSO的對(duì)照組的培養(yǎng)上清液中p24蛋白含量升高，并且可見HIV-1的增殖。然而，與對(duì)照組相比，在添加EM722、EM730、EM732或EM736的組中，根據(jù)試劑濃度，p24蛋白的產(chǎn)生受到抑制，并可見對(duì)病毒生產(chǎn)的抑制。特別是，在30μM濃度時(shí)，EM722、EM730、EM732和EM736中的任一種試劑均幾乎完全抑制病毒的產(chǎn)生(見圖21)。用試劑EM703、EM727、EM744、EM745、EM742、EM740、EM721、EM723、EM724、EM725、EM728、EM729、EM731、EM738、EM739、EM733、EM749和EM726獲得類似于圖21的結(jié)果。此外，用采自3名成年健康志愿者的人單核細(xì)胞衍生的M-MΦ進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)獲得與圖21相同的結(jié)果。
實(shí)施例7本發(fā)明使用的EM734、EM735、EM747和EM748對(duì)M-MΦ中HIV-1增殖的影響M-MΦ與HIV-1BAL株接觸感染2小時(shí)，加入不同濃度的EM734、EM735、EM747和EM748，溫育10天，以時(shí)間依賴的方式測(cè)定培養(yǎng)上清液中p24蛋白的含量。只用用來溶解大環(huán)內(nèi)酯衍生物的DMSO處理的組作為對(duì)照組。
根據(jù)培養(yǎng)天數(shù)，觀察到在只添加DMSO的對(duì)照組的培養(yǎng)上清液中p24蛋白含量升高，并且可見HIV-1的增殖。然而，與對(duì)照組相比，在添加EM734、EM735、EM747和EM748的組中，根據(jù)試劑濃度，p24蛋白的產(chǎn)生受到抑制，并可見對(duì)病毒生產(chǎn)的抑制。特別是，在30μM濃度時(shí)，EM734、EM735、EM747和EM748中的任一種試劑均幾乎完全抑制病毒的產(chǎn)生(見圖22)。此外，用采自3名成年健康志愿者的人單核細(xì)胞衍生的M-MΦ進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)獲得與圖22相同的結(jié)果。
實(shí)施例8本發(fā)明使用的EM743對(duì)M-MΦ中HIV-1增殖的影響M-MΦ與HIV-1BAL株接觸感染2小時(shí)，加入不同濃度的EM743，溫育10天，以時(shí)間依賴的方式測(cè)定培養(yǎng)上清液中p24蛋白的含量。只用用來溶解大環(huán)內(nèi)酯衍生物的DMSO處理的組作為對(duì)照組。
根據(jù)培養(yǎng)天數(shù)，觀察到在只添加DMSO的對(duì)照組的培養(yǎng)上清液中p24蛋白含量升高，并且可見HIV-1的增殖。然而，與對(duì)照組相比，在添加EM743的組中，根據(jù)試劑濃度，p24蛋白的產(chǎn)生受到抑制，并可見對(duì)病毒生產(chǎn)的抑制。特別是，在30μM濃度時(shí)，EM743幾乎完全抑制病毒的產(chǎn)生(見圖23)。此外，用采自3名成年健康志愿者的人單核細(xì)胞衍生的M-MΦ進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)獲得與圖23相同的結(jié)果。
實(shí)施例9本發(fā)明使用的EM746、EM750和EM751對(duì)M-MΦ中HIV-1增殖的影響M-MΦ與HIV-1BAL株接觸感染2小時(shí)，加入不同濃度的EM746、EM750和EM751，溫育10天，以時(shí)間依賴的方式測(cè)定培養(yǎng)上清液中p24蛋白的含量。只用用來溶解大環(huán)內(nèi)酯衍生物的DMSO處理的組作為對(duì)照組。
根據(jù)培養(yǎng)天數(shù)，觀察到在只添加DMSO的對(duì)照組的培養(yǎng)上清液中p24蛋白含量升高，并且可見HIV-1的增殖。然而，與對(duì)照組相比，在添加EM746、EM750和EM751的組中，根據(jù)試劑濃度，p24蛋白的產(chǎn)生受到抑制，并可見對(duì)病毒生產(chǎn)的抑制。特別是，在30μM濃度時(shí)，EM746、EM750和EM751中的任一種試劑均幾乎完全抑制病毒的產(chǎn)生(見圖24)。此外，用采自3名成年健康志愿者的人單核細(xì)胞衍生的M-MΦ進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)獲得與圖24相同的結(jié)果。
實(shí)施例10本發(fā)明使用的EM754對(duì)M-MΦ中HIV-1增殖的影響M-MΦ與HIV-1BAL株接觸感染2小時(shí)，加入不同濃度的EM754，溫育10天，以時(shí)間依賴的方式測(cè)定培養(yǎng)上清液中p24蛋白的含量。只用用來溶解大環(huán)內(nèi)酯衍生物的DMSO處理的組作為對(duì)照組。
根據(jù)培養(yǎng)天數(shù)，觀察到在只添加DMSO的對(duì)照組的培養(yǎng)上清液中p24蛋白含量升高，并且可見HIV-1的增殖。然而，與對(duì)照組相比，在添加EM754的組中，根據(jù)試劑濃度，p24蛋白的產(chǎn)生受到抑制，并可見對(duì)病毒生產(chǎn)的抑制。特別是，在30μM濃度時(shí)，EM754幾乎完全抑制病毒的產(chǎn)生(見圖25)。此外，用采自3名成年健康志愿者的人單核細(xì)胞衍生的M-MΦ進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)獲得與圖25相同的結(jié)果。
如上所述，認(rèn)為本發(fā)明使用的大環(huán)內(nèi)酯衍生物對(duì)針對(duì)巨噬細(xì)胞的HIV-1在來源于人單核細(xì)胞的M-MΦ中的增殖具有抑制作用。特別是，公認(rèn)EM201和EM703具有強(qiáng)烈抑制針對(duì)巨噬細(xì)胞的HIV-1在M-MΦ中增殖的作用，它們甚至在3μM濃度時(shí)仍幾乎完全抑制病毒的增殖。在病毒接觸感染后向初級(jí)培養(yǎng)基中只添加EM201或EM703，甚至在溫育的后第14天，EM201和EM703對(duì)病毒增殖的抑制作用仍顯示95％或更高的充分抑制作用。
此外，EM、EM202和CAM根據(jù)藥物濃度也顯示抑制病毒的產(chǎn)生，30μM濃度的EM722、EM730、EM732、EM736、EM734、EM735、EM747、EM748、EM743、EM746、EM750、EM751和EM754可見相同的抑制作用，幾乎完全抑制。根據(jù)這一事實(shí)，認(rèn)為抑制作用與大環(huán)內(nèi)酯類的藥理學(xué)性質(zhì)有關(guān)，它們?cè)诮M織巨噬細(xì)胞中積累，具有長期的作用。
如上所述，酪氨酸激酶Hck蛋白的表達(dá)是M-MΦ中HIV-1增殖所必需的，并且由于本發(fā)明的不同大環(huán)內(nèi)酯衍生物抑制M-MΦ中酪氨酸激酶Hck蛋白的表達(dá)，提示這種抑制作用可能是這些物質(zhì)對(duì)HIV-1增殖的抑制作用的作用機(jī)制之一。此外，由于對(duì)病毒增殖顯示抑制作用的本發(fā)明的不同大環(huán)內(nèi)酯衍生物可抑制p38MAPK的酪氨酸磷酸化，提示HIV-1增殖的抑制是基于這些物質(zhì)對(duì)p38MAPK激活的抑制。
工業(yè)適用范圍如上所述，本發(fā)明涉及大環(huán)內(nèi)酯類衍生物抑制人類免疫缺陷綜合征病毒在來源于人單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞中感染和增殖的用途。本發(fā)明不僅可用作抑制人類免疫缺陷綜合征病毒感染和增殖的藥物，而且預(yù)期具有作為HAART輔藥的臨床用途。
參考文獻(xiàn)
1)Tae-Wook Chun，Richard T.Davey Jr.，Mario Ostrowski，J.Shawn Justement，Delphine Engel，James I.Mullins和Anthony S.Fauci存在的病毒儲(chǔ)存所與高活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療停止后血漿病毒敗血癥復(fù)發(fā)之間的關(guān)系.Nat Med 6757-761，2000.
2)Lewis K.Schrager，M.Patricia D’Souza接受有效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒聯(lián)合治療的患者中HIV-1的細(xì)胞和解剖學(xué)貯存.Jama 28067-71，19983)Swingler S，Mann A，Jacque J，Brichacek B，Sasseville VG，Williams K，Lackner AA，Janoff EN，Wang R，F(xiàn)isher D，StevensonM.HIV-1 Nef介導(dǎo)感染的巨噬細(xì)胞引起的淋巴細(xì)胞趨化和激活.NatMed 5997-1003，1999.
4)Kiyoko Akagawa，Iwao Komuro和Keiko Mochida來源于單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞的多樣性.Inflammation and Immunity，8，360-366，2000.
5)Komuro，I.，Keicho，N.，Iwamoto，I.和Akagawa，K.S.由于過氧化氫酶活性的基礎(chǔ)和可誘導(dǎo)水平較高，人肺泡巨噬細(xì)胞和GM-CSF誘導(dǎo)的單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞是H2O2抗性的.J.Biol.Chem.27624360-24364，2001.
6)Hashimoto，S.，Komuro，I.，Yamada，M.Akagawa，K.S.IL-10抑制培養(yǎng)早期依賴GM-CSF的人單核細(xì)胞的存活，并且抑制巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生.J.Immunol.1673619-3625，2001.
7)Hashimoto，S.，Yamada，M.，Motoyoshi，K.和Akagawa，K.S.白介素-10使巨噬細(xì)胞集落刺激因子誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞生長和分化增強(qiáng).BLOOD 89315-321，1997.
8)Akagawa，K.S.，Takasuka，N.，Nozaki，Y.，Komuro，I.，Miyuki，A.，Ueda，M.，Naito，M.和Takahashi，K.由人單核細(xì)胞產(chǎn)生CD1+RelB+樹突細(xì)胞和TRAP陽性破骨細(xì)胞樣多核巨細(xì)胞.BLOOD884029-4039，1996.
9)Matsuda，S.，Akagawa，K.，Honda，M.，Yokota，Y.，Takabe，Y.和Takemori，T.粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子誘導(dǎo)的來源于人單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞中HIV復(fù)制的抑制.AIDS Research and HumanRetroviruses，111031-1038，1995.
10)《炎癥和免疫和大環(huán)內(nèi)酯類進(jìn)展》，Sup.Kihachiro Shimizu和Satoshi Omura編寫，Shoji KudoIyaku Journal，Inc.Osaka，1996.
11)Hashimoto，S.，Komuro，I.，Yamada，M.，Akagawa，K.S.IL-10抑制培養(yǎng)早期依賴GM-CSF的人單核細(xì)胞的存活，并且抑制巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生.J.Immunol 1673619-3625，2001.
12)Nakata，K.，Weiden，M.，Harkin，T.，Ho，D.和Rom，W.N.(1995).HIV-1感染患者的肺泡巨噬細(xì)胞中前病毒的低拷貝數(shù)和有限變異性肺與血液巨噬細(xì)胞群體之間HIV-1遺傳差異的證據(jù).Mol Med 1，744-757.
13)Kiyoko Akagawa，Iwao Komuro和Keiko Mochida來源于單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞的多樣性.Inflammation and Immunity，8，360-366，2000.
Akagawa，K.S.，Takasuka，N.，Nozaki，Y.，Komuro，I.，Miyuki，A.，Ueda，M.，Naito，M.和Takahashi，K.由人單核細(xì)胞產(chǎn)生CD1+RelB+樹突細(xì)胞和TRAP陽性破骨細(xì)胞樣多核巨細(xì)胞.BLOOD 884029-4039，1996.
14)Komuro，I.，Keicho，N.，Iwamoto，I.和Akagawa，K.S.由于過氧化氫酶活性的基礎(chǔ)和可誘導(dǎo)水平較高，人肺泡巨噬細(xì)胞和GM-CSF誘導(dǎo)的單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞是H2O2抗性的.J.Biol.Chem.27624360-24364，2001.
權(quán)利要求
1.大環(huán)內(nèi)酯類衍生物用于制備通過抑制人類免疫缺陷綜合征病毒在來源于人單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞中感染和增殖而治療患者的藥物之的用途，其中，大環(huán)內(nèi)酯衍生物是下列之一氧雜環(huán)十四烷-2，10-二酮，4[(2，6-雙脫氧-3-O-甲基-α-L-核糖-吡喃己糖基)氧]-14-乙基-7，12，13-三羥基-3，5，7，9，11，13-六甲基-6-[[3，4，6-三脫氧-3-(二甲氨基)-β-D-木糖-吡喃己糖基]氧；11-(1’-羥丙基)-3-[2，6-雙脫氧-3-C-甲基-α-L-核糖-吡喃己糖基]氧]-5-[(3，4，6-三脫氧-3-(二甲氨基)-β-D-木糖-吡喃己糖基)氧1-2，4，6，8，11，14-六甲基-10，13，15-三-氧雜三環(huán)[9.2.1.1.9.6]-十五烷-1-酮；6，15，16-三氧雜三環(huán)[10.2.1.11，4]十六烷，紅霉素衍生物；4，13-二氧雜雙環(huán)[8.2.1]十三-12-烯-5-酮，7-[(2，6-雙脫氧-3-C-甲基-α-L-核糖-吡喃己糖基)氧]-3-(1，2-二羥基-1-甲丁基)-2，6，8，10，12-五甲基-9-[[3，4，6-三脫氧-3-(二甲氨基)-β-D-木糖-吡喃己糖基]氧]；氧雜環(huán)-十四烷-2，10-二酮，4-[(2，6-雙脫氧-3-O-甲基-α-L-核糖-吡喃己糖基)氧]-14-乙基-12，13-二羥基-7-甲氧基-3，5，7，9，11，13-六甲基-6-[[3，4，6-三脫氧-3-(二甲氨基)-β-D-木糖-吡喃己糖基]氧]；脫(3’-N-甲基)-8，9-脫水-假紅霉素A6，9-半縮酮或其鹽；脫(3’-N-甲基)-3’-N-磺酰基-8，9-脫水-假紅霉素A6，9-半縮酮或其鹽；脫(3’-N-甲基)-[3’-N-(3-羥基-1-丙基)]-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；脫(3’-N-甲基)-3’-N-(2-乙酰氧基乙基)-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；脫(3’-N-甲基)-3’-N-氰甲基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；脫(3’-N-甲基)-3’-N-(2-氟乙基)-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；雙-脫(3’-N-甲基)-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；雙-脫(3’-N-甲基)-3’-N-乙基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；雙-脫(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二乙基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；雙-脫(3’-N-甲基)-3’-N-烯丙基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；雙-脫(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二烯丙基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；雙-脫(3’-N-甲基)-3’-N-炔丙基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；雙脫(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二炔丙基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；雙-脫(3’-N-甲基)-3’-N-丙基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；雙-脫(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二丙基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；雙-脫(3’-N-甲基)-3’-N-己基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；雙-脫(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二己基-8，9-脫水-假紅霉素A6，9-半縮酮或其鹽；雙-脫(3’-N-甲基)-3’-N-芐基-8，9-脫水-假紅霉素A6，9-半縮酮或其鹽；雙-脫(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二芐基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；雙-脫(3’-N-甲基)-3’-N-(2-丙基)-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；雙-脫(3’-N-甲基)-3’，3’-N，N-二-(10-溴-1-癸基)-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；雙-脫(3’-N-甲基)-3’-N-乙?；?8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；脫(3’-二甲氨基)-3’-哌啶基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；脫(3’-二甲氨基)-3’-吡咯烷基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；脫(3’-二甲氨基)-3’-嗎啉基-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；脫(3’-二甲氨基)-3’-[六氫-1(1H)-氮雜 基]-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；脫(12-羥基)-脫[12-(1-羥丙基)]-12-羥基-肟-8，9-脫水-假紅霉素A6，9-半縮酮或其鹽；脫[12-(1-羥丙基)]-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；脫(12-羥基)-脫[12-(1-羥丙基)]-12-氨基-8，9-脫水-假紅霉素A6，9-半縮酮或其鹽；脫(3’-N-甲基)-脫[12-(1-羥丙基)]-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；脫(3-O-克拉定糖基)-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽；和脫(3-O-克拉定糖基)-脫[3’-N-甲基]-8，9-脫水-假紅霉素A 6，9-半縮酮或其鹽。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的用途，其中來源于人單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞是M型M巨噬細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1或2的用途，其中大環(huán)內(nèi)酯類衍生物對(duì)病毒增殖的抑制是通過對(duì)M型M巨噬細(xì)胞中酪氨酸激酶Hck蛋白表達(dá)的抑制和對(duì)p38MAPK激活的抑制。
4.權(quán)利要求
1-3中任一項(xiàng)的用途，其中大環(huán)內(nèi)酯類衍生物為11-(1’-羥丙基)-3-[2，6-雙脫氧-3-C-甲基α-L-核糖-吡喃己糖基]氧]-5-[(3，4，6-三脫氧-3-(二甲基氨基)-β-D-木糖-吡喃己糖基)氧]-2，4，6，8，11，14-六甲基-10，13，15-三-氧雜三環(huán)[9.2.1.1.9，6]-十五烷-1-酮或4，13-二氧雜雙環(huán)[8.2.1]十三-12-烯-5-酮，7-[(2，6-雙脫氧-3-C-甲基-α-L-核糖-吡喃己糖基)氧]-3-(1，2-二羥基-1-甲基丁基)-2，6，8，10，12-五甲基-9-[(3，4，6-三脫氧-3-(二甲氨基)-β-D-木糖-吡喃己糖基)氧]。
5.前述權(quán)利要求
任一項(xiàng)的用途，其中藥物是用于正在經(jīng)歷或業(yè)已經(jīng)過高活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的患者。
6.大環(huán)內(nèi)酯類衍生物用于體外控制人類免疫缺陷綜合征病毒在來源于人單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞中感染和增殖的用途，其中大環(huán)內(nèi)酯衍生物如權(quán)利要求
1所定義。
7.權(quán)利要求
6的用途，其中衍生物如權(quán)利要求
3或4定義，和/或巨噬細(xì)胞如權(quán)利要求
2定義。
專利摘要
本發(fā)明涉及抑制人類免疫缺陷綜合征病毒(HIV-1)感染和增殖的藥劑，HIV感染免疫活性細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞或樹突細(xì)胞，并導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的破壞，并且涉及已知化合物——大環(huán)內(nèi)酯衍生物抑制人類免疫缺陷綜合征病毒在來源于人單核細(xì)胞的M型巨噬細(xì)胞中感染和增殖的用途。本發(fā)明可用于以低成本化療劑治療HIV-1感染患者，另外，在臨床上也可用作HAART的輔藥。
文檔編號(hào)A61P43/00GKCN1183915SQ02155924
公開日2005年1月12日 申請(qǐng)日期2002年12月11日
發(fā)明者大村智, 赤川清子, 砂塚敏明 申請(qǐng)人:社團(tuán)法人北里研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan