阿爾泰獨尾草降血糖有效部位的制備方法及其用途
【專利摘要】本發明涉及一種新疆特有植物阿爾泰獨尾草降糖有效部位、制備方法及其用途，該方法從阿爾泰獨尾草中采用有機溶劑提取，大孔樹脂分離純化獲得降糖有效部位，并闡明其醫學用途，經初步的活性篩選試驗證明：通過本發明所述的方法獲得的有效部位具有蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP1B）抑制作用，可作為原料或輔助劑用于防治糖尿病的藥物或保健品。
【專利說明】阿爾泰獨尾草降血糖有效部位的制備方法及其用途
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種獨尾草降糖有效部位的制備方法及其用途。
【背景技術】
[0002] 阿爾泰獨尾草（Eremurus altaicus)屬百合科獨尾草屬植物。在我國僅僅分布在 新疆的天山，阿爾泰山海拔1600-2500m的山地陽坡，草甸。而獨尾草屬植物以根入藥，已有 悠久的民間食用和藥用歷史。其主要成分為大黃酸，大黃酚，大黃素，蘆薈大黃素等多糖類 物質，具有良好的殺菌，抑菌，消炎，解毒，抗紫外線輻射，提高人體免疫機能等功能，并對腫 瘤細胞，艾滋病病毒具有良好的抑制作用。但是經過文獻及專利檢索，并沒有發現阿爾泰獨 尾草抗糖尿病活性的報告。
[0003] 糖尿病是一種常見的世界性多發病。它是由人體自身分泌的胰島素不足而引起 的。而胰島素的作用是調節人體內糖的代謝，即促進血糖合成糖元，加速血糖分解，降低血 糖濃度。維吾爾醫認為，糖尿病的發病原因除與四大"何里提"學說中的膽汁質旺盛引起五 臟虛弱有關外，其致病因素大多是綜合性的，尤以嗜啖酒醇、過食肥甘和精神過度緊張三 者居多，腎虛為本，燥熱、瘀血為標。維吾爾醫治療糖尿病給予調理"何里提"，降低血糖， 增強體質，止渴，促進胰島素分泌，增強胰島素敏感性，改善胰島素抵抗，助消化為基本原則 上采取維吾爾醫飲食療法、藥物療法、非藥物療法等系統的治療方式進行治療。
[0004] 隨著社會的進步以及人們生活水平的提高，糖尿病患者，尤其是非胰島素 依賴型糖尿病（即II型糖尿病）人數成倍增長。已有研宄表明蛋白酪氨酸磷酸酶 1B(PTP1B, protein tyrosine phosphatase 1B)可減弱胰島素及瘦素信號轉導，引起脂代 謝異常，是導致胰島素抵抗和肥胖的關鍵環節。PTPlB通過對胰島素受體激酶（insulin receptor kinase，IRK)或IRK活性片段的磷酸化酪氨酸殘基去磷酸化作用對胰島素信號 傳導進行負調節。在新生肝細胞中，PTPlB的減少增加了 IRA/GLUT2復合物，從而增加葡萄 糖的吸收。在肝臟中特異性刪除PTPlB基因，可以改善代謝綜合癥的狀況和削弱飲食引起 的內質網壓力，Ali MI等人的研宄也指出刪除PTPlB基因后會明顯改善肥胖且瘦素抵抗的 小鼠的外周胰島素抵抗和動脈血管功能。因此PTPlB是治療II型糖尿病、肥胖等疾病的重 要靶點之一。本發明直接針對PTPlB靶點進行篩選。
【發明內容】
[0005] 本發明目的在于，提供一種阿爾泰獨尾草降糖有效部位的制備方法及其用途，該 方法從阿爾泰獨尾草全草中采用有機溶劑提取，大孔樹脂分離純化獲得降糖有效部位，經 初步的活性篩選試驗證明：通過本發明所述的方法獲得的阿爾泰獨尾草有效部位具有蛋白 酪氨酸磷酸酶（PTPlB)抑制作用；該有效部位可用于預防治療糖尿病的藥物或保健品的應 用。
[0006] 本發明所述的阿爾泰獨尾草降糖有效部位的制備方法，按下列步驟進行：
[0007] a、將阿爾泰獨尾草原料進行清洗、粉碎，加入5-40倍量體積的濃度為50-95 %的 乙醇或甲醇水溶液；
[0008] b、將步驟a中得到的混合液在溫度40-82°C的條件下加熱回流提取1-3次，每次 1-4小時，過濾，合并濾液，減壓濃縮至無醇味，得到醇提物；
[0009] c、將步驟b醇提物，選擇濕法或干法上樣，濕法上樣用水或濃度1-10 %乙醇或甲 醇溶解分散，加入預先處理好的大孔樹脂柱，以濃度為30%乙醇或甲醇水溶液洗脫雜質，再 以濃度50-95%乙醇或甲醇水溶液梯度洗脫，收集流出液，濃縮即可得到具有降血糖活性的 阿爾泰獨尾草有效部位。
[0010] 步驟 C 所用的大孔樹脂型號為 HPD100、HPD300、HPD200A、HPD400、D101、AB-8、X-5、 D4020 或 ADS17。
[0011] 通過該方法獲得的阿爾泰獨尾草有效部位對蛋白質酪氨酸磷酸酶IB具有抑制作 用。
[0012] 通過該方法獲得的阿爾泰獨尾草有效部位在制備治療降血糖的藥物中的用途。
[0013] 通過該方法獲得的阿爾泰獨尾草有效部位在制備治療降血糖的保健品中的用途。
【具體實施方式】
[0014] 實施例1
[0015] 取阿爾泰獨尾草300g進行清洗、粉碎，置于圓底燒瓶中，加入20倍量的體積濃度 為50 %的乙醇水溶液攪拌均勻，得到混合液；
[0016] 將得到的混合液在82°C，加熱回流提取3次，每次時間為2h，過濾，合并提取液，減 壓濃縮至無醇味，得到醇提物16. 8g ;
[0017] 將醇提物加入濃度5%的乙醇水溶液溶解分散，加入預先處理好的大孔樹脂X-5 柱中吸附，用濃度30 %乙醇水溶液洗脫雜質后，再用濃度為70 %的乙醇水溶液洗脫，收集 70%乙醇水的流出液，濃縮后即可得到I. 52g具有降血糖活性的阿爾泰獨尾草有效部位。
[0018] 實施例2
[0019] 取阿爾泰獨尾草300g進行清洗，粉碎，置于圓底燒瓶中，加入10倍量體積濃度為 70 %的乙醇水溶液攪拌均勻，得到混合液；
[0020] 將得到的混合液在溫度60°C，加熱回流提取3次，每次時間為3h，過濾，合并提取 液，減壓濃縮至無醇味，得到醇提物14. 2g ;
[0021] 將醇提物加入濃度5%的乙醇水溶液溶解分散，加入預先處理好的大孔樹脂 D4020柱中吸附，用濃度30%乙醇水溶液清洗除雜后，再用濃度70%的乙醇水溶液洗脫，收 集70%乙醇水的流出液，濃縮后即可得到I. 75g具有降血糖活性的阿爾泰獨尾草有效部 位。
[0022] 實施例3
[0023] 取阿爾泰獨尾草300g進行清洗，粉碎，置于圓底燒瓶中，加入40倍量的體積濃度 為95 %的乙醇水溶液攪拌均勻，得到混合液；
[0024] 將混合液在溫度60°C，加熱回流提取3次，每次4h，過濾，合并提取液，減壓濃縮至 無醇味，得到醇提物11. Ig ;
[0025] 將醇提物中加入濃度1 %的乙醇水溶液溶解分散，加入預先處理好的大孔樹脂 ADS-17柱中吸附，用濃度30%乙醇水溶液洗脫雜質后，再用濃度50%的乙醇水溶液洗脫， 收集50%乙醇水的流出液，濃縮后即可得到I. 67g具有降血糖活性的阿爾泰獨尾草有效部 位。
[0026] 實施例4
[0027] 取阿爾泰獨尾草300g進行清洗，破碎，置于圓底燒瓶中，加入25倍量的體積濃度 為60 %的乙醇水溶液攪拌均勻，得到混合液；
[0028] 將混合液在溫度40°C，加熱回流提取2次，每次3h，過濾，合并提取液，將提取液放 置旋轉蒸發儀內減壓濃縮至無醇味，得到醇提物15. 8g ;
[0029] 將醇提物中加入濃度8%的乙醇水溶液溶解分散，加入預先處理好的大孔樹脂 HPD200A柱中吸附，用30 %乙醇水溶液洗脫雜質后，再用80 %的乙醇水溶液洗脫，收集80 % 乙醇水的流出液，濃縮后即可得到2. 7g具有降血糖活性的阿爾泰獨尾草有效部位。
[0030] 實施例5
[0031] 取阿爾泰獨尾草300g進行清洗，破碎，置于圓底燒瓶中，加入35倍量的體積濃度 為30 %的甲醇水溶液攪拌均勻，得到混合液；
[0032] 將混合液在溫度70°C，加熱回流提取2次，每次2h，過濾，合并提取液，將提取液放 置旋轉蒸發儀內減壓濃縮至無醇味，得到醇提物24. 6g ;
[0033] 將醇提物中加入水溶液溶解分散，加入預先處理好的大孔樹脂AB-8柱中吸附，用 濃度30%甲醇水溶液清洗除雜后，再用濃度95%的甲醇水溶液洗脫，收集95%甲醇水的流 出液，濃縮后即可得到3. 7g具有降血糖活性的阿爾泰獨尾草有效部位。
[0034] 實施例6
[0035] 取阿爾泰獨尾草300g進行清洗，粉碎，置于圓底燒瓶中，加入5倍量體積濃度為 60 %的甲醇水溶液攪拌均勻，得到混合液；
[0036] 將混合液在溫度80°C，加熱回流提取2次，每次3h，過濾，合并提取液，將提取液放 置旋轉蒸發儀內減壓濃縮至無醇味，得到醇提物13. 7g ;
[0037] 將醇提物采用干法上樣，用聚酰胺攪拌均勻，加入預先處理好的大孔樹脂HPD-300 柱中吸附，用濃度30 %甲醇水溶液洗脫雜質后，再用濃度50 %的甲醇水溶液洗脫，收集 50%甲醇水的流出液，濃縮后即可得到約I. 2g具有降血糖活性的阿爾泰獨尾草有效部位。
[0038] 實施例7
[0039] 取阿爾泰獨尾草300g進行清洗，破碎，置于圓底燒瓶中，加入40倍體積濃度為 80 %的甲醇水溶液攪拌均勻，得到混合液；
[0040] 將混合液在溫度70°C，加熱回流提取1次，每次3h，過濾，合并提取液，將提取液放 置旋轉蒸發儀內減壓濃縮至無醇味，得到醇提物17. 7g ;
[0041] 將醇提物中加入水溶液溶解分散，加入預先處理好的大孔樹脂HPD-100柱中吸 附，用濃度30 %甲醇水溶液洗脫雜質后，再用濃度70 %的甲醇水溶液洗脫，收集70 %甲醇 水的流出液，濃縮后即可得到約3. 7g具有降血糖活性的阿爾泰獨尾草有效部位。
[0042] 實施例8
[0043] 取阿爾泰獨尾草300g進行清洗，粉碎，置于圓底燒瓶中，加入25倍體積濃度為 50 %的乙醇水溶液攪拌均勻，得到混合液；
[0044] 將混合液在溫度80°C，加熱回流提取3次，每次lh，過濾，收集提取液，將提取液放 置旋轉蒸發儀內減壓濃縮至無醇味，得到醇提物16. 7g ;
[0045] 將醇提物中加入濃度10%的乙醇水溶液溶解分散，加入預先處理好的大孔樹脂 DlOl柱中吸附，用濃度30%乙醇水溶液洗脫雜質后，再用濃度50%的乙醇水溶液洗脫，收 集50%乙醇水的流出液，濃縮后即可得到約2. 3g具有降血糖活性的阿爾泰獨尾草有效部 位。
[0046] 實施例9
[0047] 取阿爾泰獨尾草300g進行清洗，粉碎，置于圓底燒瓶中，加入20倍體積濃度為 70 %的乙醇水溶液攪拌均勻，得到混合液；
[0048] 將混合液在75°C，加熱回流提取1次，時間為2h，過濾，將提取液放置旋轉蒸發儀 內減壓濃縮至無醇味，得到醇提物20. 2g ;
[0049] 將醇提物中加入水溶液溶解分散，加入預先處理好的大孔樹脂HPD-400柱中吸 附，用濃度30%乙醇水溶液洗脫雜質后，再用濃度95%的乙醇水溶液洗脫，收集95%乙醇 水的流出液，濃縮后即可得到3. 4g具有降血糖活性的阿爾泰獨尾草有效部位。
[0050] 實施例10 :篩選實驗：
[0051] 蛋白酪氨酸磷酸酶IB(PTPlB)篩選方法：用對-硝基苯基磷酸二鈉（pNPP)作為 底物，以在陽性藥物釩酸鈉為對照，利用酶標儀進行蛋白酪氨酸磷酸酶IB(PTPlB)酶抑制 劑的高通量篩選，根據蛋白酪氨酸磷酸酶IB(PTPlB)水解對-硝基苯基磷酸二鈉（pNPP) 的磷酸基團而產生顏色反應來測定蛋白酪氨酸磷酸酶IB(PTPlB)的活性；酶反應體系組成 如下：緩沖液（50mM HEPES，pH 7. 3, IOOmM氯化鈉，0. 1 %牛血清白蛋白，和ImM二硫代蘇 糖醇），蛋白酪氨酸磷酸酶IB(PTPlB)融合蛋白，對-硝基苯基磷酸二鈉（pNPP)，蛋白酪氨 酸磷酸酶IB(PTPlB)特異抑制劑釩酸鈉（100 μ g/mL);反應體系混勻后在溫度37°C放置 30rnin，置比色儀上測定405波長條件下的吸收值（A)，測定結果減去本底值后計算酶活 性，表1 ;
[0052] 表1不同條件下得到的提取物對蛋白酪氨酸磷酸酶IB(PTPlB)的IC50濃度和抑 制率
[0053]
【權利要求】
1. 一種阿爾泰獨尾草全草降糖有效部位制備方法，其特征在于按下列步驟進行： a、 將阿爾泰獨尾草原料進行清洗、粉碎，加入5-40倍量體積的濃度為50-95%的乙醇或 甲醇水溶液攪拌均勻，得到混合液； b、 將步驟a中得到的混合液在溫度40-82°C的條件下加熱回流提取1-3次，每次1-4小 時，過濾，合并濾液，減壓濃縮至無醇味，得到醇提物； c、 將步驟b醇提物，選擇濕法或干法上樣，濕法上樣用水或濃度1-10%乙醇或甲醇溶解 分散，加入預先處理好的大孔樹脂柱，以濃度為30%乙醇或甲醇水溶液洗脫雜質，再以濃度 50-95%乙醇或甲醇水溶液梯度洗脫，收集流出液，濃縮即可得到具有降血糖活性的阿爾泰 獨尾草有效部位。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟c所用的大孔樹脂型號為HPD100、 HPD300、HPD200A、HPD400、D101、AB-8、X-5、D4020 或 ADS17。
3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于通過該方法獲得的阿爾泰獨尾草有效部 位對蛋白質酪氨酸磷酸酶1B具有抑制作用。
4. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于通過該方法獲得的阿爾泰獨尾草有效部 位在制備治療降血糖的藥物中的用途。
5. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于通過該方法獲得的阿爾泰獨尾草有效部 位在制備治療降血糖的保健品中的用途。
【文檔編號】A61K36/896GK104491322SQ201410728538
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月4日 優先權日:2014年12月4日
【發明者】阿吉艾克拜爾·艾薩, 李勛, 信學雷, 謝連珍 申請人:中國科學院新疆理化技術研究所