一種脫細(xì)胞舌基質(zhì)材料及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種脫細(xì)胞舌基質(zhì)材料及其制備方法，其特點(diǎn)是選取健康的動物的舌組織進(jìn)行物理、化學(xué)和酶綜合法處理，通過低滲液、高滲液、Triton X-100和核酸酶低溫處理制備,獲得具有良好的生物相容性和適當(dāng)?shù)纳锝到馑俾实拿摷?xì)胞舌基質(zhì)材料。該材料可用于舌部再生修復(fù)以及舌部疾患的研究模型。其材料來源廣泛、易得，價(jià)格低廉，制作容易。
【專利說明】一種脫細(xì)胞舌基質(zhì)材料及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)屬于及生物醫(yī)用材料的加工領(lǐng)域，具體涉及一種脫細(xì)胞舌基質(zhì)材料及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)是由細(xì)胞分泌到細(xì)胞外間充質(zhì)中的蛋白質(zhì)和多糖類大分子物質(zhì)。ECM通過高度組織有序的細(xì)胞外微環(huán)境，構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)架連接組織結(jié)構(gòu)，對細(xì)胞的生存、分化等細(xì)胞生理活動具有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。因此，可模擬ECM的支架基底和支架材料是組織工程研宄和組織修復(fù)的理想載體。細(xì)胞與ECM的接觸是動態(tài)的，ECM的變化將會導(dǎo)致鄰近細(xì)胞形態(tài)和功能的改變。用于組織工程的理想支架材料需要為種植的細(xì)胞提供與體內(nèi)ECM相同或者相似的微環(huán)境(包括ECM的組成、結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)特征等)。但是，天然的ECM是由多種蛋白質(zhì)組成(主要分為膠原、糖蛋白、氨基聚糖及蛋白聚糖、彈性蛋白4大類)，并且具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，不易在體外重構(gòu)與體內(nèi)ECM組成相同和結(jié)構(gòu)一致的ECM材料。通過不同化學(xué)、物理或酶學(xué)去細(xì)胞方法從組織和器官獲得天然的ECM，為解決這一難題提供了新的有效解決途徑。去細(xì)胞化基質(zhì)具有組織或者細(xì)胞特異性的ECM蛋白質(zhì)和微結(jié)構(gòu)，同時(shí)具有良好的力學(xué)特性、細(xì)胞相容性以及生物降解性，有利于細(xì)胞粘附、生長、增殖及分化。
[0003]制備脫細(xì)胞基質(zhì)材料的方法有很多，主要是通過物理、化學(xué)和生物酶綜合處理的方法。中國專利申請?zhí)枮?01110134511.9的發(fā)明專利涉及制備一種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)材料的方法，雖然可以比較徹底地去除細(xì)胞而且處理時(shí)間短，但是制備過程中采用了十二烷基硫酸鈉(SDS)的處理。由于SDS的強(qiáng)洗脫效果，很大程度上破壞了細(xì)胞基質(zhì)的結(jié)構(gòu)完整性和生物活性，此外使用SDS制備的細(xì)胞外基質(zhì)具有潛在的生物毒性，不利于該基質(zhì)材料對組織的三維結(jié)構(gòu)重建。中國專利申請?zhí)枮?01210237911.7的發(fā)明專利涉及制備一種細(xì)胞外基質(zhì)支架材料的脫細(xì)胞方法。雖然采用了吡喃葡萄糖苷降低了去污劑在清洗過程中可能對再植細(xì)胞造成的潛在生物毒性，但主要應(yīng)用于含較多膠原纖維和彈力纖維的組織和器官，應(yīng)用到肌纖維豐富且發(fā)達(dá)的舌組織中并不完全適用。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的目的是為了克服以上技術(shù)的不足，采用健康的動物舌組織為原料，應(yīng)用復(fù)合酶處理劑和堿等化學(xué)物質(zhì)，提供一種具有良好生物相容性和適當(dāng)?shù)纳锝到馑俾实拿摷?xì)胞舌基質(zhì)材料。
[0005]本發(fā)明是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0006](1)選取健康的動物舌組織，切成1厘米見方的小塊，用PBS緩沖液洗去血漬備用；
[0007](2)將舌組織反復(fù)凍融3次，破碎細(xì)胞；
[0008](3)把舌組織塊置于75%酒精中消毒；
[0009](4)將舌組織塊懸于入無菌三級水中，4°C中速攪拌處理12小時(shí)；
[0010](5)將舌組塊織懸于1M NaCl無菌溶液中，4°C中速攪拌處理24小時(shí)；
[0011](6)將舌組織塊懸于2% TritonX-100的無菌緩沖溶中，4°C中速攪拌處理48小時(shí)；
[0012](7)將舌組織塊懸于5mM CaCl#P 5mM MgCl 2無菌溶液中，4°C中速攪拌處理24小時(shí)；
[0013](8)將舌組織塊轉(zhuǎn)移到含有DNase I的無菌D_Hanks緩沖液的EP管中，37°C處理24小時(shí)；
[0014](9)將舌組織塊懸于無菌PBS緩沖溶液中，4°C中速攪拌處理24小時(shí)，獲得所述脫細(xì)胞舌基質(zhì)材料。
[0015]進(jìn)一步地，所述步驟(1)中選取組織為新鮮的無病毒感染的、無病史的動物舌頭。
[0016]進(jìn)一步地，所述步驟(2)中，破碎細(xì)胞的方法為將組織塊放入_80°C冰凍30分鐘后取出，在37°C水浴解凍，如此反復(fù)凍融3次。
[0017]進(jìn)一步地，所述步驟(6)中，無菌緩沖液可選用PBS緩沖液或者pH = 7.4的Tris-HCl緩沖液。
[0018]進(jìn)一步地，所述脫細(xì)胞舌基質(zhì)材料可放置于含有90 μ g/ml氨芐的PBS中，4°C保存2個(gè)月以上。
[0019]本發(fā)明還包括根據(jù)上述任意一項(xiàng)的方法制備獲得的脫細(xì)胞舌基質(zhì)材料。
[0020]本發(fā)明脫細(xì)胞舌基質(zhì)材料的制備方法中所有操作均在無菌超凈工作臺中進(jìn)行。
[0021]采用本方法所制備的脫細(xì)胞舌基質(zhì)材料，能夠滿足以下醫(yī)學(xué)應(yīng)用和醫(yī)學(xué)研宄的要求:
[0022]1、作為舌的替代品，用于手術(shù)后舌部損傷和缺失的修復(fù)。
[0023]2、用于舌部潰瘍的修復(fù)，尤其適用于因不良修復(fù)體和咬傷引起的舌部潰瘍的醫(yī)治Ο
[0024]3、可以用于口腔科整形術(shù)，如腭裂的修復(fù)等。
[0025]4、可作為細(xì)胞培養(yǎng)和組織工程體外模型材料，如用于舌再生和舌發(fā)育研宄、舌癌發(fā)生和浸潤的研宄等。
[0026]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0027]1、在維持動物舌頭三維組織構(gòu)造不變的前提下，徹底清除了動物舌中的細(xì)胞成分，得到具有完整的三維組織構(gòu)造的舌部基質(zhì)。
[0028]2、具有良好的力學(xué)性能、可賦形性、良好的細(xì)胞分化增殖環(huán)境以及良好的粘附性會κ ;
[0029]3、方法簡便、易行，經(jīng)濟(jì)、合理、安全、可靠。
[0030]4、整個(gè)工藝過程屬于清潔化制備，對環(huán)境無污染。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0031]圖la為含有細(xì)胞的新鮮小鼠舌組織的HE染色顯微鏡照片，圖lb為經(jīng)脫細(xì)胞處理后的小鼠舌細(xì)胞外基質(zhì)材料的HE染色顯微鏡照片。
[0032]圖2a為含有細(xì)胞的新鮮小鼠舌組織的掃描電子顯微鏡照片，圖2b為經(jīng)脫細(xì)胞處理后的小鼠舌細(xì)胞外基質(zhì)材料的掃描電子顯微鏡照片。
[0033]圖3為新鮮小鼠舌組織DNA含量和脫細(xì)胞處理后小鼠舌組織ECM中的DNA含量柱狀圖。
[0034]圖4a為含有細(xì)胞的新鮮小鼠舌組織的Collagen I免疫組化結(jié)果，圖4b為經(jīng)脫細(xì)胞處理后的小鼠舌細(xì)胞外基質(zhì)材料的Collagen I免疫組化結(jié)果。
[0035]圖5a為含有細(xì)胞的新鮮小鼠舌組織的Collagen IV免疫組化結(jié)果，圖5b為經(jīng)脫細(xì)胞處理后的小鼠舌細(xì)胞外基質(zhì)材料的Collagen IV免疫組化結(jié)果。
[0036]圖6a為含有細(xì)胞的新鮮小鼠舌組織的Fibronectin免疫組化結(jié)果，圖6b為經(jīng)脫細(xì)胞處理后的小鼠舌細(xì)胞外基質(zhì)材料的Fibronectin免疫組化結(jié)果。
[0037]圖7a為含有細(xì)胞的新鮮小鼠舌組織的Laminin免疫組化結(jié)果，圖7b為經(jīng)脫細(xì)胞處理后的小鼠舌細(xì)胞外基質(zhì)材料的Laminin免疫組化結(jié)果。
[0038]圖8a為含有細(xì)胞的新鮮豬舌組織的HE染色顯微鏡照片(X 100)，圖8b為經(jīng)脫細(xì)胞處理后的豬舌細(xì)胞外基質(zhì)材料的HE染色顯微鏡照片(X 100)。
[0039]圖9為經(jīng)脫細(xì)胞處理后的豬舌細(xì)胞外基質(zhì)的掃描電子顯微鏡照片。
[0040]圖10為新鮮豬舌組織DNA含量和脫細(xì)胞處理后豬舌組織ECM中的DNA含量柱狀圖。
[0041]圖11a為含有細(xì)胞的新鮮大鼠舌組織的HE染色顯微鏡照片，圖lib為經(jīng)脫細(xì)胞處理后的大鼠舌細(xì)胞外基質(zhì)的HE染色顯微鏡照片(X 100)。
[0042]圖12為經(jīng)脫細(xì)胞處理后的大鼠舌細(xì)胞外基質(zhì)材料的掃描電子顯微鏡照片。
[0043]圖13為新鮮大鼠舌組織DNA含量和脫細(xì)胞處理后大鼠舌組織ECM中的DNA含量柱狀圖。
[0044]圖14a和圖14b為小鼠舌ECM材料在注射舌癌細(xì)胞系Cal27培養(yǎng)20天后的HE染色顯微鏡照片。其中圖14b (400 X)為圖14a (100 X)的局部放大圖。
[0045]圖15a和圖15b為利用I型膠原制作的皮膚模型在接種舌癌細(xì)胞系Cal27培養(yǎng)14天后的HE染色顯微鏡照片。其中圖15b (400 X)為圖15a (100 X)的局部放大圖。
【具體實(shí)施方式】
[0046]下面通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行具體的描述。
[0047]實(shí)施例1小鼠舌ECM的制作
[0048](1)取材:選取健康的小鼠的舌組織，用PBS清洗兩邊去除血漬。至于EP管中-80 °C冰箱備用。
[0049](2)破碎細(xì)胞:將組織塊從_80°C冰箱取出在37°C水浴鍋解凍后再放回-80°C冰箱冰凍30分鐘，如此反復(fù)凍融3次。
[0050](3)消毒和準(zhǔn)備:把組織塊至于75%的酒精中，用縫合線將舌組織塊吊起，懸掛于250ml的廣口瓶中，并在瓶底放置一枚1cm的磁力攪拌棒。
[0051](4)預(yù)清洗和破碎:加入250ml的無菌三級水，至于磁力攪拌器上(檔位2)4°C處理12小時(shí)。
[0052](5)清洗細(xì)胞殘片:將舌組織換到裝有250ml 1M NaCl無菌溶液的小型攪拌循環(huán)器中。4°C處理24小時(shí)。
[0053](6)破碎并清洗:將舌組織換到裝有250ml 2% TritonX-100的無菌PBS緩沖溶液的小型攪拌循環(huán)器中。4°C處理48小時(shí)。
[0054](7)清洗并增強(qiáng)酶活:將舌組織換到裝有250ml 5mM CaCljP 5mM MgCl 2無菌溶液的小型攪拌循環(huán)器中。4°C處理24小時(shí)。
[0055](8)去殘留核酸:將舌組織轉(zhuǎn)移到含有300單位的DNase I (sigma)的lml無菌D-Hanks緩沖液的EP管中，37°C處理24小時(shí)。
[0056](9)清洗:將舌組織換到裝有250ml無菌PBS緩沖溶液的小型攪拌循環(huán)器中，4°C處理24小時(shí)。
[0057]結(jié)果評價(jià)
[0058]1、ECM結(jié)構(gòu)觀察:ECM用10%中性福爾馬林固定、脫水、石蠟包埋、切成0.5 μ m厚的薄片，經(jīng)脫蠟脫水，蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察ECM結(jié)構(gòu)，其HE染色顯微鏡照片見圖lb，同時(shí)制作新鮮小鼠舌組織的HE染色，其顯微鏡照片見圖la?？梢娪帽景l(fā)明方法制備的小鼠ECM結(jié)構(gòu)，證實(shí)無細(xì)胞結(jié)構(gòu)殘留，并且細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)保持完整。
[0059]2、ECM超微結(jié)構(gòu)觀察:將ECM組織用臨界點(diǎn)干燥儀干燥，鍍金，掃描電子顯微鏡觀察，拍攝電子顯微鏡照片見圖2b，同時(shí)拍攝新鮮小鼠舌組織電子微鏡照片見圖2a。對比兩圖可見用本發(fā)明方法制備的小鼠ECM結(jié)構(gòu)，可以完整地脫去細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并且比較完好地保留了細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的纖維結(jié)構(gòu)。
[0060]3、ECM 中 DNA含量檢測:將ECM組織磨碎后，用 DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN)裂解消化提取DNA，并用Nano-drop (Thermo)測定DNA含量，并與新鮮小鼠舌組織DNA含量進(jìn)行對比，結(jié)果見圖3。可見用本發(fā)明方法制得的小鼠ECM中，DNA含量減少了 90.98%，表明成功去除了絕大部分核酸殘留。
[0061]4、ECM中Collagen I蛋白的免疫組化檢測:ECM用10%中性福爾馬林固定、脫水、石蠟包埋、切成0.5 μπι厚的薄片，經(jīng)脫蠟脫水，去過氧化物酶，抗原修復(fù)，山羊血清封閉，孵育CollagenI抗體(稀釋比例1:500) (abeam)4°C過夜，孵育二抗室溫1小時(shí)，DAB顯色，封片觀察，拍攝顯微鏡照片如圖4b所示；同時(shí)拍攝新鮮小鼠舌組織的Collagen I免疫組化顯微鏡照片4a作為對照。
[0062]5、ECM中Collagen IV蛋白的免疫組化檢測:ECM用10%中性福爾馬林固定、脫水、石蠟包埋、切成0.5 μπι厚的薄片，經(jīng)脫蠟脫水，去過氧化物酶，抗原修復(fù)，山羊血清封閉，孵育Collagen IV抗體(稀釋比例1:300) (abeam)4°C過夜，二抗室溫孵育1小時(shí)，DAB顯色，封片觀察拍攝顯微鏡照片如圖5b所示；同時(shí)拍攝新鮮小鼠舌組織的Collagen IV免疫組化顯微鏡照片5a作為對照。
[0063]6、ECM中l(wèi)aminin蛋白的免疫組化檢測:ECM用10%中性福爾馬林固定、脫水、石蠟包埋、切成0.5 μ m厚的薄片，經(jīng)脫蠟脫水，去過氧化物酶，抗原修復(fù)，山羊血清封閉，孵育laminin抗體(稀釋比例1:200) (abeam) 4°C過夜，二抗室溫孵育1小時(shí)，DAB顯色，封片觀察，拍攝顯微鏡照片如圖6b所示；同時(shí)拍攝新鮮小鼠舌組織的Laminin免疫組化顯微鏡照片6a作為對照。
[0064]7、ECM中fibronectin蛋白的免疫組化檢測:ECM用10%中性福爾馬林固定、脫水、石蠟包埋、切成0.5 μ m厚的薄片，經(jīng)脫蠟脫水，去過氧化物酶，抗原修復(fù)，山羊血清封閉，孵育fibronectin抗體(稀釋比例1:250) (abeam)4°C過夜，二抗室溫孵育1小時(shí)，DAB顯色，封片觀察，拍攝顯微鏡照片如圖7b所示；同時(shí)拍攝新鮮小鼠舌組織的fibronectin免疫組化顯微鏡照片7a作為對照。
[0065]實(shí)施例2，豬舌ECM的制作
[0066](1)取材:選取健康的豬的舌組織，分解為一厘米見方的小塊，用PBS清洗兩邊去除血漬。至于EP管中-80°C冰箱備用。
[0067](2)破碎細(xì)胞:將組織塊從_80°C冰箱取出在37°C水浴鍋解凍后再放回-80°C冰箱冰凍30分鐘，如此反復(fù)凍融3次。
[0068](3)消毒和準(zhǔn)備:把組織塊至于75%的酒精中，用縫合線將舌組織塊吊起，懸掛于250ml的廣口瓶中，并在瓶底放置一枚1cm的磁力攪拌棒。
[0069](4)預(yù)清洗和破碎:加入250ml的無菌三級水，至于磁力攪拌器上(檔位2)4°C處理12小時(shí)。
[0070](5)清洗細(xì)胞殘片:將舌組織換到裝有250ml 1M NaCl無菌溶液的小型攪拌循環(huán)器中。4°C處理24小時(shí)。
[0071](6)破碎并清洗:將舌組織換到裝有250ml 2% TritonX-100的無菌PBS緩沖溶液的小型攪拌循環(huán)器中。4°C處理48小時(shí)。
[0072](7)清洗并增強(qiáng)酶活:將舌組織換到裝有250ml 5mM CaCljP 5mM MgCl 2無菌溶液的小型攪拌循環(huán)器中。4°C處理24小時(shí)。
[0073](8)去殘留核酸:將舌組織轉(zhuǎn)移到含有300單位的DNase I (sigma)的lml無菌D-Hanks緩沖液的EP管中，37°C處理24小時(shí)。
[0074](9)清洗:將舌組織換到裝有250ml無菌PBS緩沖溶液的小型攪拌循環(huán)器中。4°C處理48小時(shí)。
[0075]結(jié)果評價(jià)
[0076]1、ECM結(jié)構(gòu)觀察:ECM用10%中性福爾馬林固定、脫水、石蠟包埋、切成0.5 μ m厚的薄片，經(jīng)脫蠟脫水，HE染色，其HE染色顯微鏡照片見圖8b，同時(shí)制作新鮮豬舌組織的HE染色，其顯微鏡照片見圖8a?？梢娪帽景l(fā)明方法制備的豬ECM結(jié)構(gòu)中無細(xì)胞結(jié)構(gòu)殘留，并且細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)保持完整。
[0077]2、ECM超微結(jié)構(gòu)觀察:將ECM組織用臨界點(diǎn)干燥儀干燥，鍍金，掃描電子顯微鏡觀察，拍攝電子顯微鏡照片見圖9?？梢娪帽景l(fā)明方法制備的豬ECM結(jié)構(gòu)，可以完整地脫去細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并且比較完好地保留了細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的纖維結(jié)構(gòu)。
[0078]3、ECM 中 DNA含量檢測:將ECM組織磨碎后，用 DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN)裂解消化提取DNA，并用Nano-adrop (Thermo)測定DNA含量，并與新鮮小鼠舌組織DNA含量進(jìn)行對比，結(jié)果見圖10?？梢娪帽景l(fā)明方法制備的豬ECM中，DNA含量減少97.17%，表明成功去除了絕大部分核酸殘留。
[0079]實(shí)施例3，大鼠舌ECM的制作
[0080](1)取材:選取健康的大鼠的舌組織，分解為一厘米見方的小塊，用PBS清洗兩邊去除血漬。至于EP管中-80 °C冰箱備用。
[0081](2)破碎細(xì)胞:將組織塊從_80°C冰箱取出在37°C水浴鍋解凍后再放回_80°C冰箱冰凍30分鐘，如此反復(fù)凍融3次。
[0082](3)消毒和準(zhǔn)備:把組織塊至于70%的酒精中，用縫合線將舌組織塊吊起，懸掛于250ml的廣口瓶中，并在瓶底放置一枚1cm的磁力攪拌棒。
[0083](4)預(yù)清洗和破碎:加入250ml的無菌三級水，至于磁力攪拌器上(檔位2)4°C處理12小時(shí)。
[0084](5)清洗細(xì)胞殘片:將舌組織換到裝有250ml 1M NaCl無菌溶液的小型攪拌循環(huán)器中。4°C處理24小時(shí)。
[0085](6)破碎并清洗:將舌組織換到裝有250ml 2% TritonX-100的無菌PBS緩沖溶液的小型攪拌循環(huán)器中。4°C處理24小時(shí)。
[0086](7)清洗并增強(qiáng)酶活:將舌組織換到裝有250ml 5mM CaCljP 5mM MgCl 2無菌溶液的小型攪拌循環(huán)器中。4°C處理24小時(shí)。
[0087](8)去殘留核酸:將舌組織轉(zhuǎn)移到含有300單位的DNase I (sigma)的lml無菌D-Hanks緩沖液的EP管中，37°C處理24小時(shí)。
[0088](9)清洗:將舌組織換到裝有250ml無菌PBS緩沖溶液的小型攪拌循環(huán)器中。4°C處理24小時(shí)。
[0089]結(jié)果評價(jià)
[0090]1、ECM結(jié)構(gòu)觀察:ECM用10%中性福爾馬林固定、脫水、石蠟包埋、切成0.5 μ m厚的薄片，經(jīng)脫蠟脫水，HE染色，觀察ECM結(jié)構(gòu)其HE染色顯微鏡照片見圖11b，同時(shí)制作新鮮大鼠舌組織的HE染色，其顯微鏡照片見圖11a?？梢娪帽景l(fā)明方法制備的大鼠ECM結(jié)構(gòu)中無細(xì)胞結(jié)構(gòu)殘留，并且細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)保持完整。
[0091 ] 2、ECM超微結(jié)構(gòu)觀察:將ECM組織用臨界點(diǎn)干燥儀干燥，鍍金，掃描電子顯微鏡觀察，見圖12?？梢娪帽景l(fā)明方法制備的大鼠ECM結(jié)構(gòu)，可以完整地脫去細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并且比較完好地保留了細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的纖維結(jié)構(gòu)。
[0092]3、ECM 中 DNA含量檢測:將ECM組織磨碎后，用 DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN)裂解消化提取DNA，并用Nano-adrop (Thermo)測定DNA含量，并與新鮮大鼠舌組織DNA含量進(jìn)行對比，結(jié)果見圖13?？梢娪帽景l(fā)明方法制得的大鼠ECM中，DNA含量減少98.93%，表明成功去除了絕大部分核酸殘留。
[0093]實(shí)施例4，小鼠舌ECM在舌癌細(xì)胞增殖和浸潤研宄的應(yīng)用
[0094](1)注射細(xì)胞:準(zhǔn)備106的Cal27 口腔癌細(xì)胞。在超凈工作臺中用無菌的大頭針將實(shí)施例1制得的舌ECM組織固定在新制蠟板上。用酒精燈將巴氏管拉取口徑大約為100 μπι左右的玻璃針，吸取Cal27 口腔癌細(xì)胞注入ECM組織中。
[0095](2)培養(yǎng):將注入Cal27 口腔癌細(xì)胞的舌ECM組織放至于加有3mlDF+10% FBS培養(yǎng)液的3.5cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放于37°C的C02培養(yǎng)箱，定期換液，培養(yǎng)20天。
[0096](3)組織固定:將培養(yǎng)后的舌ECM組織至于10%中性福爾馬林中，固定48小時(shí)。
[0097](4)制片:將固定的ECM組織用PBS緩沖液洗5分鐘，經(jīng)自動脫水機(jī)脫水、石蠟包埋、石蠟切片、切成5 μπι的薄片，烘片過夜，4°C保存。
[0098](5)HE染色:將組織切片用二甲苯脫蠟，酒精梯度復(fù)水后用蘇木素染色5分鐘，伊紅染色1分鐘，酒精梯度脫水，二甲苯透化，中性樹脂封片觀察。圖14a和圖14b為小鼠舌ECM材料在注射舌癌細(xì)胞Cal27培養(yǎng)20天后的HE染色顯微鏡照片。從圖中可以看出Cal27細(xì)胞在本發(fā)明的小鼠舌ECM材料中的具有很高的增殖能力和組織浸潤性。
[0099]在此補(bǔ)充利用皮膚模型培養(yǎng)舌癌細(xì)胞系的方法，用于與舌ECM材料對照。
[0100](1)皮膚模型的建立:將含有1 x 105癌巢成纖維細(xì)胞(Cancer associatedfibroblast, CAF)的10% FBS的RD培養(yǎng)液與酸性膠原(collagen I)在冰上迅速混合均勻后，取2ml加入到24孔板的一個(gè)孔中。連續(xù)培養(yǎng)1周，讓CAF細(xì)胞收縮皮膚模型。
[0101](2)培養(yǎng):將牛津杯垂直放置于皮膚模型上方，在其中加入IX 106個(gè)Cal27細(xì)胞。將24孔板放于37°C的0)2培養(yǎng)箱，用DF+10% FBS培養(yǎng)液培養(yǎng)，定期換液，培養(yǎng)14天。
[0102](3)組織固定:將培養(yǎng)后的皮膚模型至于10%中性福爾馬林中，固定48小時(shí)。
[0103](4)制片:將固定的皮膚模型用PBS緩沖液洗5分鐘，經(jīng)自動脫水機(jī)脫水、石蠟包埋、石蠟切片、切成5 μπι的薄片，烘片過夜，4°C保存。
[0104](5)HE染色:將組織切片用二甲苯脫蠟，酒精梯度復(fù)水后用蘇木素染色5分鐘，伊紅染色1分鐘，酒精梯度脫水，二甲苯透化，中性樹脂封片觀察。圖15a和圖15b為皮膚模型在接種舌癌細(xì)胞Cal27培養(yǎng)14天后的HE染色顯微鏡照片。從圖中可以看出Cal27細(xì)胞主要分布于皮膚模型的表面，細(xì)胞呈單層生長，沒有表現(xiàn)出明顯的增殖和浸潤現(xiàn)象。
[0105]以上實(shí)施例只用于對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù)上述
【發(fā)明內(nèi)容】
作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。
【權(quán)利要求】
1.一種脫細(xì)胞舌基質(zhì)材料的制備方法，包括以下步驟: (1)選取健康的動物舌組織，切成1厘米見方的小塊，用？83緩沖液洗去血漬備用； (2)將舌組織塊反復(fù)凍融3次，破碎細(xì)胞； (3)把舌組織塊置于75%酒精中消毒； (4)將舌組織塊懸于入無菌三級水中，41:中速攪拌處理12小時(shí)； (5)將舌組塊織懸于11^01無菌溶液中，41:中速攪拌處理24小時(shí)；(6)將舌組織塊懸于2%11-1^0^-100的無菌緩沖溶中，41:中速攪拌處理48小時(shí)；(7)將舌組織塊懸于5禮0^12和5禮%012無菌溶液中，41:中速攪拌處理24小時(shí)；(8)將舌組織塊轉(zhuǎn)移到含有0似86I的無菌0-他1^8緩沖液的2？管中，371:處理24小時(shí)； (9)將舌組織塊懸于無菌？83緩沖溶液中，400中速攪拌處理24小時(shí)，獲得所述脫細(xì)胞舌基質(zhì)材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫細(xì)胞舌基質(zhì)材料的制備方法，其特征在于:所述步驟(1)中選取舌組織為新鮮的無病毒感染的、無病史的動物舌頭。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫細(xì)胞舌基質(zhì)材料的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中，破碎細(xì)胞的方法為將組織塊放入-801:冰凍30分鐘后取出，在371:水浴解凍，如此反復(fù)凍融3次。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫細(xì)胞舌基質(zhì)材料的制備方法，其特征在于:所述步驟(6)中，無菌緩沖液可選用緩沖液或者邱=7.4的緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫細(xì)胞舌基質(zhì)材料的制備方法，其特征在于:所述脫細(xì)胞舌基質(zhì)材料可放置于含有90 ^ 8加1氨芐的中，41:保存2個(gè)月以上。
6.按照權(quán)利要求1?5任意一項(xiàng)的方法制備得到的脫細(xì)胞舌基質(zhì)材料。
【文檔編號】A61L27/50GK104491927SQ201410664973
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月19日
【發(fā)明者】張雁, 趙龍, 余姝毅, 鄭駿恒 申請人:中山大學(xué)