凝血因子viii聚合物偶聯物的制作方法

凝血因子viii聚合物偶聯物的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種蛋白質構建體，其包含經由凝血因子VIII中的碳水化物部分而被偶聯至水溶性聚合物的凝血因子VIII分子，本發明還涉及其制備方法。在本發明的一個實施方式中，水溶性聚合物選自下組：聚乙二醇(PEG)、多聚唾液酸(PSA)或者葡聚糖。
【專利說明】凝血因子Vl I I聚合物偶聯物
[0001] 本申請是申請日為2009年7月29日、申請號為200980130950. 3(國際申請號為 PCT/US2009/052103)、名稱為凝血因子VIII聚合物偶聯物的發明專利申請的分案申請。
[0002] 本申請為于2007年3月29日申請的美國專利申請11/729,625的部分后續申請， 美國專利申請11/729,625要求分別在2006年6月6日及2006年3月21日申請的美國臨 時專利申請60/790, 239及60/787, 968的優先權。

【技術領域】
[0003] 本發明涉及一種包含與至少一種水溶性聚合物（包括聚環氧烷，例如聚乙二醇） 相結合的凝血因子Vin(FVIII)的蛋白質構建體。此外，本發明還涉及用于延長患有與 FVIII功能缺陷或缺乏相關的出血性疾病的哺乳動物的血液中FVIII的體內半衰期的方 法。

【背景技術】
[0004] 血漿中的凝血因子VIII (FVIII)以很低的濃度循環并且非共價地結合于馮威勒 布蘭特因子（von Willebrand factor，VWF)。在止血期間，FVIII與VWF分開，并作為協同 因子，在鈣和磷脂或者細胞膜存在的情況下，通過提高活化速度，用于受被活化的凝血因子 IX(FIXa)調節的凝血因子X(FX)的活化。
[0005] FVIII被合成為具有結構域A1-A2-B-A3-C1-C2的大約270-330kD的單鏈前體。當 FVIII被從血漿中純化時（比如是"來源于血漿的"或者"血漿的")，FVIII由重鏈（A1-A2-B) 和輕鏈（A3-C1-C2)組成。輕鏈分子量是80kD，然而由于B結構域內的蛋白質水解，重鏈分 子量在90-220kD的范圍內。
[0006] FVIII也可被合成為重組蛋白質用于出血性疾病的治療使用。已經設計了不同的 體外試驗來確定重組體FVIII (rFVIII)作為治療藥物的潛在有效性。這些試驗模擬內源性 FVIII的體內效果。正如體外分析所測定的那樣，FVIII的體外凝血酶處理導致它的促凝血 活性急劇增加和隨后的減少。活化和失活與重鏈和輕鏈兩者中的特異的限制性蛋白質水解 一致，限制性蛋白質水解可改變FVIII中的不同結合表位的可用性，比如允許FVIII與VWF 分離并且結合至磷脂表面、或者改變與某些單克隆抗體的結合能力。
[0007] FVIII的缺乏或者功能障礙與最常見的出血性疾病即甲型血友病相關。甲型血友 病的治療手段選擇是采用來源于血漿的濃縮物或者rFVIII濃縮物的替代療法。FVIII水平 低于1%的重癥甲型血友病患者通常采用預防性療法，目的是在給藥之間保持FVIII在1% 以上。考慮到血液循環中不同的FVIII產物的平均半衰期，該目的通常通過每周給藥兩至 三次FVIII來實現。
[0008] 在市場上有許多濃縮物用于甲型血友病的治療。這些濃縮物之一是重組體產物 Advatc?，其在CHO細胞中被生產出來，并且由巴克斯特保健公司制造。在細胞培養工藝、 純化、或該產品的最終配制中沒有加入人或動物血漿蛋白或者白蛋白。
[0009] 目前許多FVIII濃縮物和治療性多肽類藥物的制造商的目標是開發下一代產品， 該產品具有增強的藥效和藥物動力學特性，同時保持所有其他的產品特征。
[0010] 治療性多肽類藥物可被蛋白水解酶快速降解并被抗體中和。這降低了它們的半衰 期和循環時間，因此限制了它們的療效。已經有研宄顯示，添加可溶性聚合物或者碳水化合 物至多肽可以抑制降解并延長多肽的半衰期。例如，將多肽類藥物聚乙二醇化可保護它們 并且增強它們的藥效和藥物動力學特性（Harris J M et Chess R B, Nat Rev Drug Discov 2003;2:214-21)。聚乙二醇化方法可將聚乙二醇（PEG)的重復單元連接至多肽藥物。分子 的聚乙二醇化可以導致藥物對酶降解的抗性增加、體內半衰期增加、給藥頻率降低、免疫原 性降低、物理和熱穩定性增加、溶解性增加、液體穩定性增加和凝聚減少。
[0011] 因此，比如通過聚乙二醇化，添加可溶性聚合物是提高FVIII產物性能的一種方 法。現有技術狀況已有不同的專利和專利申請記載：
[0012] 美國專利申請6, 037, 452描述了聚（環氧烷）FVIII或者FIX偶聯物，其中蛋白質 通過所述FVIII的羰基被共價連接至聚（環氧烷）上。
[0013] EP1258497B1描述了一種制備FVIII與生物相容性聚合物的偶聯物的方法。該專 利被R^tin等人的出版物（Bioconj Chem 2000;11:387-96)進行了補充。偶聯物包括被 刪除的且被單甲氧基聚乙二醇修飾的重組FVIII。偶聯物降低了 FVIII功能，并且促凝血活 性隨著修飾度的增加而快速地降低。
[0014] WO 4075923 A3描述了一種共聚物-FVIII分子偶聯物，其包含多個偶聯物，其中 每個偶聯物都有一至三個被共價連接至FVIII分子上的水溶性聚合物。該FVIII分子的B 結構域已被刪除。
[0015] 美國專利4, 970, 300描述一種被修飾的FVIII，其中包含具有FVIII活性的蛋白質 的不溶性偶聯物被共價連接至無抗原性配體。
[0016] 美國專利6, 048, 720描述了多肽和生物相容性聚合物的偶聯物。
[0017] W094/15625描述了連接于聚乙二醇的FVIII，該聚乙二醇具有不超過5000道爾頓 的優選分子量。
[0018] 仍需要一種含有被連接的可溶性聚合物以便延長FVIII體內半衰期的FVIII，比 如聚乙二醇化的FVIII，如含有被偶聯的大于10000道爾頓的PEG的全長FVIII，與非聚乙 二醇化的FVIII相比，其保留了功能活性同時提供延長的體內半衰期。


【發明內容】

[0019] 本發明涉及一種蛋白質構建體，其包含經由凝血因子VIII中的碳水化物部分而 偶聯至水溶性聚合物的凝血因子VIII分子。本發明還涉及其制備方法。
[0020] 在本發明的一個實施方式中，提供一種將水溶性聚合物偶聯至FVIII中被氧化的 碳水化物部分的方法，包括在允許偶聯的條件下將被氧化的碳水化物部分與被活化的水溶 性聚合物相接觸。在一個相關的方面，所述水溶性聚合物選自下組：PEG、PSA和葡聚糖。在 另一方面，所述被活化的水溶性聚合物選自下組：PEG-酰肼、PSA-肼和醛活化的葡聚糖。在 本發明的另一方面，所述碳水化物部分是通過在包含NaIO 4的緩沖液中溫育被氧化的。而 在另一方面，所述FVIII中被氧化的碳水化物部分位于FVIII的B結構域。
[0021] 在本發明的另一個實施方式中，提供根據如上所述方法中的任一方法所產生的被 修飾的FVIII。而在另一個實施方式中，提供一種蛋白質構建體，其包含：(a)凝血因子VIII 分子；和（b)至少一個連接至所述凝血因子VIII分子的水溶性聚合物，其中所述水溶性聚 合物通過一個以上位于凝血因子VIII的B結構域中的碳水化物部分而被連接于凝血因子 VIII。在本發明的一個相關的方面，所述水溶性聚合物選自下組：PEG、PSA和葡聚糖。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1顯示用SDS-PAGE及隨后的免疫印跡法測定的rFVIII與PEG偶聯后的條帶變 寬和質量增加。
[0023] 圖2顯示在血友病小鼠中PEG-rFVIII偶聯物與未偶聯FVIII相比的藥物動力學。 空心正方形：PEGrFVIII，200IU FVIII/kg 劑量。實心菱形：天然 rFVIII，200IU FVIII/kg 劑量。
[0024] 圖3顯示通過使用不同抗FVIII抗體的SDS-PAGE進行的聚乙二醇化位點的詳細 分析。
[0025] 圖4顯示凝血酶誘導的天然rFVIII和聚乙二醇化rFVIII的活化和失活。
[0026] 圖5顯示表示天然rFVIII和聚乙二醇化rFVIII的結構域的條帶。
[0027] 圖6顯示天然rFVIII和聚乙二醇化rFVIII的不同結構域的聚乙二醇化程度。
[0028] 圖7顯示天然rFVIII和聚乙二醇化rFVIII的凝血酶失活速度。

【具體實施方式】
[0029] 本發明是一種蛋白質構建體，其包含含有至少一部分完整B結構域的FVIII分 子，該FVIII分子連接至水溶性聚合物上，水溶性聚合物包括：聚環氧烷、聚乙烯基吡咯 烷酮、聚乙烯醇、聚噁唑啉、聚丙烯酰基嗎啉或者碳水化合物如聚唾液酸（PSA)或者葡聚 糖。在本發明的一個實施方式中，水溶性聚合物是分子量大于10000道爾頓的聚乙二醇分 子。在另一個實施方式中，水溶性聚合物的分子量從大于10000道爾頓至大約125000道爾 頓，大約15000道爾頓至20000道爾頓，或者大約18000道爾頓至大約25000道爾頓。在 一個實施方式中，構建體保留了標準的治療性FVIII產品的全部功能活性，并且與標準治 療性FVIII產品相比較，體內半衰期得到延長。在另一個實施方式中，相對于天然凝血因 子 VIII，構建體保留至少 50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、 68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、 93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140 或 150 百分比（％)的生物活性。在一個 相關方面，構建體和天然凝血因子VIII的生物活性通過顯色活性與FVIII抗原值的比值 (FVIII :Chr:FVIII:Ag)來確定。在本發明的另一個實施方式中，相對于天然凝血因子VIII 的體內半衰期，構建體的半衰期減少或者增加〇. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、1. 0、1. 1、1. 2、1. 3、 1. 4、1· 5、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 倍。
[0030] 本發明的起始物質是FVIII，可以來源于人血漿或者通過重組工程技術產生，如同 在美國專利 4, 757, 006、5, 733, 873、5, 198, 349、5, 250, 421、5, 919, 766、EP306968 中所描述 的那樣。
[0031] 此處，術語"凝血因子VIII"或者"FVIII"指的是含有至少一部分完整B結構域的 任何FVIII分子，并且可展示出與天然FVIII相關的生物活性。在本發明的一個實施方式 中，FVIII分子是全長凝血因子VIII。FVIII分子是蛋白質，被能與編碼因子VIIIC的DNA 雜交的DNA序列所編碼。這種蛋白質可以在A1-A2-B-A3-C1-C2結構域之間或者域內的不 同位點處含有氨基酸缺失（美國專利4, 868, 112)。FVIII分子也可以是天然FVIII的類似 物，其中一個以上的氨基酸殘基通過定點突變而被替代。
[0032] 用于本發明的FVIII分子包括全長蛋白質、蛋白質的前體、蛋白質生物活性或功 能性的亞基或片斷、它們功能性衍生物、以及如下所述的它們的變體。提及的FVIII指的是 包括這種蛋白質的所有可能形式，并且其中FVIII的每個形式含有至少一部分或者完整 的天然B結構域序列。
[0033] 根據本發明，術語"重組凝血因子VIII"(rFVIII)可以包括任何通過重組DNA技術 獲得的異源的或者天然產生的rFVIII，或者它們的生物活性衍生物。在某些實施方式中，該 術語包括如上所述的蛋白質和編碼本發明rFVIII的核酸。這種核酸包括，比如但不限于： 基因、前mRNA、mRNA、多態性變體、等位基因、合成的和自然產生的突變體。術語rFVIII包含 的蛋白質包括，比如但不限于：上述那些蛋白質和多肽、被上述核酸編碼的蛋白質、種間同 源物和如下的其它多肽：（1)在至少約25、約50、約100、約200、約300、約400個或者更多 個氨基酸的范圍內（直至成熟的天然蛋白質的406個氨基酸的全長序列），含有的氨基酸序 列相較于此處描述的標準核酸編碼的多肽或者氨基酸序列具有約60%、約65%、約70%、 約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 91%、約 92%、約 93%、約 94%、約 95%、約 96%、約 97%、約98%、約99%或者更大的氨基酸序列一致性；和/或（2)特異性結合抗體，比如多 克隆或者單克隆抗體，該抗體是針對包含此處描述的引用的氨基酸序列的免疫原、它的免 疫原片斷和/或它的保守修飾的變體而產生的抗體。
[0034] 本發明的編碼rFVIII的聚核苷酸，包括但不限于：（1)在嚴格雜交條件下可與編 碼此處描述的引用的氨基酸序列進行特異性雜交的聚核苷酸和它的保守修飾變體；（2)在 至少約25、約50、約100、約150、約200、約250、約500、約1000個或者更多個核苷酸的范圍 內（直至成熟蛋白質的1218個核苷酸的全長序列），含有的核酸序列相較于此處描述的引 用的核酸序列具有約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或者更高的核苷酸序列一致 性。
[0035] 此處使用的術語"內源性FVIII "包括來源于準備接受治療的哺乳動物的FVIII。 該術語還包括由存在于所述哺乳動物中的轉基因或者其它任何外源DNA轉錄而來的 FVIII。此處使用的"外源性FVIII "包括并非來源于所述哺乳動物的FVIII。
[0036] 變體（或者類似物）多肽包括插入型變體，其中一個以上氨基酸殘基被添加至本 發明的FVIII氨基酸序列中。插入可以位于蛋白質的任一末端或者兩個末端，并且/或者 可以位于FVIII氨基酸序列的內部區域內。在任一末端或者兩個末端具有附加的殘基的插 入型變體，包括比如，融合蛋白質或者包括氨基酸標記物或者其他氨基酸標簽的蛋白質。在 一個方面，FVIII分子可以任選地含有N-末端蛋氨酸，尤其是當分子在細菌細胞比如大腸 桿菌（E. coli)中被重組表達時。
[0037] 在缺失型變體中，去除此處所描述的FVIII多肽中一個以上氨基酸殘基。缺失可 以在FVIII多肽的一個末端或者兩個末端發生，并且/或者在FVIII氨基酸序列內去除一 個以上的殘基。因此缺失型變體包括FVIII多肽序列的所有片段。
[0038] 在取代型變體中，FVIII多肽中一個或多個氨基酸殘基被去除并且用可選 的殘基來取代。在一個方面，取代實際上是保守性的，并且這種保守性取代在本領域 中是已知的。可選擇地，本發明還包括那些非保守性的取代。典型的保守性取代在 Lehninger[Biochemistry,第 2 版；Worth Publishers 公司，New York(1975),第 71-77 頁]中被描述，并且列在下文中。
[0039] 保守件取代
[0040] 側鏈特征 氨基酸
[0041] 非極性（疏水性）：
[0042]

【權利要求】
1. 一種蛋白質構建體，其包含： (a) 凝血因子VIII分子；和 (b) 至少一個連接于所述凝血因子VIII分子的PSA或者PEG，其中所述PSA或者PEG 經由一個或一個以上的位于凝血因子VIII的B結構域中的碳水化物部分而連接于凝血因 子VIII，其中所述分子保留了至少50%的天然凝血因子VIII活性。
2. 如權利要求1所述的蛋白質構建體，其中所述分子保留了至少80%的天然凝血因子 VIII活性。
3. 如權利要求1所述的蛋白質構建體，其中凝血因子VIII是重組凝血因子VIII或血 漿凝血因子VIII。
4. 如權利要求1所述的蛋白質構建體，其中所述PSA或者PEG經由連接物而連接于碳 水化物部分，其中所述連接物優選為可釋放的或可水解的，更優選為4-[4-N-馬來酰亞胺 基苯基]丁酸肼（MBPH)。
5. -種組合物，其包含權利要求1至4任一項中所述的蛋白質構建體。
6. 如權利要求5所述的組合物，其中所述組合物基本上不含白蛋白。
7. 如權利要求4所述的組合物，其進一步包含未偶聯的凝血因子VIII部分。
8. -種用于治療出血性疾病的組合物，其中所述組合物包含： (i) 如權利要求5至7任一項中所述的組合物；和 (ii) 藥學上可接受的賦形劑。
9. 如權利要求8中所述的組合物在制備治療出血性疾病的藥物中的應用。
10. 如權利要求9所述的應用，其中所述治療包含： (i) 根據出血性疾病的類型和個體臨床病史確定組合物的劑量；和 (ii) 給藥組合物。
11. 使得凝血因子VIII分子在患有出血性疾病個體內有效維持在至少1%水平的藥物 組合物的單位劑量，其包含： (i) 如權利要求5至7任一項中所述的組合物； (ii) 藥學上可接受的賦形劑。
12. 如權利要求8所述的組合物或如權利要求9所述的應用或如權利要求11所述的單 位劑量，其中所述出血性疾病是血友病A。
13. 如權利要求11所述的單位劑量，其中所述藥物組合物呈適于注射的形式。
14. 如權利要求11所述的單位劑量，其中所述藥物組合物被包裝在器皿中。
15. -種包含藥物組合物的試劑盒，其包含： (i) 如權利要求5至7任一項中所述的組合物；和 (ii) 藥學上可接受的賦形劑， 被包裝在含有標簽的容器內，該標簽描述了所述藥物組合物的用途。
16. -種包含第一容器和第二容器的試劑盒，第一容器包含： (i) 如權利要求5至7任一項中所述的組合物；和 (ii) 藥學上可接受的賦形劑； 第二容器包含用于第一容器中的組合物的生理學上可以接受的復配溶液，其中所述試 劑盒和描述所述組合物用途的標簽一起被包裝。
17. 如權利要求15或16所述的試劑盒，其中所述藥物組合物以單位劑量的形式被包 裝。
18. -種制備如權利要求1所述的蛋白質構建體的方法，其中所述方法包含在允許偶 聯的條件下，令至少一個PSA或PEG經由一個或多個位于凝血因子VIII的B結構域中的碳 水化物部分而連接于凝血因子VIII。
19. 如權利要求18所述的方法，其中所述分子保留了至少50%的天然凝血因子VIII 活性，優選至少80%的天然凝血因子VIII活性。
【文檔編號】A61K47/48GK104479006SQ201410817617
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2009年7月29日 優先權日:2008年8月1日
【發明者】皮特·圖雷切克, 于爾根·西科曼 申請人:巴克斯特國際公司, 巴克斯特保健股份有限公司