rhEGF在制備預防、治療缺血性腦卒中的藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了rhEGF的一種新的醫藥用途，具體而言，是將rhEGF用于制備預防治療缺血性腦卒中的藥物或保健品中的新用途。rhEGF藥物能保護和改善缺血性腦卒中，可以促進神經再生，對缺血性腦卒中大鼠有治療作用，為臨床上治療缺血性腦卒中提供了新的思路和方法。
【專利說明】rhEGF在制備預防、治療缺血性腦卒中的藥物中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及rhEGF的新用途，尤其涉及rhEGF在制備預防、治療缺血性腦卒中的藥 物中的應用。
【背景技術】
[0002] 腦血管疾病是當今世界嚴重危害人類生命健康的主要疾病之一，是我國的常見 病、多發病。腦卒中是多種腦血管疾病的嚴重表現形式，是一組突然起病、以局灶性神經功 能缺失為特征的腦血液循環障礙性疾病，其病因主要是各種因素引起腦內動脈狹窄、閉塞 或破裂，從而導致急性腦血液循環障礙，臨床上表現為一過性或永久性神經功能障礙的癥 狀和體征，具有極高的致殘率和較高的致死率，它不僅嚴重威脅病人的生命，影響其生活質 量，還給家庭和社會帶來沉重的負擔。目前腦血管疾病的致死率仍然很高，有大約75% 的卒中患者會留下神經功能或認知功能異常的后遺癥。在歐美國家，腦卒中是繼腫瘤、心 臟疾病之后的的第三大死亡原因，目前臨床除了早期溶栓措施，急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke，AIS)的臨床治療依然缺乏有效手段，而溶栓治療的時間窗極短且不能打 斷AIS所致的繼發性損害及其引起的惡性循環。應用實驗動物制備中樞神經系統損傷模 型的研究發現，由缺血誘導的一系列瀑布樣延遲性生化反應是導致腦卒中組織損傷及長期 行為學障礙的關鍵原因，其病理機制包括興奮性毒性、離子失衡、氧化應激、炎癥反應和再 生障礙等，深入研究腦卒中神經損傷及神經保護機制，開拓有效治療腦卒中的藥物已成為 不容忽視的社會性問題，故研發理想的缺血性腦卒中神經保護劑和治療策略顯得十分緊迫 和必要。
[0003] 基因重組人表皮生長因子（recombinant human Epidermal Growth Factor, rhEGF)在醫學上有顯著的創傷修復、愈合傷口等功效。近年來發現，rhEGF在美容 產品領域也有廣闊的應用前景，具有促進皮膚細胞更新、防止皮膚衰老等功能。本發明研 究發現，rhEGF對缺血性腦卒中大鼠有治療作用，從而為缺血性腦卒的治療提供了新思路， 其作用機理有待于進一步研究。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供rhEGF的一種新的醫藥用途，具體而言，是將rhEGF用于制 備預防治療腦血管疾病的藥物或保健品中的新用途，更進一步的，所述腦血管疾病為缺血 性腦卒中。
[0005] 本發明還提供rhEGF作為BDNF表達調節劑的用途，可使內源性BDNF表達增加。
[0006] 本發明的目的還在用提供一種用于治療缺血性腦卒的藥物組合物，其中包括活性 成分rhEGF和藥學可接受載體。
[0007] 本發明的藥物組合物，其中，所述藥學上可接受的載體包括但不限于：甘露醇、山 梨醇、山梨酸或鉀鹽、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、鹽酸半胱氨酸、巰基乙酸、蛋氨 酸、維生素 A、維生素 C、維生素 E、維生素 D、氮酮、EDTA二鈉、EDTA鈣鈉，一價堿金屬的碳 酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽或其水溶液、鹽酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化鈉、氯化鉀、乳酸 鈉、木糖醇、麥芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生 物、纖維素及其衍生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、丙二醇、乙醇、土溫60-80、司 班-80、蜂蠟、羊毛脂、液體石蠟、十六醇、沒食子酸酯類、瓊脂、三乙醇胺、堿性氨基酸、尿 素、尿囊素、碳酸鈣、碳酸氫鈣、表面活性劑、聚乙二醇、環糊精、β-環糊精、磷脂類材料、高 嶺土、滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂，植物油：大豆油、中鏈油、橄欖油、茶油、棕櫚油、當歸 油、沙棘油、莪術油、川芎油、薏米仁油、紅花油、花椒油、大蒜油；磷脂：蛋黃卵磷脂、大豆磷 月旨、氫化蛋黃卵磷脂、氫化大豆磷脂、人工合成磷脂；聚乙二醇磷脂或其衍生物，選自：聚 乙二醇-腦磷脂或其衍生物、聚乙二醇-膽固醇或其衍生物、聚乙二醇-二-脂肪酸甘油 酯或其衍生物、聚乙二醇-脂肪酸酯或其衍生物、聚乙二醇-脂肪胺或其衍生物、聚乙二 醇-脂肪醇或其衍生物、以及含有脂溶性高分子片段的聚乙二醇磷脂衍生物；油酸或油酸 鹽，選自：油酸、油酸鉀鹽、油酸鈉鹽；抗氧化劑：維生素 E ;亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、維生素 C ;控制陽離子濃度的絡合劑，選自：EDTA或其它離子絡合劑。
[0008] 本發明所述的藥物組合物，可以以藥物制劑的形式存在，可以是任何一種可服用 的藥物制劑形式，如：片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊 齊U、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、溶液劑、注射劑、栓劑、 軟膏劑、硬膏劑、霜劑、噴霧劑、滴劑、滴丸或貼劑。
[0009] 本發明的藥物組合物在使用時根據病人的情況確定用法用量，如一日2-3次。
【具體實施方式】
[0010] 實施例1 缺血性腦卒中動物模型 1實驗材料與方法 1. 1實驗材料 1. 1. 1動物與分組 SD大鼠140只，雌雄各半，體重220-300g，由中國人民解放軍軍事醫學科學院提供。適 應性喂養一周后，隨機分為4組，即空白組（n=8)，假手術組（n=8)，安慰劑組（n=8)，rhEGF 藥物組（n=8)，安慰劑組和rhEGF藥物組又隨機分為5小組。
[0011] 1.1.2實驗藥品及試劑 rhEGF藥物，由桂林華諾威基因藥業有限公司提供。
[0012] 1.2 方法 1. 2. 1造模 參照Zea-Longa線栓法的基礎上加以改進制成MCAO模型。造模后大鼠出現神經功能 缺損癥狀證明造模成功。空白組大鼠不做任何處理。
[0013] 1.2.2實驗給藥 術后24h所有造模成功的大鼠麻醉清醒后即開始給藥，具體方法如下：空白組、假手術 組不做任何處理；安慰劑組給予生理鹽水，每只靜脈滴注lmL/kg，每日1次；rhEGF藥物，每 只100 μ g/kg靜脈滴注，每日1次。
[0014] L 2. 3神經系統功能缺損評定 采用Longa及Bederson的5分制法進行評分。O分：提起鼠尾，可伸展雙上肢，無神經功 能缺損；1分：不能完全伸展左側前爪，輕度神經功能缺損；2分：提起鼠尾，左側前肢內旋， 肩內收，行走時，大鼠向左側轉圈，中度神經功能缺損；3分：行走時，大鼠向左側傾倒，重度 神經功能缺損；4分：不能自發行走，意識喪失。評分為0分和4分者剔除。
[0015] 1.3標本采集與切片制備 大鼠用10%水合氯醛（350mg/kg體重）腹腔注射麻醉，仰臥位固定于手術板上：立即 打開胸腔，暴露心臟，將灌注穿刺針自心尖部穿入左心室至升主動脈根部，用止血鉗固定 心尖部穿刺針，并夾閉腹主動脈；剪開右心房放血，用生理鹽水250mL左右快速沖洗灌注， 使輸液器液管內呈一條直線，待右心房流出的液體變得清亮時，再灌注預冷的4%多聚甲 醛（0. Olmmol/LPBS配制，pH7. 2-7. 4)約400mL，灌入速度先快后慢，直至頸部僵硬；迅速 取出大腦組織，置4°C 4%多聚甲醛固定液中后固定約6-8h，然后將組織塊依次放入20%、 30%的蔗糖溶液直至組織塊下沉，將下沉后的腦組織從蔗糖溶液取出后放_80°C冰箱備用； 從-80°C冰箱取出腦組織，將所切部位用OCT固定后在-20°C恒冷箱切片機中連續做冠狀切 片（片厚14um)隔三取一，將切下的腦組織貼于多聚賴氨酸處理過的載玻片上；然后入4°C 的丙酮固定IOmin，后依次入0· OlM PBS洗5minX 3次；室溫自然晾干后，存儲于-80°C冰箱 備用。
[0016] 1.4免疫熒光染色 切片從_80°C冰箱取出，室溫自然晾干；PBS液洗3次，每次2min ;切片微晾干后滴加5% 正常山羊血清封閉液和0. 3%TritonX-100破膜劑，室溫下Ih ;PBS液洗3次，每次2min ;滴加 一抗(一抗的比例為1 :1〇〇,用5%正常山羊血清稀釋)，置4°C冰箱內13h ;切片從冰箱取出 后PBS液洗3次，每次2min ;滴加熒光素標記的羊抗兔IgG (二抗的比例為1 :50,用5%正 常山羊血清稀釋)，室溫下Ih ;PBS液洗3次，每次2min ;用濾紙將切片上的殘液吸凈，緩沖 甘油（甘油9份，0. OlMPBS液1份）封片。熒光鏡下觀察拍照。陰性對照試驗：用0. OlMPBS 液代替一抗，以排除二抗的非特異性染色，與實驗片同步進行染色。從滴加二抗開始以后操 作均應避光進行。2結果判斷與數據處理 應用JD-801形態學圖像處理和分析軟件對免疫組織化學反應的強度進行灰度測量， 進行半定量分析。所有實驗數據均以均數土標準差（）表示，各組間進行方差分析，兩組比 較用t檢驗，采用SPSS17. 0統計軟件包進行單因素方差分析，以P〈0. 05判斷差異顯著性。
[0017] 3試驗結果 BDNF免疫熒光染色灰度值測定結果)
【權利要求】
1. rhEGF用于制備預防、治療缺血性腦卒中的藥物或保健品中的應用。 2. rhEGF作為BDNF表達調節劑的用途，可使內源性BDNF表達增加。 3. rhEGF在制備BDNF調節劑中的用途。
4. 一種用于治療缺血性腦卒的藥物組合物，其中包括活性成分rhEGF和藥學可接受載 體。
【文檔編號】A61P9/10GK104491841SQ201510023294
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2015年1月19日 優先權日:2015年1月19日
【發明者】梁青, 梁蘭, 鄒慶薇, 郝瑞雪, 聞家興, 王菁, 于琪, 顧久瑩, 田雪, 李姣, 劉建強 申請人:天津冠勤生物科技有限公司