一種長牡蠣白介素il17n重組蛋白及其制備和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種長牡蠣白介素IL17N重組蛋白及其制備和應(yīng)用。長牡蠣白介素IL17N重組蛋白為序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列所示。本發(fā)明獲得的重組蛋白可用于抗菌的飼料添加劑和治療腫瘤蛋白類藥物的研發(fā)。
【專利說明】一種長牡蠣白介素 I LI 7N重組蛋白及其制備和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種長牡蠣白介素 IL17N重組蛋白及 其制備和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 白介素17是高等動物中一類重要的炎癥細胞因子，在機體免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)中發(fā)揮 著重要的作用，目前已在高等哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了五大類白介素亞家族成員，其中IL17A及 IL17F的功能研究的比較清楚，其他成員的功能還有待進一步的研究。白介素17可以上調(diào) 免疫相關(guān)基因的表達，加速體內(nèi)病原的清除。白介素17的失調(diào)會造成機體的許多炎癥反應(yīng) 以及自身免疫性疾病，諸如牛皮癬，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及腦脊髓炎等。
[0003] 目前研究發(fā)現(xiàn)白介素17存在于腫瘤組織中，對腫瘤組織的微環(huán)境起到了調(diào)節(jié)作 用。高等動物中白介素17對腫瘤組織起到了雙重作用，一方面可以通過激活細胞毒性T細 胞、自然殺傷細胞等對腫瘤起到抑制的作用，另一方面白介素17可以激活I(lǐng)L6和STAT3信 號通路，誘導(dǎo)VEGF及TGF- β的表達，利于腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和生長。
[0004] 貝類是我國重要的海水養(yǎng)殖生物，近年來養(yǎng)殖貝類病害頻發(fā)，對我國海水養(yǎng)殖業(yè) 造成重大的經(jīng)濟損失。從貝類自身的免疫防御系統(tǒng)入手，闡明其白介素17等細胞因子的分 子功能及其對機體的免疫調(diào)節(jié)作用，將為病害防治和良種選育提供新思路。由于貝類進化 地位較原始，其分子功能分化不完全，同一個蛋白往往兼具多種生物學(xué)功能，因此貝類的功 能基因具有誘人的開發(fā)利用潛力。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明目的在于提供一種長牡蠣白介素 IL17N重組蛋白及其制備和應(yīng)用。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0007] -種長牡蠣白介素 IL17N重組蛋白，長牡蠣白介素 IL17N重組蛋白為序列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列所示。
[0008] -種長牡蠣白介素 IL17N基因重組蛋白的制備方法，
[0009] (1)以長牡蠣白介素基因編碼區(qū)為模板，采用Pl和P2引物進行PCR擴增，待用；
[0010] (2)上述PCR擴增產(chǎn)物與PMD19-T Simple載體通過T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化，測序鑒 定重組子；
[0011] (3)采用NdeI、BamHI對上述的重組子及PMAL-C5X進行酶切，酶切片段通過T4連 接酶連接，轉(zhuǎn)化，測序鑒定重組子；
[0012] (4)將上述構(gòu)建重組子轉(zhuǎn)入Transetta DE3表達菌株中進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，而后純化， 即得到具有序列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列的重組蛋白IL17N;
[0013] 所述引物Pl和P2分別為：
[0014] Pl :5, -GACATATGATGAATGCCCCTGTCTGGCT-3,；
[0015] P2 :5 ' -GAGGATCCTTAGCTGGGTCTCTGGACGG-3 '。
[0016] 一種長牡蠣IL17N基因重組蛋白的應(yīng)用，所述序列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列 所示的重組蛋白IL17N用于制備抑菌劑或飼料添加劑。
[0017] 所述序列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列所示的重組蛋白IL17N用于制備抑制革蘭 氏陰性菌或革蘭氏陽性菌的的抑菌劑。
[0018] 一種長牡蠣IL17N基因重組蛋白的應(yīng)用，所述序列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列 所示的重組蛋白IL17N用于制備抗腫瘤的藥物。
[0019] 所述序列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列所示的重組蛋白IL17N用于制備抗小鼠肺 纖維瘤細胞的藥物。
[0020] 本發(fā)明所具有的優(yōu)點：
[0021] 本發(fā)明利用體外重組表達技術(shù)獲得了長牡蠣白介素 IL17N重組蛋白，該重組蛋白 能抑制大腸桿菌和藤黃微球菌的生長，并對小鼠肺纖維瘤細胞L929具有明顯的殺傷作用。 同時在開發(fā)廣譜抗菌類藥物、飼料添加劑和抗腫瘤藥物等方面具有潛在應(yīng)用價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022] 圖1為本發(fā)明實施例提供的長牡蠣IL17N基因重組蛋白對小鼠肺纖維瘤細胞L929 生長的抑制作用圖。
[0023] 圖2為本發(fā)明實施例提供的長牡蠣IL17N基因重組蛋白對大腸桿菌和藤黃微球菌 生長的抑制作用圖。
【具體實施方式】
[0024] 下面的實驗例中將對本發(fā)明作進一步的闡述，但本發(fā)明不限于此。
[0025] 實施例1
[0026] 長牡蠣IL17N基因編碼區(qū)的體外原核重組表達，包括下列步驟：
[0027] 1、重組載體的構(gòu)建
[0028] 本發(fā)明中采用的重組載體為NEB公司的pMAL-C5X原核表達載體。
[0029] 以長牡蠣白介素基因編碼區(qū)為模板，通過PCR技術(shù)，使用基因特異性引物Pl (5'_G ACATATGATGAATGCCCCTGTCTGGCT-3'）和 P2(5' -GAGGATCCTTAGCTGGGTCTCTGGACGG-3'）擴增 長牡蠣IL17N基因的編碼區(qū)片段。反應(yīng)條件為：首先94°C預(yù)變性5分鐘，然后進入下列循 環(huán)：94°C變性30秒，68°C退火30秒，68°C延伸30秒，共進行30個循環(huán)，最后72°C延伸10分 鐘。將PCR產(chǎn)物純化回收，與pMD19-T simple載體連接，NdeI和BamHI雙酶切，與相同酶 切的PMAL-C5X連接。轉(zhuǎn)化后菌落PCR篩選并測序，提取陽性克隆質(zhì)粒，完成載體的構(gòu)建。
[0030] 2、重組蛋白的表達
[0031] 以Transetta DE3為重組表達菌株，將上述構(gòu)建的重組載體轉(zhuǎn)化到表達宿主菌 中，挑取單克隆，提取質(zhì)粒，測序驗證讀碼框正確。挑取單克隆，接種于IOmL LB液體培養(yǎng) 基中，37°C震蕩搖床中培養(yǎng)12-16小時，然后將培養(yǎng)液以體積比I :100的比例接種至200mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至0D600 = 0. 4-0. 6。加入IPTG，使終濃度達到0. 8mM mL-1， 28°C繼續(xù)培養(yǎng)6h。4°C，10000rpm，離心lOmin，收集菌體，于-20°C凍存?zhèn)溆?。取ImL菌液離 心，棄去上清后，加入80yL水和20yL 5X蛋白上樣緩沖液（250mMTris-HCL，10% (W/V) SDS，0· 5% (W/V)BPB，50% (V/V)甘油，5% (W/V) β -巰基乙醇），100°C沸水煮沸 10 分鐘， 稍離心，SDS-PAGE檢測表達產(chǎn)物。
[0032] 3、重組蛋白的純化
[0033] 將上述所得蛋白采用Amylose Resin純化獲得可溶重組蛋白。
[0034] 具體操作步驟如下：
[0035] Amylose Res in色譜分離帶MBP標簽的重組蛋白
[0036] (I)Amylose Resin 裝柱，I. 6 X 20cm，柱床體積為 20mL ;
[0037] (2)用緩沖液 1 (緩沖液 1 為 20mM Tris-HCl, 200mM NaCl, ImM EDTA)平衡 5 個床 體積，流速為2mL min-1 ;
[0038] (3)將 20ml 緩沖液 I (20mM Tris-HCl, 200mM NaCl, ImM EDTA) 0· 22 μ m 濾膜過濾， 上樣，流速為ImL min-1 ;
[0039] (4)用緩沖液1再洗5個床體積，流速為2mL min-1 ;
[0040] (5)用含IOmM麥芽糖的緩沖液1進行階段洗脫，流速為ImL min-1，收集洗脫后溶 液，用SDS-PAGE檢測融合蛋白的表達；
[0041] (6)用純水流洗5個柱床體積，0. 1%的SDS流洗3個柱床體積，流速為2mL min-1， 再用純水流洗5個柱床體積，20%乙醇封柱，置于4°C環(huán)境中保存。純化蛋白置于超純水中 透析，去除鹽離子及麥芽糖。透析超低溫凍干，即得到SEQ ID NO. 1所示的長牡蠣IL17N基 因重組蛋白。
[0042] SEQ ID NO. 1
[0043] MNAPVWLTLVLALLTRCCLPHPVSRCRGCHIFDPPFRGLDYSDYDDSERLDTQSICPWSTIMVEDNDRV PRQLPSTTCTKSSVVFQLNGTPVEYACELVEVTVSVLKYHPSGYWERSDELVPVACTAVQRPS
[0044] 序列特征：
[0045] 長度：132個氨基酸
[0046] 類型：氨基酸
[0047] 鏈型：單鏈
[0048] 拓撲結(jié)構(gòu)：線型
[0049] 特性：分子量為14. 89kDa，等電點為5. 04,具有保守的cysteine-knot折疊結(jié)構(gòu) 域。
[0050] 來源：長牡蠣
[0051] 實施例2
[0052] 長牡蠣IL17N原核重組蛋白的抑菌活性分析
[0053] 對大腸桿菌或藤黃微球菌的生長抑制實驗：在平底96孔板（Costar，F(xiàn)isher)中每 孔加入200 μ L LB液體培養(yǎng)基和10 μ L對數(shù)生長期的菌液（大腸桿菌或藤黃微球菌），再 分別加入10 μ g，100 μ g的上述重組蛋白IL17N，另設(shè)MBP蛋白對照組和PBS空白對照組。 220rpm，37°C振蕩培養(yǎng)，每隔Ih用酶標儀分別檢測記錄各孔0D600值。每個樣品設(shè)四個重 復(fù)，根據(jù)4次測定結(jié)果取平均值作圖。實驗表明重組IL17N蛋白能夠抑制革蘭氏陰性菌和 革蘭氏陽性菌的繁殖（參見圖2)。
[0054] 同時結(jié)合附圖給出相應(yīng)的結(jié)論500 μ g/ml重組的IL17N蛋白能夠明顯的抑制革蘭 氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的生長。表明了重組的IL17N蛋白可作為抑菌劑用于飼料添加 劑。
[0055] 實施例3
[0056] 長牡蠣IL17N原核重組蛋白對腫瘤增殖抑制活性分析
[0057] 對小鼠肺纖維瘤細胞L929增殖抑制實驗：在平底48孔板（Costar，F(xiàn)isher)中 每孔加200 μ I DEME培養(yǎng)基重懸的L929細胞，重懸液中細胞數(shù)目約為5000,而后置37°C， 5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h ;吸去細胞培養(yǎng)上清液后，各孔分別加入濃度為100ng/ml、500ng/ ml、1000ng/ml、1500ng/ml、2000ng/ml 的上述重組蛋白 IL17N，0· 2ml/ 孔，各設(shè)雙復(fù)孔，并設(shè) 培養(yǎng)液陰性對照及標簽蛋白MBP空白對照；置37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，每孔加入 20μ 1碧云天生產(chǎn)的CCK8,450nm測定吸光度，評價細胞存活率（參見圖1)。
[0058] 同時結(jié)合附圖給出相應(yīng)的結(jié)論1000ng/ml重組的IL17N蛋白對小鼠纖維瘤細胞系 產(chǎn)生了較為明顯的抑制作用，表明了重組的IL17N蛋白可應(yīng)用與抗腫瘤藥物的研發(fā)。
【權(quán)利要求】
1. 一種長牡蠣白介素IL17N重組蛋白，其特征在于：長牡蠣白介素IL17N重組蛋白為 序列表SEQ ID NO. 1中氣基酸序列所不。
2. -種根據(jù)權(quán)利要求1所述的長牡蠣白介素IL17N基因重組蛋白的制備方法，其特征 在于： (1) 以長牡蠣白介素基因編碼區(qū)為模板，采用P1和P2引物進行PCR擴增，待用； (2) 上述PCR擴增產(chǎn)物與pMD19-T Simple載體通過T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化，測序鑒定重 組子； (3) 采用Ndel、BamHI對上述的重組子及pMAL-C5X進行酶切，酶切片段通過T4連接 酶連接，轉(zhuǎn)化，測序鑒定重組子； (4) 將上述構(gòu)建重組子轉(zhuǎn)入Transetta DE3表達菌株中進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，而后純化，即得 到具有序列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列的重組蛋白IL17N; 所述引物P1和P2分別為： P1 :5, -GACATATGATGAATGCCCCTGTCTGGCT-3,； P2 :5' -GAGGATCCTTAGCTGGGTCTCTGGACGG-3'。
3. -種按權(quán)利要求1所述的長牡蠣IL17N基因重組蛋白的應(yīng)用，其特征在于：所述序 列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列所示的重組蛋白IL17N用于制備抑菌劑或飼料添加劑。
4. 按權(quán)利要求3所述的長牡蠣IL17N基因重組蛋白的應(yīng)用，其特征在于：所述序列表 SEQ ID NO. 1中氨基酸序列所示的重組蛋白IL17N用于制備抑制革蘭氏陰性菌或革蘭氏陽 性菌的的抑菌劑。
5. -種按權(quán)利要求1所述的長牡蠣IL17N基因重組蛋白的應(yīng)用，其特征在于：所述序 列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列所示的重組蛋白IL17N用于制備抗腫瘤的藥物。
6. 按權(quán)利要求5所述的長牡蠣IL17N基因重組蛋白的應(yīng)用，其特征在于：所述序列表 SEQ ID NO. 1中氨基酸序列所示的重組蛋白IL17N用于制備抗小鼠肺纖維瘤細胞的藥物。
【文檔編號】A61K38/20GK104402987SQ201410687340
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月25日
【發(fā)明者】宋林生, 辛魯生, 王玲玲, 劉瑞 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所