一種脫細胞角膜組織及其制備方法和應用的制作方法

一種脫細胞角膜組織及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及角膜基質替代物領域，公開了一種脫細胞角膜組織及其制備方法，該方法包括：將在無菌條件下切取的新鮮動物眼球的角膜基質片依次進行低滲溶脹、反復凍融、酶消化、超聲、滅菌和濕態封存處理，所述酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的緩沖液進行處理。本發明還提供了所述脫細胞角膜組織在作為角膜基質替代物中的應用。本發明的方法最大程度地減少了對角膜基質膠原結構的破壞，膠原纖維排列整齊，孔隙均勻規則，無細胞殘留，板層結構保留完整，提高了支架材料的生物相容性，并且在角膜基質不變性的前提下使得脫細胞角膜組織能夠長期濕態保存。
【專利說明】一種脫細胞角膜組織及其制備方法和應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及角膜基質替代物領域，具體地，涉及一種脫細胞角膜組織及其制備方 法和應用。

【背景技術】
[0002] 角膜位于眼球最表面，直接與外界接觸，容易受到損傷（物理、化學）和感染，一旦 發生病變則會發生混濁而影響視力，甚至致盲。常見的角膜病變有角膜炎、角膜潰瘍、圓錐 角膜、角膜軟化癥和角膜變性等。據世界衛生組織（WHO)統計，目前全世界有角膜病盲患者 近5000萬人，我國有約400萬人。角膜病嚴重影響了患者們的正常生活、工作與學習，生活 上需要家人和社會的照顧，增加了家庭的經濟負擔，也加重了全社會的負擔。角膜移植是角 膜病盲患者恢復視力和復明的唯一希望，但由于我國角膜捐獻數量極其有限，全國每年能 進行的角膜移植手術目前僅有3000余例，致使絕大多數患者因得不到可用的供體角膜而 無法重見光明。
[0003] 目前，國內外同類產品主要以羊膜、膠原及其他合成高分子材料用于角膜移植研 宄，但都存在不同的缺陷。羊膜相對較薄，僅適用于治療眼表淺度損傷。合成材料的透明性 和穩定性較差，在降解過程中降解產物可引起局部PH值下降，術區出現非特異性無菌性炎 癥反應率較高。膠原是組織工程常用的材料，但純膠原韌性差，易碎，降解過快，手術后一段 時間內就發生碎裂，無法達到復明的效果，因此目前仍停留在基礎研宄階段。相比而言，異 種角膜基質材料來源豐富，具有與正常角膜基質相似的組織結構，移植之后角膜基質的厚 度、屈光度不變。天然的角膜基質層存在著某些生長因子，可促進細胞的生長、繁殖和分化， 而且免疫原性低，神經可以長入，有利于角膜知覺的恢復。此外，由于異種移植供體來源的 動物，如豬，在生理上與人類具有高度相似性，故其組織或器官被認為是理想的供體之一， 以豬作為異種移植供體來源的研宄比較深入，豬的組織器官（如心臟瓣膜、胰島細胞、凝血 因子等）已用于人類疾病的治療，異體脫細胞真皮基質已被批準用于臨床。豬角膜基質含 有角膜細胞生長所必需的多種細胞外基質成分，具有良好的生物相容性，能夠成為有效的 角膜基質替代物。
[0004] 異種移植供體來源的動物（如豬）的角膜基質組織中含有自身固有的細胞，需經 過脫細胞處理才能獲得無免疫原性或免疫原性較低的角膜基質替代物。現有的角膜基質 替代物主要通過將動物源性角膜基質片依次進行低滲溶脹、反復凍融、酶消化、干燥和滅菌 處理獲得，且酶消化一般采用含有胰酶的緩沖液進行處理。這樣的方法對制備得到的角膜 基質替代物的膠原板層結構破壞較大，使得膠原纖維排列較凌亂，孔隙不均勻，且透光率較 低，并不能完全滿足臨床移植的要求，而且無法長期濕態保存。
[0005] 因此，研發一種能夠完全脫除異種移植供體來源的動物（如豬）角膜基質中的細 胞成分，對膠原板層結構破壞極小，使所得角膜基質的板層結構保留完整且膠原纖維排列 整齊、孔隙均勻規則、透光率較高且在角膜基質不變性的前提下能夠長期濕態保存的角膜 基質替代物的制備方法，具有重要的現實意義和廣闊的應用前景。


【發明內容】

[0006] 本發明的目的是為了克服現有方法對制備得到的角膜基質替代物的膠原板層結 構破壞較大，使得膠原纖維排列較凌亂，孔隙不均勻，透光率較低，并不能完全滿足臨床移 植要求且無法長期濕態保存的缺陷，提供一種膠原纖維排列整齊、孔隙均勻規則、板層結構 保留完整、透光率較高且在角膜基質不變性的前提下能夠長期濕態保存的脫細胞角膜組織 及其制備方法和應用。
[0007] 因此，為了實現上述目的，第一方面，本發明提供了一種脫細胞角膜組織的制備方 法，所述方法包括：將在無菌條件下切取的新鮮動物眼球的角膜基質片依次進行低滲溶脹、 反復凍融、酶消化、超聲、滅菌和濕態封存處理，所述酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的緩沖 液進行處理。
[0008] 第二方面，本發明提供了所述方法制備得到的脫細胞角膜組織。
[0009] 第三方面，本發明還提供了所述脫細胞角膜組織在作為角膜基質替代物中的應 用。
[0010] 本發明的脫細胞角膜組織，來源豐富，生物相容性及生物安全性好，膠原纖維排列 整齊，孔隙均勻規則，無細胞殘留，角膜基質的板層結構保留完整，且在角膜基質不變性的 前提下能夠長期濕態保存；理化性能良好，角膜透光率為70% -80% ;機械強度高，能夠耐 受手術縫線牽拉、韌性良好并能長期應用于臨床，主要用于治療角膜外傷、角膜潰瘍、混濁、 疤痕、化學或熱燒傷等致盲性眼病，將病變處被損壞的角膜切除并將同樣尺寸的板層角膜 基質支架植入患者眼中，能夠達到構建健康角膜組織、改善患者視力的效果。
[0011] 本發明的方法具有以下特點：
[0012] 1)本發明方法的工藝流程簡單可靠，周期短。
[0013] 2)本發明方法采用的原料來源廣泛，成本低，使用方便。
[0014] 3)本發明的方法，最大程度地減少了對角膜基質膠原結構的破壞，膠原纖維排列 整齊，無細胞殘留，前彈力層及基底膜都保留，便于上皮層的生長，提高了脫細胞角膜組織 的生物相容性。
[0015] 4)本發明方法制備得到的脫細胞角膜組織，在使用前用生理鹽水或PBS緩沖液清 洗后即可使用而無需進行復水處理，使用方便，且在角膜基質不變性的前提下能夠長期濕 態保存，可長達6個月。
[0016] 5)本發明方法制備得到的脫細胞角膜組織，通過自檢、型式檢驗驗證了該產品的 安全性，結果顯示其機械性能、理化性能及生物學性能都滿足臨床移植的要求。
[0017] 6)本發明方法制備得到的脫細胞角膜組織，適合用于基質層異常角膜的臨床移 植，使眾多角膜基質異常患者重見光明成為可能，為組織工程角膜產業提供了重要的技術 支持。
[0018] 本發明的其它特征和優點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1是本發明實施例1制備得到的脫細胞角膜組織的冰凍切片圖。
[0020] 圖2是正常人角膜板層結構的冰凍切片圖。
[0021] 圖3是本發明實施例5制備得到的脫細胞角膜組織的冰凍切片圖。
[0022] 圖4是本發明實施例6制備得到的脫細胞角膜組織的冰凍切片圖。
[0023] 圖5是本發明對比例1制備得到的脫細胞角膜組織的冰凍切片圖。
[0024] 圖6是本發明對比例2制備得到的脫細胞角膜組織的冰凍切片圖。

【具體實施方式】
[0025] 以下對本發明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體 實施方式僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。
[0026] 第一方面，本發明提供了一種脫細胞角膜組織的制備方法，所述方法包括：將在無 菌條件下切取的新鮮動物眼球的角膜基質片依次進行低滲溶脹、反復凍融、酶消化、超聲、 滅菌和濕態封存處理，所述酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的緩沖液進行處理。
[0027] 根據本發明的方法，本領域技術人員可以理解的是，在無菌條件下切取角膜基質 片前，一般先將新鮮動物眼球用酒精或含妥布霉素的PBS溶液浸泡。PBS緩沖液可以為 IXPBS緩沖液。
[0028] 對于酒精和妥布霉素的濃度以及浸泡時間沒有特別的要求，可以為本領域常用的 濃度和浸泡時間。優選情況下，酒精的體積百分濃度為70-80%，進一步優選為75% ;妥布 霉素的濃度為30000-50000U/L，進一步優選為40000U/L ;浸泡時間為10-30s。
[0029] 對于切取的角膜基質片的直徑和厚度沒有特別的要求，可以為本領域常規的 角膜基質片的直徑和厚度。優選情況下，切取的角膜基質片的直徑為8-10mm，厚度為 200-600 μ m〇
[0030] 為了提高制得的脫細胞角膜組織和人角膜基質細胞的生物相容性，優選情況下， 動物為豬、牛或猴，進一步優選為豬。
[0031] 根據本發明的方法，低滲溶脹處理的方法可以包括：將切取的角膜基質片放在低 滲液中浸泡至溶脹。對于低滲液沒有特別的要求，可以為本領域常用的各種低滲液，為了能 夠更好地脹破細胞膜和核膜，優選情況下，低滲液為三蒸水。為了使角膜基質片在低滲液中 溶脹至合適的程度，優選情況下，浸泡的時間為8-12h。
[0032] 根據本發明的方法，為了最大程度地減少對角膜基質膠原結構的破壞，更好地驟 縮驟脹細胞膜和核膜，進而使細胞膜和核膜破損，優選情況下，反復凍融的條件包括：冷凍 時間為30-60min，冷凍溫度為-200?-50°C，融化時間為15-30min，融化溫度為30-40°C， 循環次數為2-5次。
[0033] 根據本發明的方法，為了更充分地破壞核酸，完全脫除細胞，完整保留板層結構， 且使得膠原纖維排列整齊，孔隙均勻規則，使制得的脫細胞角膜組織與人角膜基質細胞具 有更好的生物相容性，優選情況下，酶消化處理的條件包括：DNA酶與緩沖液的體積比為 1:500-1500, RNA酶與緩沖液的體積比為1:1500-2500,溫度為30-40°C，時間為2-4h。對于 緩沖液的種類沒有特別的要求，可以為本領域常用的用于DNA酶和RNA酶的緩沖液，例如可 以為Tris-Hcl緩沖液、Hanks緩沖液或I XPBS緩沖液。
[0034] 根據本發明的方法，為了使膠原纖維束更好地形成網絡結構，使膠原纖維排列 整齊，孔隙均勻規則，優選情況下，超聲處理的條件包括：溫度為20-40°C，超聲功率為 200-500W，超聲時間為2-5h。超聲采用的超聲儀可以為本領域常用的各種超聲儀，只要能夠 控制超聲儀的參數，使得溫度為20-40°C，超聲功率為200-500W，超聲時間為2-5h即可。
[0035] 根據本發明的方法，本領域技術人員應該理解的是，該方法還可以包括：在酶消化 處理之后超聲處理之前、超聲處理之后滅菌處理之前將角膜基質片進行清洗。對于清洗的 條件沒有特別的要求，可以為本領域常規的清洗條件。優選情況下，在搖床上用無菌三蒸水 清洗3-5次，搖床的轉速為100-200rpm，每次清洗的時間為5-15min。
[0036] 根據本發明的方法，對于滅菌的條件沒有特別的要求，可以為本領域常用的各種 滅菌條件。為了更好地去除制得的脫細胞角膜組織的抗原性，優選情況下，滅菌的條件包 括：采用鈷-60或電子束輻照滅菌，輻照劑量為20-30kGy。
[0037] 根據本發明的方法，優選情況下，濕態封存處理的方式包括將經過滅菌處理得到 的產物置于保存液中封存。其中，本發明的發明人在研宄中意外發現，當保存液為含有I型 膠原蛋白和硫酸軟骨素的保存液時，能夠使得角膜基質在不變性的前提下長期濕態保存， 可長達6個月，因此，進一步優選地，保存液為含有I型膠原蛋白和硫酸軟骨素的保存液。 本發明的發明人在研宄中進一步發現，保存液的成分對濕態保存的角膜基質的結構和成分 有重要影響，為了更好的預防脫細胞角膜組織在保存的過程中發生降解或成分轉變等問 題，更好的確保角膜組織長時間不變性，更優選地，保存液的成分包括：1_5重量％的右旋 糖酐，0. 1-2重量％的I型膠原蛋白，0.05-1重量％的硫酸軟骨素，0.005-0. 02重量％的抗 氧化劑，0. 005-0. 02重量％的抗生素，其余成分為三蒸水；更進一步優選地，保存液中I型 膠原蛋白的含量為0. 5-1. 5重量％，硫酸軟骨素的含量為0. 4-0. 8重量％。
[0038] 根據本發明的方法，為了進一步提高角膜組織在保存液中的保存效果，優選情況 下，右旋糖酐的分子量為20-40kDa ; I型膠原蛋白的來源為豬、牛、魚或人；抗氧化劑包括 維生素 C和/或維生素 E ;抗生素包括妥布霉素、青霉素、鏈霉素和慶大霉素中的至少一種。
[0039] 根據本發明的方法，為了進一步提高角膜組織在保存液中的保存效果，優選情況 下，置于保存液中封存的溫度為4-8 °C。
[0040] 本發明還提供了上述方法制備得到的脫細胞角膜組織。
[0041] 本發明的脫細胞角膜組織為動物源性脫細胞板層角膜基質片，不含細胞成分，膠 原纖維排列整齊，孔隙均勻規則，透光率為70% -80%。
[0042] 根據本發明的方法可知，本發明的脫細胞角膜組織以濕態封存形式存在，在使用 前用生理鹽水或PBS緩沖液清洗后即可使用而無需進行復水處理，使用方便，且能夠在角 膜基質不變性的前提下實現長期濕態保存，可長達6個月。
[0043] 本發明還提供了脫細胞角膜組織在作為角膜基質替代物中的應用。
[0044] 本發明的脫細胞角膜組織可用于治療角膜外傷、角膜潰瘍、混濁、疤痕、化學或熱 燒傷等角膜病變。
[0045] 實施例
[0046] 以下的實施例將對本發明作進一步的說明，但并不因此限制本發明。如無特別說 明，使用的各試劑和材料均可市售獲得。
[0047] 以下實施例和對比例中，測定透光率的方法包括：對于滅菌后直接檢測的材料，需 先用生理鹽水充分浸泡，然后平整緊密地貼在比色皿內壁，加生理鹽水，以不貼角膜基質材 料的比色皿加生理鹽水作為對照；對于用保存液保存一定時間后的材料，先用生理鹽水沖 洗保存液，再采用同上的方法進行操作。采用紫外-可見光分光光度計（型號：UV-5300型， 上海元析儀器有限公司）測定角膜基質材料在不同波長下（400nm、500nm、600nm、700nm、 800nm)的透光率，然后計算平均值。
[0048] 冰凍切片的方法為：將用生理鹽水復水的脫細胞角膜組織浸潤在OCT包埋劑中， 在-80°C的環境中速凍30min，然后固定在樣品托上，修片，用冰凍切片機（型號：Thermo Cryotome FE型，美國賽默飛世爾科技公司）切片（厚度為IOym)，烤片2h，采用H. E染色 法進行染色后，用光學顯微鏡（型號：CKX-41SF，日本奧林巴斯公司）進行觀察。
[0049] 右旋糖酐，分子量為22kDa，購自Sigma公司。
[0050] I型膠原蛋白購自Sigma公司。
[0051] 實施例1
[0052] 本實施例用于說明本發明的脫細胞角膜組織及其制備方法。
[0053] (1)取豬眼球，并將新鮮的豬眼球用體積百分濃度為75%的酒精浸泡20s，在超凈 臺內，用角膜刀直接切取直徑為9_，厚度為400 μ m的角膜基質片；
[0054] (2)將切取的角膜基質片放在三蒸水中浸泡IOh ;
[0055] (3)將步驟（2)得到的低滲溶脹的角膜基質片放在無菌的凍存管內，反復凍融，冷 凍時間為40min，冷凍溫度為-80°C，融化時間為20min，融化溫度為37°C，循環次數為3次；
[0056] (4)將經反復凍融的角膜基質片放在含有DNA酶和RNA酶的Tris-Hcl緩沖液中進 行酶消化處理，DNA酶與Tris-Hcl緩沖液的體積比為1:1000, RNA酶與Tris-Hcl緩沖液的 體積比為1:2000，在37 °C的恒溫箱中處理3h ;
[0057] (5)將經過酶消化處理的角膜基質片在搖床上用無菌三蒸水清洗3次，搖床的轉 速為150rpm，每次清洗的時間為IOmin ;然后將角膜基質片置于超聲儀中，進行超聲處理， 超聲儀參數設定分別為：溫度為30°C，超聲功率為300W，超聲時間為3h ;
[0058] (6)將經超聲處理的角膜基質片在搖床上用無菌三蒸水清洗3次，搖床的轉速為 150rpm，每次清洗的時間為IOmin ;然后采用鈷-60輻照滅菌，輻照劑量為25kGy，保存備 用；
[0059] 將滅菌后的角膜基質片用生理鹽水復水24h后得到脫細胞角膜組織，測定其透光 率并對其結構進行觀察。其中，測得透光率為80%。生理鹽水復水后的脫細胞角膜組織（已 脫細胞，放大倍數為40倍）的冰凍切片圖見圖1，正常人角膜板層結構（未脫細胞，放大倍 數為40倍）的冰凍切片圖見圖2。將圖1和圖2比較可知，本實施例制得的脫細胞角膜組 織具有與人角膜基質細胞相同的結構，膠原纖維排列整齊，孔隙均勻規則，無細胞殘留，角 膜基質的板層結構保留完整。
[0060] 然后對生理鹽水復水后的脫細胞角膜組織進行生物學性能及生物安全性研宄和 機械性能及理化性能研宄，生物學性能及生物安全性研宄的檢測方法和結果見表1，機械性 能及理化性能研宄的檢測方法和結果見表2。表1和表2的結果表明，本實施例制得的脫細 胞角膜組織的生物相容性和生物安全性好；機械強度高，能夠耐受手術縫線牽拉、韌性良好 并能長期應用于臨床；理化性能良好；機械性能、理化性能及生物學性能都滿足臨床移植 的要求，能夠達到構建健康角膜組織、改善患者視力的效果。
[0061] (7)將滅菌后的角膜基質片置于保存液中并在6°C下密封保存，即得到可移植的 脫細胞角膜組織。其中，保存液的成分包括：3重量％的右旋糖酐，1重量％的I型膠原蛋 白，0. 6重量％的硫酸軟骨素，0. 01重量％的維生素 C，0. 01重量％的妥布霉素，其余成分為 三蒸水。
[0062] 經測定，密封保存6個月后，本實施例制得的脫細胞角膜組織的透光率為79%。
[0063] 密封保存6個月后的本實施例制得的脫細胞角膜組織的冰凍切片圖同圖1，S卩，密 封保存6個月后，本實施例制得的脫細胞角膜組織仍具有與人角膜基質細胞相同的結構， 膠原纖維排列整齊，孔隙均勻規則，無細胞殘留，角膜基質的板層結構保留完整，并未發生 降解及成分轉變（即未發生變性）。
[0064] 實施例2
[0065] 本實施例用于說明本發明的脫細胞角膜組織及其制備方法。
[0066] (1)取牛眼球，并將新鮮的牛眼球用含妥布霉素的I XPBS溶液（妥布霉素的濃度 為40000U/L)浸泡30s，在超凈臺內，用角膜刀直接切取直徑為8mm，厚度為200 μ m的角膜 基質片；
[0067] (2)將切取的角膜基質片放置于三蒸水中浸泡8h ;
[0068] (3)將步驟（2)得到的低滲溶脹的角膜基質片放在無菌的凍存管內，反復凍融，冷 凍時間為30min，冷凍溫度為-200°C，融化時間為30min，融化溫度為40°C，循環次數為2 次；
[0069] (4)將經反復凍融的角膜基質片放在含有DNA酶和RNA酶的I XPBS緩沖液中進行 酶消化處理，DNA酶與I X PBS緩沖液的體積比為1:1500, RNA酶與I X PBS緩沖液的體積比 為1:2500，在30°〇的恒溫箱中處理411;
[0070] (5)將經過酶消化處理的角膜基質片在搖床上用無菌三蒸水清洗4次，搖床的轉 速為IOOrpm，每次清洗的時間為15min ;然后將角膜基質片置于超聲儀中，進行超聲處理， 超聲儀參數設定分別為：溫度為20°C，超聲功率為500W，超聲時間為2h ;
[0071] (6)將經超聲處理的角膜基質片在搖床上用無菌三蒸水清洗4次，搖床的轉速為 lOOrpm，每次清洗的時間為15min ;然后采用鈷-60輻照滅菌，輻照劑量為20kGy，保存備 用；
[0072] 將滅菌后的角膜基質片用生理鹽水復水24h后得到脫細胞角膜組織，測定其透光 率并對其結構進行觀察。其中，測得透光率為78 %。生理鹽水復水后的脫細胞角膜組織的冰 凍切片圖同圖1，即，本實施例制得的脫細胞角膜組織具有與人角膜基質細胞相同的結構， 膠原纖維排列整齊，孔隙均勻規則，無細胞殘留，角膜基質的板層結構保留完整。
[0073] 然后對生理鹽水復水后的脫細胞角膜組織進行生物學性能及生物安全性研宄和 機械性能及理化性能研宄，生物學性能及生物安全性研宄的檢測方法和結果見表1，機械性 能及理化性能研宄的檢測方法和結果見表2。表1和表2的結果表明，本實施例制得的脫細 胞角膜組織的生物相容性和生物安全性好；機械強度高，能夠耐受手術縫線牽拉、韌性良好 并能長期應用于臨床；理化性能良好；機械性能、理化性能及生物學性能都滿足臨床移植 的要求，能夠達到構建健康角膜組織、改善患者視力的效果。
[0074] (7)將滅菌后的角膜基質片置于保存液中并在4°C下密封保存，即得到可移植的 脫細胞角膜組織。其中，保存液的成分包括重量％的右旋糖酐，〇. 5重量％的I型膠原蛋 白，0. 8重量％的硫酸軟骨素，0. 02重量％的維生素 E，0. 005重量％的青霉素，其余成分為 三蒸水。
[0075] 經測定，密封保存6個月后，本實施例制得的脫細胞角膜組織的透光率為78%。
[0076] 密封保存6個月后的本實施例制得的脫細胞角膜組織的冰凍切片圖同圖1，S卩，密 封保存6個月后，本實施例制得的脫細胞角膜組織仍具有與人角膜基質細胞相同的結構， 膠原纖維排列整齊，孔隙均勻規則，無細胞殘留，角膜基質的板層結構保留完整，并未發生 降解及成分轉變（即未發生變性）。
[0077] 實施例3
[0078] 本實施例用于說明本發明的脫細胞角膜組織及其制備方法。
[0079] (1)取猴眼球，并將新鮮的猴眼球用體積百分濃度為80%的酒精浸泡10s，在超凈 臺內，用角膜刀直接切取直徑為1〇_，厚度為600 ym的角膜基質片；
[0080] (2)將切取的角膜基質片放置于三蒸水中浸泡12h ;
[0081] (3)將步驟（2)得到的低滲溶脹的角膜基質片放在無菌的凍存管內，反復凍融，冷 凍時間為60min，冷凍溫度為-50°C，融化時間為15min，融化溫度為30°C，循環次數為5次；
[0082] (4)將經反復凍融的角膜基質片放在含有DNA酶和RNA酶的Hanks緩沖液中進行 酶消化處理，DNA酶與Hanks緩沖液的體積比為1:500, RNA酶與Hanks緩沖液的體積比為 1:1500,在40 °C的恒溫箱中處理2h ;
[0083] (5)將經過酶消化處理的角膜基質片在搖床上用無菌三蒸水清洗5次，搖床的轉 速為200rpm，每次清洗的時間為5min ;然后將角膜基質片置于超聲儀中，進行超聲處理，超 聲儀參數設定分別為：溫度為40°C，超聲功率為200W，超聲時間為5h ;
[0084] (6)將經超聲處理的角膜基質片在搖床上用無菌三蒸水清洗5次，搖床的轉速為 200rpm，每次清洗的時間為5min ;然后采用電子束輻照滅菌，輻照劑量為30kGy，保存備用；
[0085] 將滅菌后的角膜基質片用生理鹽水復水24h后得到脫細胞角膜組織，測定其透光 率并對其結構進行觀察。其中，測得透光率為76 %。生理鹽水復水后的脫細胞角膜組織的冰 凍切片圖同圖1，即，本實施例制得的脫細胞角膜組織具有與人角膜基質細胞相同的結構， 膠原纖維排列整齊，孔隙均勻規則，無細胞殘留，角膜基質的板層結構保留完整。
[0086] 然后對生理鹽水復水后的脫細胞角膜組織進行生物學性能及生物安全性研宄和 機械性能及理化性能研宄，生物學性能及生物安全性研宄的檢測方法和結果見表1，機械性 能及理化性能研宄的檢測方法和結果見表2。表1和表2的結果表明，本實施例制得的脫細 胞角膜組織的生物相容性和生物安全性好；機械強度高，能夠耐受手術縫線牽拉、韌性良好 并能長期應用于臨床；理化性能良好；機械性能、理化性能及生物學性能都滿足臨床移植 的要求，能夠達到構建健康角膜組織、改善患者視力的效果。
[0087] (7)將滅菌后的角膜基質片置于保存液中并在8°C下密封保存，即得到可移植的 脫細胞角膜組織。其中，保存液的成分包括：5重量％的右旋糖酐，1. 5重量％的I型膠原蛋 白，〇. 4重量％的硫酸軟骨素，0. 005重量％的維生素 E，0. 02重量％的鏈霉素，其余成分為 三蒸水。
[0088] 經測定，密封保存6個月后，本實施例制得的脫細胞角膜組織的透光率為75%。
[0089] 密封保存6個月后的本實施例制得的脫細胞角膜組織的冰凍切片圖同圖1，S卩，密 封保存6個月后，本實施例制得的脫細胞角膜組織仍具有與人角膜基質細胞相同的結構， 膠原纖維排列整齊，孔隙均勻規則，無細胞殘留，角膜基質的板層結構保留完整，并未發生 降解及成分轉變（即未發生變性）。
[0090] 實施例4
[0091] 本實施例用于說明本發明的脫細胞角膜組織及其制備方法。
[0092] 按照實施例1的方法，不同的是，步驟（7)中，保存液中I型膠原蛋白的含量為0. 1 重量％，硫酸軟骨素的含量為1重量％。
[0093] 經測定，密封保存6個月后，本實施例制得的脫細胞角膜組織的透光率為71%。
[0094] 密封保存6個月后的本實施例制得的脫細胞角膜組織的冰凍切片圖同圖1，S卩，密 封保存6個月后，本實施例制得的脫細胞角膜組織仍具有與人角膜基質細胞相同的結構， 膠原纖維排列整齊，孔隙均勻規則，無細胞殘留，角膜基質的板層結構保留完整，并未發生 降解及成分轉變（即未發生變性）。
[0095] 實施例5
[0096] 本實施例用于說明本發明的脫細胞角膜組織及其制備方法。
[0097] 按照實施例1的方法，不同的是，步驟（7)中，用生理鹽水代替保存液進行密封保 存。
[0098] 經測定，密封保存6個月后，本實施例制得的脫細胞角膜組織的透光率為22%。
[0099] 密封保存6個月后的本實施例制得的脫細胞角膜組織（已脫細胞，放大倍數為40 倍）的冰凍切片圖見圖3,將圖1和圖3比較可知，密封保存6個月后，本實施例制得的脫細 胞角膜組織，膠原纖維束發生一定程度的降解或斷裂，且殘留的膠原纖維排列紊亂，孔隙不 均勻。
[0100] 實施例6
[0101] 本實施例用于說明本發明的脫細胞角膜組織及其制備方法。
[0102] 按照實施例1的方法，不同的是，步驟（7)中，保存液中不包括I型膠原蛋白。
[0103] 經測定，密封保存6個月后，本實施例制得的脫細胞角膜組織的透光率為30%。 [0104] 密封保存6個月后的本實施例制得的脫細胞角膜組織（已脫細胞，放大倍數為40 倍）的冰凍切片圖見圖4,將圖1和圖4比較可知，密封保存6個月后，本實施例制得的脫細 胞角膜組織，膠原纖維束存在一定程度的降解，且殘留的膠原纖維排列凌亂、粗細不均，孔 徑分布大小不均勻。
[0105] 將實施例1與實施例4比較可知，當保存液中I型膠原蛋白的含量為0. 5-1. 5重 量％，硫酸軟骨素的含量為〇. 4-0. 8重量％時，密封保存6個月后，能夠進一步提高制得的 脫細胞角膜組織的透光率。
[0106] 將實施例1與實施例5-6比較可知，將滅菌后的角膜基質片置于本發明的特定的 保存液（保存液的成分包括：1_5重量％的右旋糖酐，0. 1-2重量％的I型膠原蛋白，0. 05-1 重量％的硫酸軟骨素，0. 005-0. 02重量％的抗氧化劑，0. 005-0. 02重量％的抗生素，其余 成分為三蒸水）中密封保存6個月，角膜基質的板層結構不會發生降解，且膠原纖維排列整 齊，孔隙均勻規則，透光率高。
[0107] 表 1
[0108]

【權利要求】
1. 一種脫細胞角膜組織的制備方法，其特征在于，所述方法包括：將在無菌條件下切 取的新鮮動物眼球的角膜基質片依次進行低滲溶脹、反復凍融、酶消化、超聲、滅菌和濕態 封存處理，所述酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的緩沖液進行處理。
2. 根據權利要求1所述的方法，其中，所述酶消化處理的條件包括：DNA酶與緩沖液的 體積比為1:500-1500,RNA酶與緩沖液的體積比為1:1500-2500,溫度為30-40°C，時間為 2-4h〇
3. 根據權利要求1所述的方法，其中，所述超聲處理的條件包括：溫度為20-40°C，超聲 功率為200-500W，超聲時間為2-5h。
4.根據權利要求1所述的方法，其中，所述濕態封存處理的方式包括將經過滅菌處理 得到的產物置于保存液中封存，所述保存液為含有I型膠原蛋白和硫酸軟骨素的保存液； 優選地，所述保存液的成分包括：1_5重量％的右旋糖酐，0. 1-2重量％的I型膠原蛋白， 〇.05-1重量％的硫酸軟骨素，0. 005-0. 02重量％的抗氧化劑，0. 005-0. 02重量％的抗生 素，其余成分為三蒸水；進一步優選地，保存液中I型膠原蛋白的含量為〇.5-1. 5重量％， 硫酸軟骨素的含量為〇.4-0. 8重量％。
5. 根據權利要求4所述的方法，其中，所述右旋糖酐的分子量為20-40kDa;所述I型膠 原蛋白的來源為豬、牛、魚或人；所述抗氧化劑包括維生素C和/或維生素E;所述抗生素包 括妥布霉素、青霉素、鏈霉素和慶大霉素中的至少一種。
6. 根據權利要求4所述的方法，其中，所述置于保存液中封存的溫度為4-8°C。
7. 根據權利要求1-6中任意一項所述的方法，其中，所述在無菌條件下切取新鮮動物 眼球的角膜基質片的方法包括：先將新鮮動物眼球用酒精或含妥布霉素的PBS溶液浸泡， 再在無菌條件下切取角膜基質片；所述酒精的體積百分濃度優選為70-80%，所述妥布霉 素的濃度優選為30000-50000U/L，所述浸泡時間優選為10-30s;所述切取的角膜基質片的 直徑優選為8-10mm，厚度優選為200-600ym;所述動物優選為豬、牛或猴，進一步優選為 豬。
8. 根據權利要求1-6中任意一項所述的方法，其中，所述低滲溶脹處理的方法包括： 將切取的角膜基質片放在低滲液中浸泡至溶脹，所述低滲液為三蒸水，所述浸泡的時間為 8-12h〇
9. 根據權利要求1-6中任意一項所述的方法，其中，所述反復凍融的條件包括：冷凍時 間為30-60min，冷凍溫度為-200?-50°C，融化時間為15-30min，融化溫度為30-40°C，循 環次數為2-5次。
10. 根據權利要求1-6中任意一項所述的方法，其中，所述滅菌的條件包括：采用鈷-60 或電子束輻照滅菌，輻照劑量為20-30kGy。
11. 權利要求1-10中任意一項所述的方法制備得到的脫細胞角膜組織。
12. 權利要求11所述的脫細胞角膜組織在作為角膜基質替代物中的應用。
【文檔編號】A61L27/38GK104511053SQ201510099226
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2015年3月6日 優先權日:2015年3月6日
【發明者】王寶泉, 李青 申請人:青島中皓生物工程有限公司