具有輔助降血糖功能的五肽klpgf的制作方法
【專利摘要】本發明屬于生物【技術領域】，特別涉及一個具有輔助降血糖功能的五肽。具體而言，本發明公開了一種既能抑制α-葡萄糖苷酶活性，也能抑制α-淀粉酶活性的五肽KLPGF，五肽KLPGF的氨基酸序列為Lys-Leu-Pro-Gly-Phe。本發明可用于開發輔助降血糖的藥物和功能食品。
【專利說明】具有輔助降血糖功能的五肽KLPGF
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及一個既能與α -葡萄糖苷酶結合并能抑制 α-葡萄糖苷酶活性，也能與α-淀粉酶結合并能抑制α-淀粉酶活性的具有輔助降血糖功 能的五肽KLPGF。
【背景技術】
[0002] 近年來隨著人類生活水平的不斷提高以及不良飲食習慣，造成了很多高血糖患 者，糖尿病患病率急劇上升，糖尿病的病理機制等研宄迫在眉睫，人們迫切需要能有效降低 人體血糖的活性成分。
[0003] 長久以來靈芝及冬蟲夏草被人們當做降血糖保健食品服用，但是由于原料價格昂 貴給患者及家屬帶來沉重的經濟負擔。
[0004] 目前口服抗糖尿病的活性組分迅速發展，如α -葡萄糖苷酶抑制劑和醛糖還原酶 抑制劑等。研宄發現體內的許多酶在調節血糖過程中起著重要的作用，可作為抗糖尿病的 作用靶點，為研制治療糖尿病的有效成分提供有效途徑。
[0005] 抑制α -淀粉酶和α -葡萄糖苷酶的活性被認為是控制糖尿病的一個有效策略， 成為輔助降血糖活性成分開發的一個新思路。阿卡波糖作為一種新型口服降糖藥，主要是 在腸道內競爭性抑制葡萄糖甙水解酶，阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶抑制活性的半抑制濃度 (IC 50)為 60. 8 μ mol L'
[0006] 從這個角度出發，越來越多的研宄都集中在尋找更有效的酶抑制劑，進而開發更 有效的抗糖尿病的功能成分。
[0007] 隨著研宄的不斷深入，研宄發現動植物多糖具有降血糖的功效，然而關于生物活 性肽降血糖活性的研宄鮮有報道。
[0008] 活性肽在生命過程中重要的作用逐漸為人們所認識，其作為神經遞質、神經調節 因子和激素參與受體介導的信號轉導，影響著生物體內許多重要的生理生化功能，如血壓 調節和血糖調節等，而且活性肽易于被人體吸收，同時兼具化學合成和化學修飾等特點引 起了人們的極大興趣，也必將推動關于活性肽降血糖功效研宄的不斷深入。
【發明內容】
[0009] 本發明要解決的技術問題是提供一種具有輔助降血糖功能的五肽KLPGF。
[0010] 本發明所涉及的一些縮寫具有以下含義：
[0011] K ：Lys
[0012] L ：Leu
[0013] P ：Pro
[0014] G ：Gly
[0015] F ：Phe
[0016] Lys :賴氨酸
[0017] Leu:亮氨酸
[0018] Pro :脯氨酸
[0019] Gly :甘氨酸
[0020] Phe :苯丙氨酸
[0021] 為了解決上述技術問題，本發明提供一種五肽KLPGF，其氨基酸序列為： Lys-Leu-Pro-Gly-Phe0
[0022] 本發明提供的五肽KLPGF通過對α -淀粉酶和α -葡萄糖苷酶的活性進行抑制， 進而發揮輔助降血糖的作用，形態為白色粉末狀。五肽KLPGF抑制α-淀粉酶活性的半抑 制濃度為59. 5±5· 7 ymol L-1，抑制α -葡萄糖苷酶活性的半抑制濃度為120. 0±4· 0 ymol L'
[0023] 本發明所提供的五肽KLPGF可委托上海科肽生物科技有限公司合成獲得。
[0024] 本發明所涉及的檢測方法如下：
[0025] 1.抑制葡萄糖苷酶活性：
[0026] 抑制α -葡萄糖苷酶活性的檢測方法具體操作步驟為：取5 μ L的α -葡萄糖苷酶 溶液（l〇unit/ml，溶解在0. lmol/L pH 6. 8的磷酸鉀緩沖液，ρΗ6. 8)與10 μ L不同濃度的 活性肽溶液（活性肽溶解在10% DMSO溶液中）依次加入到620 μ L 0. lmol/L磷酸鉀緩沖 液（pH值6. 8)，在37. 5°C下預熱20分鐘后加入10 μ L對硝基苯基葡萄糖苷（pNPG，IOmmol/ U作為反應底物以啟動反應。
[0027] 反應混合液置于37.5 °C條件下進行反應30分鐘，最后加入650 yL的lmol/L Na2COjS止反應，使用紫外可見分光光譜儀在410nm處測定進而算出酶活性。
[0028] 測定原理以無色的對硝基苯酚-a-D-葡萄糖苷（pNPG)作反應底物，經α-葡萄 糖苷酶水解α-1，4-葡萄糖苷鍵后釋放出對硝基苯酚（ρΝΡ)，在堿性條件下對硝基苯酚是 黃色的，最后通過監測410nm下的ρΝΡ產生量作為α -1，4-葡萄糖苷酶活性大小的判定標 準。
[0029] 活性肽對α -葡萄糖苷酶抑制活性計算公式如下：
[0030] 抑制活性/%= (ODa-ODb)/ODaX 100
[0031] 式中：0Da為空白對照組中反應完成后在410nm處測定的吸光度；
[0032] ODb為添加活性肽組中反應完成后在410nm處測定的吸光度。
[0033] 2.抑制淀粉酶活性：
[0034] 抑制淀粉酶活性測定具體步驟為：取10 μ L的α -淀粉酶水溶液（lunit/L)與 10 μ L不同的濃度活性肽溶液（活性肽樣品用10% DMSO溶解）混合預熱15分鐘，而后加 入500 μ L質量分數為1 %的淀粉溶液（溶解于20mol/L pH 6. 9的磷酸鈉緩沖液）啟動反 應。
[0035] 反應在37. 5°C條件下進行5分鐘，滴加600 μ L DNS試劑（含質量分數1 %的3， 5-二硝基水楊酸和含有質量分數12%酒石酸鉀鈉的0. 4mol/L氫氧化鈉溶液）終止反應。
[0036] 反應結束后將反應混合物置于沸水浴中15分鐘，然后冷卻至室溫在540nm處用 UV-2550分光光度計測定。
[0037] 淀粉酶抑制活性的測定原理是建立在淀粉酶將淀粉水解為麥芽糖，麥芽糖與3， 5-二硝基水楊酸發生還原反應生成3-胺基-5-硝基水楊酸的顯色基團，其顏色深淺與糖濃 度成正比。
[0038] 活性肽對淀粉酶的抑制活性按如下公式進行計算：
[0039] 淀粉酶抑制活性/%= (ODa-ODb)/ODaX 100
[0040] 式中：0Da為空白對照組中反應完成后在540nm處測定的吸光度；
[0041] ODb為添加活性肽組中反應完成后在540nm處測定的吸光度。
[0042] 本發明的優點：
[0043] 1)、本發明提供的五肽具有抑制α -淀粉酶活性的作用。
[0044] 2)、本發明提供的五肽同時具有抑制α -葡萄糖苷酶活性的作用。
【具體實施方式】
[0045] 下面結合實施例對本發明進一步闡述，但不限于此。
[0046] 實施例1、五肽KLPGF對α -淀粉酶的抑制活性：
[0047] 活性測定操作步驟：取10 μ L的α -淀粉酶水溶液（lunit/L)與10 μ L不同的濃度 (10 μ Μ、20 μ Μ、40 μ Μ、80 μ Μ、160 μ M和 320 μ Μ)五肽 KLPGF 溶液（用 10% DMSO 溶解）混合 預熱15分鐘，而后加入500 μ 1質量分數為1 %的淀粉溶液（溶解于20mol/L pH 6. 9的磷 酸鈉緩沖液）啟動反應。活性測定反應條件：在37. 5°C條件下進行5分鐘，滴加600 μ LDNS 試劑（含質量分數1 %的3, 5-二硝基水楊酸和含有質量分數12%的酒石酸鉀鈉的0. 4mol/ L氫氧化鈉溶液）終止反應，反應結束后將反應混合物置于沸水浴中15分鐘，然后冷卻至室 溫在540nm處用UV-2550分光光度計進行測定，進而算出活性肽對α -淀粉酶的抑制活性。
[0048] 結果：五肽KLPGF抑制α -淀粉酶活性的半抑制濃度為59. 5 ±5. 7 μ mol L-1。
[0049] 實施例2、五肽KLPGF對α -葡萄糖苷酶的抑制活性：
[0050] 活性測定操作步驟為：取5yL的α-葡萄糖苷酶溶液（l〇unit/ml，溶解在 0· lmol/L pH 6. 8 的磷酸鉀緩沖液，ρΗ6· 8)與 10 μ L 不同濃度（10 μ Μ、20 μ Μ、40 μ M、 80μΜ、160μΜ和320 μΜ)的五肽KLPGF溶液（溶解在10% DMSO溶液中）依次加入到 620 μ L0. lmol/L磷酸鉀緩沖液（pH6. 8)，在37. 5°C下預熱20分鐘后加入10 μ L對硝基苯基 葡萄糖苷（pNPG，10mmol/L)作為反應底物以啟動反應。活性測定反應條件：反應混合液置 于37. 5°C條件下進行反應30分鐘，最后加入650 yL的lmol/L似20)3終止反應，使用紫外 可見分光光譜儀在410nm處測定來進而算出活性肽對α -葡萄糖苷酶的抑制活性。
[0051] 結果：五肽KLPGF抑制α -葡萄糖苷酶活性的半抑制濃度為120. 0±4. 0 μ mol L'
【權利要求】
1.具有輔助降血糖功能的五肽KLPGF，其特征是：所述五肽KLPGF的氨基酸序列為： Lys-Leu_Pr〇-Gly-Phe 〇
【文檔編號】A61P3/10GK104497105SQ201410693316
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年11月20日 優先權日:2014年11月20日
【發明者】于志鵬, 趙文竹, 勵建榮 申請人:渤海大學