一種用于干細胞治療的水凝膠敷料的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及醫藥領域，特別涉及一種用于干細胞治療的水凝膠敷料。
【背景技術】
[0002]皮膚是人體最大的器官，總表面積約為1.5-2.0m2，起到保護和支持機體的作用。一旦皮膚因為燒傷、創傷、潰瘍等出現損傷破壞，機體便會失去大量水分、電解質、蛋白質等，與此同時容易受到細菌及外界環境的傷害。
[0003]近年來，具有自我更新、高度增殖和多向分化的潛能的干細胞已逐漸成為創面愈合修復研究的焦點。干細胞(如骨髓間充質干細胞，脂肪間充質干細胞等)是一類具有自我更新、多向分化和高度增殖能力的細胞，它能有有效感受周圍微環境，并根據微環境進行準確分化并分泌相應的調控因子，促進組織的修復與再生。因此，將干細胞應用于皮膚創面修復能夠有效的加快創面的愈合，達到更好的修復效果。
[0004]目前，常用的干細胞治療通常采用直接注射、載體或生物支架植入體內，干細胞直接與人體接觸并參與組織修復過程。然而，《癌癥研究》報告的西班牙和丹麥科學家發現顯示:在體外增殖過程中，有部分干細胞可能發生癌變，這意味著干細胞直接與機體接觸用于組織修復具有潛在的危險性。干細胞的安全應用逐漸引起了科學家的廣泛關注與重視。如何能夠更安全的利用干細胞促進皮膚修復的同時，又避免干細胞與機體直接接觸所帶來的潛在危險成為醫學研究的熱點。
[0005]水凝膠類創面敷料作為一種理想的創面敷料，具有維持創面足夠濕度，并吸收大量滲出液和有毒物質的優點。與此同時，水凝膠的孔隙結構又利于創面的氣體交換，保證創面良好的透氣性。而且，許多水凝膠類敷料(如PVA)由于其光滑的表面結構，創面組織不易于發生黏連，減輕了更換敷料的二次損傷。鑒于水凝膠敷料良好的通透性及物質交換性能，將干細胞接種于水凝膠的表面，干細胞所釋放的促進皮膚組織修復的生長因子(如VEGF，bFGF)等活性因子通過水凝膠的多孔結構滲透到創口表面，而干細胞不能穿過水凝膠直接與創面接觸，從而利用干細胞分泌的活性因子的同時，避免了干細胞與機體直接接觸，實現更安全的干細胞應用。因此，水凝膠類創面敷料在創面修復上發揮重要作用，它具有應用簡便、迅速、造價較低的優點，適用于大面積創傷修復與急救。然而，水凝膠不利于細胞粘附是把“雙刃劍”，它既能避免與創面黏連減少更換敷料的二次損傷，但又不利于在其上表面接種干細胞，以利用干細胞分泌的活性因子促進創面修復。
[0006]目前，有研究將干細胞混入水凝膠，直接敷于創面進行修復治療。該技術由于水凝膠內部空間限制，同時細胞以游離的狀態存在，既不能保持干細胞良好的狀態，同時不利于干細胞增殖分化，以更好地釋放促進創面修復的活性因子。同時，這種方法干細胞不可避免的會與皮膚直接接觸，仍然存在著潛在的安全風險性。因此，提供一種有利于干細胞粘附的、安全的水凝膠敷料具有重要的現實意義。
【發明內容】
[0007]有鑒于此，本發明提供了一種用于干細胞治療的水凝膠敷料。該水凝膠敷料有利于干細胞的粘附和增殖，同時可實現干細胞的安全應用。
[0008]為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案:
[0009]本發明提供了一種用于干細胞治療的水凝膠敷料，該水凝膠敷料包括水凝膠層和水凝膠改性層，水凝膠改性層所用材料為含有光活性基團的明膠。
[0010]本發明通過紫外交聯技術將含有光活性基團的明膠固定于水凝膠敷料的一面，實現對水凝膠敷料的表面改性，以利于干細胞的粘附和增殖，將干細胞接種于水凝膠的改性的上表面，使干細胞與創面隔絕，干細胞分泌的活性因子可透過水凝膠敷料滲透到創面，從而達到促進創面愈合效果的同時，避免了干細胞與創面的直接接觸，實現干細胞安全應用。
[0011]作為優選，含有光活性基團的明膠為經4-疊氮苯甲酸修飾的明膠。4-疊氮苯甲酸在紫外的激發下，產生活性氮，從而將明膠接枝到水凝膠碳鏈上。
[0012]作為優選，水凝膠敷料的制備方法為:通過紫外交聯技術將水凝膠改性層固定于水凝膠層上。
[0013]作為優選，紫外交聯的時間為10?60s。
[0014]在本發明提供的一些實施例中，紫外交聯的時間為20s。
[0015]作為優選，水凝膠層所用材料為水凝膠，水凝膠為聚乙烯醇和/或殼聚糖。但本發明并非限定于此，本領域技術人員認為可行的水凝膠材料均在本發明的保護范圍之內。
[0016]作為優選，含有光活性基團的明膠的濃度為0.0I?I Omg/mL。
[0017]在本發明提供的一些實施例中，含有光活性基團的明膠的濃度為lmg/mL。
[0018]作為優選，水凝膠層上與水凝膠改性層相接觸的表面設置有凹陷結構。這種凹陷結構一方面有利于干細胞在凹陷結構內生存、生長和繁殖，形成細胞集落，保持細胞活性和生物活性物質的表達和釋放；另一方面，接種于凹陷結構內的干細胞通過水凝膠完全與皮膚隔離，避免了干細胞與人體直接接觸而帶來的安全性問題。同時，干細胞分泌的生長因子等生物活性物質可以通過水凝膠的網絡結構釋放于傷口表面，促進傷口的修復。而干細胞集落的形成，由于細胞之間存在彼此的接觸性刺激，能夠更好地分泌各種細胞因子，提高皮膚修復的效率。水凝膠下表面仍然保持其不利于細胞粘附的特性，敷料不會發生粘連，便于敷料的更換。
[0019]在本發明提供的一些實施例中，凹陷結構為孔和/或槽。但本發明并非限定于此，本領域技術人員認為可行的凹陷結構均在本發明的保護范圍之內。
[0020]在本發明提供的一些實施例中，還包括干細胞，干細胞接種于水凝膠改性層上。
[0021]在本發明提供的一些實施例中，干細胞的培養時間為I?14天。
[0022]本發明提供了一種用于干細胞治療的水凝膠敷料，該水凝膠敷料包括水凝膠層和水凝膠改性層，水凝膠改性層所用材料為含有光活性基團的明膠。本發明至少具有如下優勢之一:
[0023]1、本發明通過紫外交聯技術將含有光活性基團的明膠固定于水凝膠敷料的一面，實現對水凝膠敷料的表面改性，以利于干細胞的粘附和增殖；
[0024]2、將干細胞接種于水凝膠的改性的上表面，使干細胞與創面隔絕，干細胞分泌的活性因子可透過水凝膠敷料滲透到創面，從而達到促進創面愈合效果的同時，避免了干細胞與創面的直接接觸，實現干細胞安全應用；
[0025]3、水凝膠層上與水凝膠改性層相接觸的表面設置有凹陷結構，這種凹陷結構一方面有利于干細胞在凹陷結構內生存、生長和繁殖，形成細胞集落，保持細胞活性和生物活性物質的表達和釋放;另一方面，接種于凹陷結構內的干細胞通過水凝膠完全與皮膚隔離，避免了干細胞與人體直接接觸而帶來的安全性問題。而干細胞集落的形成，由于細胞之間存在彼此的接觸性刺激，能夠更好地分泌各種細胞因子，提高皮膚修復的效率；
[0026]4、水凝膠敷料下表面仍然保持其不利于細胞粘附的特性，敷料不會發生粘連，便于敷料的更換。
【附圖說明】
[0027]圖1示孔型水凝膠敷料結構示意圖；其中，a為孔型水凝膠敷料俯視圖，I示水凝膠層，2示水凝膠改性層;b為孔型水凝膠敷料切面圖，I示水凝膠層，2示水凝膠改性層；
[0028]圖2示干細胞接種水凝膠敷料的示意圖；
[0029]圖3示干細胞在敷料表面的生長粘附情況;其中，a示對照組，b示試驗組；
[0030]圖4示成纖維細胞增殖情況；
[0031 ]圖5示槽型水凝膠敷料俯視圖；I示水凝膠層，2示水凝膠改性層；
【具體實施方式】
[0032]本發明公開了一種用于干細胞治療的水凝膠敷料，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發明內容】
、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
[0033]本發明提供的用于干細胞治療的水凝膠敷料中所用生物材料均可由市場購得。
[0034]下面結合實施例，進一步闡述本發明:
[0035]實施例1
[0036]水凝膠敷料(殼聚糖)的結構示意圖見圖1。其中，圖Ι-a示孔型水凝膠敷料的俯視圖，圖Ι-b示孔型水凝膠敷料的切面圖。在水凝膠上表面制造微孔，孔的底部仍保留一層水凝膠，使其與創面隔絕。在敷料使用前，只需將干細胞接種于水凝膠的上表面，即可應用于創面修復。該孔型水凝膠敷料一方面有利于干細胞在孔內生存、生長和繁殖，形成細胞集落，保持細胞活性和生物活性物質的表達和釋放;另一方面，接種于孔內的干細胞通過水凝膠完全與皮膚隔離，避免了干細胞與人體直接接觸而帶來的安全性問題。
[0037]對水凝膠敷料進行表面改性:配置一定濃度(lmg/mL)的含有光活性基團(該光活性基團為四疊氮苯甲酸通過共價結合方式與明膠的氨基結合后獲得)的明膠。將所得光活性明膠溶液平鋪于水凝膠的表面，靜置12h。將水凝膠置于紫外交聯儀進行紫外交聯20s，獲得改性后的水凝膠敷料。本發明通過光活性明膠對水凝膠上表面進行光固化改性，既能夠使水凝膠敷料上表面的孔有利于干細胞的粘附增殖，同時水凝膠下表面仍然保持其不利于細胞粘附的特性，敷料不會發生粘連，便于敷料的更換。
[0038]接種干細胞:改性后的水凝膠敷料經過消毒處理，將干細胞接種于水凝膠的改性面，干細胞的接種密度為14個/cm2，培養10天，干細胞接種后的水凝膠敷料的示意圖見圖2，干細胞分泌的生長因子等生物活性物質可以通過水凝膠的網絡結構與表皮細胞相接觸；同時設置對照組，對照組采用未改性的水凝膠敷料按上述相同的方法接種干細胞，并進行細胞培養。通過熒光染色觀察干細胞在不同的敷料表面的生長粘附情況(圖3)。
[0039]由圖3可知，水凝膠敷料經改性后，可促進干細胞的增殖。可見，水凝膠敷料的改性有利于細胞的粘附和增殖，干細胞分泌的生長因子等生物活性物質可以通過水凝膠的網絡結構釋放于傷口表面，促進傷口的修復。而干細胞集落的形成，由于細胞之間存在彼此的接觸性刺激，能夠更好地分泌各種細胞因子，提高皮膚修復的效率。
[0040]體外修復實驗:
[0041 ]該試驗為皮膚成纖維細胞的增殖試驗，具體試驗操作為:將皮膚成纖維細胞接種于培養板中，待細胞貼壁后，將實施例1獲得的培養有干細胞的水凝膠敷料置于貼壁細胞上表面，培養3天后，將水凝膠敷料取出。同時，設置對照組，對照組采用上述未改性的、經接種干細胞后的水凝膠敷料。向培養有成纖維細胞的孔內加入MTT，37 °C孵育4h，棄掉培養液，加入二甲基砜(DMSO)，490nm檢測吸光度值，分析不同敷料覆蓋下成纖維細胞增殖情況。結果見圖4。
[0042]由圖4可知，本發明實施例1的水凝膠敷料可顯著促進皮膚成纖維細胞的增殖。
[0043]實施例2
[0044]水凝膠敷料(聚乙烯醇)的結構為槽型水凝膠敷料，結構示意圖見圖5(俯視圖)。在水凝膠上表面制造微槽，槽的底部仍保留一層水凝膠，使其與創面隔絕。在敷料使用前，只需將干細胞接種于水凝膠的上表面，即可應用于創面修復。該槽型水凝膠敷料一方面有利于干細胞在槽內生存、生長和繁殖，形成細胞集落，保持細胞活性和生物活性物質的表達和釋放;另一方面，接種于槽內的干細胞通過水凝膠完全與皮膚隔離，避免了干細胞與人體直接接觸而帶來的安全性問題。
[0045]對水凝膠敷料進行表面改性:配置一定濃度(10mg/mL)的含有光活性基團(該光活性基團為四疊氮苯甲酸通過共價結合方式與明膠的氨基結合后獲得)的明膠。將所得光活性明膠溶液平鋪于水凝膠的表面，靜置24h。將水凝膠置于紫外交聯儀進行紫外交聯20s，獲得改性后的水凝膠敷料。本發明通過光活性明膠對水凝膠上表面進行光固化改性，既能夠使水凝膠敷料上表面的孔有利于干細胞的粘附增殖，同時水凝膠下表面仍然保持其不利于細胞粘附的特性，敷料不會發生粘連，便于敷料的更換。
[0046]接種干細胞:改性后的水凝膠敷料經過消毒處理，將干細胞接種于水凝膠的改性面，干細胞的接種密度為14個/cm2，培養14天，干細胞分泌的生長因子等生物活性物質可以通過水凝膠的網絡結構與表皮細胞相接觸；同時設置對照組，對照組采用未改性的水凝膠敷料按上述相同的方法接種干細胞，并進行細胞培養。通過熒光染色觀察干細胞在不同的敷料表面的生長粘附情況(與圖3相近)。
[0047]由實驗結果可知，水凝膠敷料經改性后，可促進干細胞的增殖。可見，水凝膠敷料的改性有利于細胞的粘附和增殖，干細胞分泌的生長因子等生物活性物質可以通過水凝膠的網絡結構釋放于傷口表面，促進傷口的修復。而干細胞集落的形成，由于細胞之間存在彼此的接觸性刺激，能夠更好地分泌各種細胞因子，提高皮膚修復的效率。
[0048]體外修復實驗:
[0049]該試驗為皮膚成纖維細胞的增殖試驗，具體試驗操作為:將皮膚成纖維細胞接種于培養板中，待細胞貼壁后，將實施例2獲得的培養有干細胞的水凝膠敷料置于貼壁細胞上表面，培養3天后，將水凝膠敷料取出。同時，設置對照組，對照組采用上述未改性的、經接種干細胞后的水凝膠敷料。向培養有成纖維細胞的孔內加入MTT，37 °C孵育4h，棄掉培養液，加入二甲基砜(DMSO)，490nm檢測吸光度值，分析不同敷料覆蓋下成纖維細胞增殖情況。結果與圖4相近。
[0050]由上述試驗結果可知，本發明實施例2的水凝膠敷料可顯著促進皮膚成纖維細胞的增殖。
[0051]以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
【主權項】
1.一種用于干細胞治療的水凝膠敷料，其特征在于，所述水凝膠敷料包括水凝膠層和水凝膠改性層，所述水凝膠改性層所用材料為含有光活性基團的明膠。2.根據權利要求1所述的水凝膠敷料，其特征在于，所述含有光活性基團的明膠為經4-疊氮苯甲酸修飾的明膠。3.根據權利要求1所述的水凝膠敷料，其特征在于，所述水凝膠敷料的制備方法為:通過紫外交聯技術將所述水凝膠改性層固定于水凝膠層上。4.根據權利要求3所述的水凝膠敷料，其特征在于，所述紫外交聯的時間為10?60s。5.根據權利要求1所述的水凝膠敷料，其特征在于，所述水凝膠層所用材料為水凝膠，所述水凝膠為聚乙烯醇和/或殼聚糖。6.根據權利要求5所述的水凝膠敷料，其特征在于，所述含有光活性基團的明膠的濃度為0.01?10mg/mL。7.根據權利要求1所述的水凝膠敷料，其特征在于，所述水凝膠層上與水凝膠改性層相接觸的表面設置有凹陷結構。8.根據權利要求7所述的水凝膠敷料，其特征在于，所述凹陷結構為孔和/或槽。9.根據權利要求1所述的水凝膠敷料，其特征在于，還包括干細胞，所述干細胞接種于所述水凝膠改性層上。10.根據權利要求9所述的水凝膠敷料，其特征在于，所述干細胞的培養時間為I?14天。
【專利摘要】本發明提供了一種用于干細胞治療的水凝膠敷料。本發明提供的水凝膠敷料包括水凝膠層和水凝膠改性層，水凝膠改性層所用材料為含有光活性基團的明膠。本發明水凝膠敷料有利于干細胞的粘附和增殖，通過該結構干細胞能將促進創面生長修復的活性因子釋放到創面，同時避免了干細胞與創面的直接接觸，實現干細胞的安全應用。
【IPC分類】A61L26/00
【公開號】CN105709270
【申請號】CN201610156699
【發明人】章培標, 高田林, 崔巍巍, 王宗良, 王宇, 李林龍
【申請人】中國科學院長春應用化學研究所