間充質干細胞外泌體修復動物創傷的組合物及制備方法與流程

本發明屬于生物，具體涉及一種間充質干細胞外泌體修復動物創傷的組合物及制備方法。

背景技術：

1、隨著我國人民生活品質的提高和老齡化的加劇，越來越多的家庭選擇養寵物作為伙伴，然而這也會帶來更多的皮膚損傷問題。當前的治療方法如清創、局部藥物治療和縫合等，存在一些問題如傷口愈合時間長、留有瘢痕和毛囊無法再生的情況。此外，由于寵物治療的周期長和費用高，有時會導致主人選擇遺棄寵物，這對治療產生了巨大的壓力。我國的傳統中醫理念注重"治療疾病要找到根本"，這在中醫外科治療中也得到了體現。對于治療創傷，依據創傷的特性如熱、毒、瘀、腐等進行相應的處理，同時，針對由疾病引發的創傷，根據其特殊性質，如難愈性，采取特定的治療方法。此外，利用藥物的外用方式，避免了口服藥物可能產生的首過效應和肝臟腎臟的代謝，對胃黏膜也沒有刺激，這種方法具有廣泛的適用性、操作簡便、價格合理和使用安全的優點。近年來,隨著分子生物學迅速發展、新技術的廣泛應用以及不同學科之間的交叉合作,創面修復的基礎研究已經延伸到細胞、分子和基因層面。盡管干細胞在組織修復和再生中展現出巨大的應用潛力，并在轉化醫學領域得到了廣泛應用，然而，鑒于細胞因子的種類繁多且費用較高，將細胞因子用于治療創口修復并不可取。近年的研究結果顯示，干細胞實現的組織修復和再生功能大部分是通過其旁分泌效應實現的，而非在受傷部位的增殖和分化。然而。其中，外泌體是一種重要的旁分泌因子，越來越多的實驗證實其在干細胞修復受損組織和組織再生過程中起著至關重要的作用。實驗證明，脂肪干細胞來源外泌體在晚期可以抑制膠原的合成而減輕瘢痕。現有技術對開展低成本來源原料的干細胞修復材料、提取物等調節方面應用較少，沒有明確的原料和途徑。一般干細胞培養，采用二維培養，在這種情況下，必須培養大量的細胞才能獲得大量的外泌體，導致成本增加。通常，它通過外泌體與細胞肉湯分離的方式獲得。它在一般的干細胞培養中培養為二維。因為在這種情況下必須培養許多免疫的細胞，才能獲得大量的外泌體，因此帶來了成本的增加。此外，從具有大量細胞的大細胞培養物中分離外泌體是一項重要的勞動要求。對于外泌體的分離和純化，主要使用離心和切向流過濾(tff)。在離心的情況下，由于可應用的容量有限，不適合從大量細胞培養基中分離外泌體，與離心相比，tff具有適合大規模處理的優點，但在過濾過程中存在剪切應力和外泌體損失等各種問題。與離心相比，它不適合于在離心的情況下可以應用限制的容量，并且從散裝細胞肉湯中分離外泌體，并且它適合于散裝過程的優點。然而，隨著外泌體的損失和剪切應力(剪切應力)等的產生，存在各種問題。

2、基于以上的所述，結合間充質干細胞與外泌體的聯用，以及我國傳統中醫的理念，可以探索一種全新的寵物創傷治療方法，這種方法將間充質干細胞與外泌體相結合，以及配合我國傳統的復方中藥外用制劑，以期能夠更有效地治療寵物的大面積或難愈創傷、皮下脂肪空腔等臨床問題，因此開展此方面的研究迫在眉睫。

技術實現思路

1、本發明的目的保護一種間充質干細胞外泌體修復動物創傷的組合物以及制備方法。

2、所述組合物含有以下seq?id?no.1、seq?id?no.2、seq?id?no.3、seq?id?no.4和seq?id?no.5所示的多肽。

3、進一步的，所述seq?id?no.1、seq?id?no.2、seq?id?no.3、seq?id?no.4多肽分別為白及、地榆、冬凌草、甘草提取原料制備得到。

4、進一步的，所述seq?id?no.5為人源間充質干細胞提取原料制備得到。

5、進一步的，所述seq?id?no.1、seq?id?no.2、seq?id?no.3、seq?id?no.4多肽的制備方法為：在常溫條件下，將1,500ml濃度為70％的乙醇(相當于稀釋比例1：10，即w/v)分別與白及、地榆、冬凌草、甘草粉末混合并浸泡24小時，分別提取出150g的凍干粉末。經過初步過濾后，再次使用紗布進行二次過濾，然后在45℃的水浴中借助旋轉真空蒸發器進行濃縮，接著加入5ml濃縮液、3g的果膠酶和100ml蒸餾水，在50℃的環境下靜置2小時，隨后先用紗布過濾，再與果膠酶混合，最后在50℃下進行酶促反應2小時。酶促反應結束后，在95℃下滅菌10分鐘，然后將發酵菌株進行培養，紗布和超納濾過濾，利用高效液相色譜-質譜測定、選擇目標得到多肽序列。

6、進一步的，所述seq?id?no.5多肽的制備方法為：

7、將3x?104臍帶的間充質干細胞接種于150mm用mem培養基中，以80％至90％的速度振蕩培養，48小時后，300g離心3min并除去細胞碎片，然后以2,000g離心10min，將上清液轉移到新管中，然后以10,000g離心30min，最后以187,000g離心2h，得到沉淀物，用含有蔗糖緩沖液和emtd肽(1um)的組合物處理該沉淀物，用軌道振蕩器孵育15分鐘，用于使用胰蛋白酶處理沉淀15分鐘，然后分離就得到了酶解物；將酶解物，利用高效液相色譜-質譜測定、選擇目標得到多肽序列。

8、進一步，所述多肽優選氨基酸序列為：

9、seq?id?no.1：lpksaeepgpgssk、seq?id?no.2：sipkessilsgakpp、seq?id?no.3：fpaaasqgsakppkp、seq?id?no.4：qgsaaaaskppkp、seq?id?no.5：kelaasqglaepaskp。

10、進一步，所述的組合物在抹膏、乳膏、噴劑、精油上的應用。

11、本發明取得的技術效果為：

12、通過培養間充質干細胞在含有源自葡萄糖、蔗糖和多肽的培養基組合物中大量生產細胞外泌體，大規模生產方法可得到高純度，建立了一套干細胞外分泌、小分子多肽的提取和評估方法體系，方法簡單容易操作。本發明對比常用市售傷口修復類藥品本測試藥物在試驗過程中未出現不良事件，而且使用測試藥物治療后，傷口愈合時間明顯減少，沒有形成瘢痕、無毛囊再生等問題，基本達到顯效的程度，部分創傷恢復到痊愈。而且，創傷預后問題明顯減少，給寵物本身及其主人帶來極大的便利。

技術特征：

1.間充質干細胞外泌體修復動物創傷的組合物,其特征在于：所述組合物含有以下seqid?no.1、seq?id?no.2、seq?id?no.3、seq?id?no.4和seq?id?no.5所示的多肽。

2.根據權利要求1所述的組合物，其特征在于：所述seq?id?no.1、seq?id?no.2、seq?idno.3、seq?id?no.4多肽分別為白及、地榆、冬凌草、甘草提取原料制備得到。

3.據權利要求1所述的組合物，其特征在于：所述seq?id?no.5為人源間充質干細胞提取原料制備得到。

4.根據權利要求1所述的組合物，其特征在于：所述多肽優選氨基酸序列為：

5.根據權利要求1-4所述的的組合物的應用，其特征在于：所述的組合物在抹膏、乳膏、噴劑、精油上的應用。

6.據權利要求6所述的組合物，其特征在于：所述seq?id?no.5為人源間充質干細胞提取原料制備得到。

7.間充質干細胞外泌體修復動物創傷的組合物,其特征在于：所述組合物含有以下白及提取物、地榆提取物、冬凌草提取物、甘草提取物。

8.據權利要求7所述的組合物，其特征在于：所述組合物分別按照20-30份、15-25份、25-35份、10-15份的質量配比組合。

9.據權利要求7所述的組合物，其特征在于：所述組合物制備方法為：在常溫條件下，將1,500ml濃度為70％的乙醇(相當于稀釋比例1：10，即w/v)分別與白及、地榆、冬凌草、甘草粉末混合并浸泡24小時，分別提取出150g的凍干粉末。

10.據權利要求7所述的組合物，其特征在于：所述組合物制備方法還包括：經過初步過濾后的凍干粉末，再次使用紗布進行二次過濾，然后在45℃的水浴中借助旋轉真空蒸發器進行濃縮，接著加入5ml濃縮液、3g的果膠酶和100ml蒸餾水，在50℃的環境下靜置2小時，隨后先用紗布過濾，再與果膠酶混合，最后在50℃下進行酶促反應2小時，酶促反應結束后，在95℃下滅菌10分鐘，然后將發酵菌株進行培養，紗布和超納濾過濾。

技術總結
本發明屬于生物技術領域，間充質干細胞外泌體修復動物創傷的組合物以及制備方法,所述多肽包含如SEQ?ID?NO.1所示的多肽。該多肽是基于本草藥物以及人源間充質干細胞分離中提取得到細胞分泌體、小分子多肽，通過生物信息大模型預測選擇未報到過功能的小分子多肽序列，進行了相關肌肉增殖、修復等試驗，結果表明該組合物在創傷修復方面有顯著作用。

技術研發人員：劉宇寧,郭瑞敏,曹毓琳,劉鳳嬌,劉赟
受保護的技術使用者：北京臻寵生物科技有限公司
技術研發日：
技術公布日：2024/10/21