抗程序性死亡配體1(pd-l1)的人單克隆抗體的制作方法

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抗程序性死亡配體1(pd-l1)的人單克隆抗體的制作方法
【專利摘要】本發明提供以高親和力特異性結合PD-L1的分離的單克隆抗體，特別是人單克隆抗體。還提供了編碼本發明的抗體的核酸分子，用于表達本發明的抗體的表達載體、宿主細胞和方法。還提供了包含本發明的抗體的免疫偶聯物、雙特異性分子和藥物組合物。本發明還公開了檢測PD-L1的方法，以及使用抗-PD-L1抗體治療包括癌癥和傳染病在內的各種疾病的方法。
【專利說明】抗程序性死亡配體1 (PD-L1)的人單克隆抗體
[0001] 本申請是申請日為2006年06月30日和發明名稱為"抗程序性死亡配體I(H)-Ll) 的人單克隆抗體"的200680028238. 9號發明專利申請的分案申請。
[0002] 相關申請的奪叉參考
[0003] 本申請要求2005年7月1日提交的美國臨時專利申請No. 60/696, 426的權利；該申請全文引入本文作為參考。
[0004] 發明背景
[0005] 程序性死亡I (PD-I)是CD28受體家族的成員，包括CD28、CTLA-4、ICOS、ro-1和 BTLA。該家族的最初成員CD28和ICOS通過對添加單克隆抗體后增強的T細胞增殖的功能效果而發現（Hutloff 等（1999) Nature 397 :263-266 ;Hansen 等（1980) ImmunogenicslO : 247-260)。已經鑒定了 H)-l的兩種細胞表面糖蛋白配體，PD-Ll和TO-L2,已經表明它們在與I3D-I結合后下調T細胞活化和細胞因子分泌（Freeman等（2000) J Exp Med 192: 1027-34 ;Latchman 等（2001)Nat Immunol 2:261-8 ;Carter 等（2002)Eur J Immunol 32 :634-43 ;0higashi 等（2005)Clin Cancer Res 11:2947-53)。 PD-L1(B7-H1)和 H)-L2(B7-DC)都是可與H)-l結合、但是不與其他⑶28家族成員結合的B7同源物（Blank 等（2004))。也已經顯示通過IFN-Y刺激上調細胞表面上H)-L1的表達。
[0006] PD-Ll的表達已經在幾種鼠和人類癌癥中發現，包括人肺癌、卵巢癌和結腸癌和各種骨髓瘤（Iwai 等（2002)PNAS 99 :12293-7 ;0higashi 等（2005)Clin Cancer Res 11 : 2947-53)。已經提示H)-L1通過提高抗原特異性T細胞克隆的細胞凋亡而在腫瘤免疫中起作用（Dong等（2002)Nat Med 8:793-800)。也已經提示I3D-Ll可能與腸粘膜炎癥有關，并且F1D-Ll的抑制防止了與結腸炎有關的萎縮病（wasting disease) (Kanai等（2003) J Tmmun〇1 171 :4156-63)〇
[0007] 發明概沭
[0008] 本發明提供與ro-Ll結合并且表現出許多所需特性的分離的單克隆抗體，特別是人單克隆抗體。這些特性包括與人ro-Li高親和力結合。另外，已經顯示本發明的抗體在混合淋巴細胞反應中提高T細胞增殖、IFN- Y分泌和IL-2分泌。
[0009] 在一個方面，本發明涉及一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其中該抗體表現出至少一種以下性質：
[0010] (a)以I X KT7M或更低的Kd與人PD-Ll結合；
[0011] (b)在混合淋巴細胞反應（MLR)試驗中提高T細胞增殖；
[0012] (c)在MLR試驗中提高干擾素-Y產生；
[0013] (d)在MLR試驗中提高IL-2分泌；
[0014] (e)刺激抗體應答；或
[0015] (f)逆轉T調節細胞對T細胞效應細胞和/或樹突細胞的作用。
[0016] 優選地，該抗體為人抗體，但是在替代實施方案中，該抗體也可以是，例如，鼠抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
[0017] 在特定實施方案中，該抗體以5X KT8M或更低的Kd與人ro-Ll結合，以IXKT8M 或更低的Kd與人ro-Ll結合，以5X KT9M或更低的Kd與人ro-Ll結合，以5X KT9M或更低的Kd與人PD-Ll結合，或以I X KT8M至I X KTkiM之間的Kd與人PD-Ll結合。
[0018] 在另一實施方案中，本發明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其中該抗體與參比抗體交叉競爭結合F 1D-Ll,所述參比抗體包括：
[0019] (a)包含選自SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、9和10的氨基酸序列的人重鏈可變區；和
[0020] (b)包含選自 SEQ ID NO :11、12、13、14、15、16、17、18、19 和 20 的氨基酸序列的人輕鏈可變區。
[0021] 在各種實施方案中，所述參比抗體包括：
[0022] (a)包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列的重鏈可變區；和
[0023] (b)包含SEQ ID NO : 11的氨基酸序列的輕鏈可變區。
[0024] 或所述參比抗體包括：
[0025] (a)包含SEQ ID NO :2的氨基酸序列的重鏈可變區；和
[0026] (b)包含SEQ ID NO : 12的氨基酸序列的輕鏈可變區；
[0027] 或所述參比抗體包括：
[0028] (a)包含SEQ ID NO :3的氨基酸序列的重鏈可變區；和
[0029] (b)包含SEQ ID NO : 13的氨基酸序列的輕鏈可變區；
[0030] 或所述參比抗體包括：
[0031] (a)包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列的重鏈可變區；和
[0032] (b)包含SEQ ID NO : 14的氨基酸序列的輕鏈可變區；
[0033] 或所述參比抗體包括：
[0034] (a)包含SEQ ID NO :5的氨基酸序列的重鏈可變區；和
[0035] (b)包含SEQ ID NO : 15的氨基酸序列的輕鏈可變區；
[0036] 或所述參比抗體包括：
[0037] (a)包含SEQ ID NO :6的氨基酸序列的重鏈可變區；和
[0038] (b)包含SEQ ID NO : 16的氨基酸序列的輕鏈可變區；
[0039] 或所述參比抗體包括：
[0040] (a)包含SEQ ID NO :7的氨基酸序列的重鏈可變區；和
[0041] (b)包含SEQ ID NO : 17的氨基酸序列的輕鏈可變區；
[0042] 或所述參比抗體包括：
[0043] (a)包含SEQ ID NO :8的氨基酸序列的重鏈可變區；和
[0044] (b)包含SEQ ID NO : 18的氨基酸序列的輕鏈可變區；
[0045] 或所述參比抗體包括：
[0046] (a)包含SEQ ID NO :9的氨基酸序列的重鏈可變區；和
[0047] (b)包含SEQ ID NO : 19的氨基酸序列的輕鏈可變區；
[0048] 或所述參比抗體包括：
[0049] (a)包含SEQ ID NO : 10的氨基酸序列的重鏈可變區；和
[0050] (b)包含SEQ ID NO :20的氨基酸序列的輕鏈可變區。
[0051] 在另一方面，本發明涉及一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含產自或源自人％ 1-18基因的重鏈可變區，其中該抗體與ro-Li特異性結合。本發明進一步提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含產自或源自人Vh 1-69基因的重鏈可變區，其中該抗體與ro-Li特異性結合。本發明進一步提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包含產自或源自人V h 1-3基因的重鏈可變區，其中該抗體與ro-Ll特異性結合。本發明進一步提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含產自或源自人V h 3-9基因的重鏈可變區，其中該抗體與ro-Ll特異性結合。本發明進一步提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含產自或源自人V k L6基因的輕鏈可變區，其中該抗體與H)-L1特異性結合。本發明進一步提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包含產自或源自人V k L15基因的輕鏈可變區，其中該抗體與H)-L1特異性結合。本發明甚至進一步提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包含產自或源自人V k A27基因的輕鏈可變區，其中該抗體與H)-L1特異性結合。本發明甚至進一步提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包含產自或源自人V k L18基因的輕鏈可變區，其中該抗體與I3D-Ll特異性結合。
[0052] 在一個特別優選的實施方案中，本發明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包含：
[0053] (a)人Vh 1-18基因的重鏈可變區；和
[0054] (b)人Vk L6的輕鏈可變區；
[0055] 其中該抗體與ro-Ll特異性結合。
[0056] 在另一優選的實施方案中，本發明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包含：
[0057] (a)人Vh 1-69基因的重鏈可變區；和
[0058] (b)人Vk L6的輕鏈可變區；
[0059] 其中該抗體與ro-Li特異性結合。
[0060] 在另一優選的實施方案中，本發明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包含：
[0061] (a)人Vh 1-3基因的重鏈可變區；和
[0062] (b)人Vk Ll5的輕鏈可變區；
[0063] 其中該抗體與ro-Li特異性結合。
[0064] 在另一優選的實施方案中，本發明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包含：
[0065] (a)人Vh 1-69基因的重鏈可變區；和
[0066] (b)人Vk A27的輕鏈可變區；
[0067] 其中該抗體與ro-Li特異性結合。
[0068] 在另一優選的實施方案中，本發明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包含：
[0069] (a)人Vh 3-9基因的重鏈可變區；和
[0070] (b)人Vk Ll5的輕鏈可變區；
[0071] 其中該抗體與I3D-Ll特異性結合。
[0072] 在另一優選的實施方案中，本發明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包含：
[0073] (a)人Vh 3-9基因的重鏈可變區；和
[0074] (b)人Vk L18的輕鏈可變區；
[0075] 其中該抗體與ro-Li特異性結合。
[0076] 在另一方面，本發明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包括：
[0077] 包含⑶Rl、⑶R2和⑶R3序列的重鏈可變區；和包含⑶Rl、⑶R2和⑶R3序列的輕鏈可變區，其中：
[0078] (a)重鏈可變區 CDR3 序列包含選自 SEQ ID 勵：41、42、43、44、45、46、47、48、49和 50的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；
[0079] (b)輕鏈可變區 CDR3 序列包含選自 SEQ ID 勵：71、72、73、74、75、76、77、78、79和 80的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；
[0080] (C)該抗體與人PD-Ll特異性結合。
[0081] 優選地，重鏈可變區 CDR2 序列包含選自 SEQ ID NO :31、32、33、34、35、36、37、38、 39和40的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；且輕鏈可變區CDR2序列包含選自SEQ ID NO :61、62、63、64、65、66、67、68、69和70的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列。優選地，重鏈可變區CDRl序列包含選自SEQ ID NO :21、22、23、24、25、26、27、28、29和30的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；且輕鏈可變區⑶Rl序列包含選自SEQ ID NO :51、 52、53、54、55、56、57、58、59和60的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列。
[0082] 在另一方面，本發明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：
[0083] (a)重鏈可變區包含與選自SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、9和10的氨基酸序列至少80%同源的氨基酸序列；
[0084] (b)輕鏈可變區包含與選自 SEQ ID NO :11、12、13、14、15、16、17、18、19 和 20 的氨基酸序列至少80%同源的氨基酸序列；并且
[0085] (c)該抗體以I X KT7M或更低的Kd與人PD-Ll結合。
[0086] 在一個優選實施方案中，抗體還包括至少一種以下的性質：
[0087] (a)該抗體在混合淋巴細胞反應（MLR)試驗中提高T細胞增殖；
[0088] (b)該抗體在MLR試驗中提高干擾素-Y產生；或
[0089] (c)該抗體在MLR試驗中提高IL-2分泌。
[0090] 在優選實施方案中，本發明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括：
[0091] (a)包含選自 SEQ ID NO :21、22、23、24、25、26、27、28、29和30的氨基酸序列的重鏈可變區CDRl ;
[0092] (b)包含選自 SEQ ID NO :31、32、33、34、35、36、37、38、39和40的氨基酸序列的重鏈可變區CDR2 ;
[0093] (c)包含選自 SEQ ID NO :41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的氨基酸序列的重鏈可變區CDR3 ;
[0094] (d)包含選自 SEQ ID NO :51、52、53、54、55、56、57、58、59和60的氨基酸序列的輕鏈可變區CDRl ;
[0095] (e)包含選自 SEQ ID NO :61、62、63、64、65、66、67、68、69和70的氨基酸序列的輕鏈可變區CDR2 ;和
[0096] (f)包含選自 SEQ ID NO :71、72、73、74、75、76、77、78、79和80的氨基酸序列的輕鏈可變區CDR3 ;
[0097] 其中該抗體特異性結合ro-Ll。
[0098] 一種優選的組合包括：
[0099] (a)包含SEQ ID NO :21的重鏈可變區CDRl ;
[0100] (b)包含SEQ ID NO :31的重鏈可變區CDR2 ;
[0101] (c)包含SEQ ID NO :41的重鏈可變區CDR3 ;
[0102] (d)包含SEQ ID NO :51的輕鏈可變區CDRl ;
[0103] (e)包含SEQ ID NO :61的輕鏈可變區CDR2 ;和
[0104] (f)包含SEQ ID NO :71的輕鏈可變區CDR3。
[0105] 另一種優選的組合包括：
[0106] (a)包含SEQ ID NO :22的重鏈可變區CDRl ;
[0107] (b)包含SEQ ID NO :32的重鏈可變區CDR2 ;
[0108] (c)包含SEQ ID NO :42的重鏈可變區CDR3 ;
[0109] (d)包含SEQ ID NO :52的輕鏈可變區CDRl ;
[0110] (e)包含SEQ ID NO :62的輕鏈可變區CDR2 ;和
[0111] (f)包含SEQ ID NO :72的輕鏈可變區CDR3。
[0112] 另一種優選的組合包括：
[0113] (a)包含SEQ ID NO :23的重鏈可變區CDRl ;
[0114] (b)包含SEQ ID NO :33的重鏈可變區CDR2 ;
[0115] (c)包含SEQ ID NO :43的重鏈可變區CDR3 ;
[0116] (d)包含SEQ ID NO :53的輕鏈可變區CDRl ;
[0117] (e)包含SEQ ID NO :63的輕鏈可變區CDR2 ;和
[0118] (f)包含SEQ ID NO :73的輕鏈可變區CDR3。
[0119] 另一種優選的組合包括：
[0120] (a)包含SEQ ID NO :24的重鏈可變區CDRl ;
[0121] (b)包含SEQ ID NO :34的重鏈可變區CDR2 ;
[0122] (c)包含SEQ ID NO :44的重鏈可變區CDR3 ;
[0123] (d)包含SEQ ID NO :54的輕鏈可變區CDRl ;
[0124] (e)包含SEQ ID NO :64的輕鏈可變區CDR2 ;和
[0125] (f)包含SEQ ID NO :74的輕鏈可變區CDR3。
[0126] 另一種優選的組合包括：
[0127] (a)包含SEQ ID NO :25的重鏈可變區CDRl ;
[0128] (b)包含SEQ ID NO :35的重鏈可變區CDR2 ;
[0129] (c)包含SEQ ID NO :45的重鏈可變區CDR3 ;
[0130] (d)包含SEQ ID NO :55的輕鏈可變區CDRl ;
[0131] (e)包含SEQ ID NO :65的輕鏈可變區CDR2 ;和
[0132] (f)包含SEQ ID NO :75的輕鏈可變區CDR3。
[0133] 另一種優選的組合包括：
[0134] (a)包含SEQ ID NO :26的重鏈可變區CDRl ;
[0135] (b)包含SEQ ID NO :36的重鏈可變區CDR2 ;
[0136] (c)包含SEQ ID NO :46的重鏈可變區CDR3 ;
[0137] (d)包含SEQ ID NO :56的輕鏈可變區CDRl ;
[0138] (e)包含SEQ ID NO :66的輕鏈可變區CDR2 ;和
[0139] (f)包含SEQ ID NO :76的輕鏈可變區CDR3。
[0140] 另一種優選的組合包括：
[0141] (a)包含SEQ ID NO :27的重鏈可變區CDRl ;
[0142] (b)包含SEQ ID NO :37的重鏈可變區CDR2 ;
[0143] (c)包含SEQ ID NO :47的重鏈可變區CDR3 ;
[0144] (d)包含SEQ ID NO :57的輕鏈可變區CDRl ;
[0145] (e)包含SEQ ID NO :67的輕鏈可變區CDR2 ;和
[0146] (f)包含SEQ ID NO :77的輕鏈可變區CDR3。
[0147] 另一種優選的組合包括：
[0148] (a)包含SEQ ID NO :28的重鏈可變區CDRl ;
[0149] (b)包含SEQ ID NO :38的重鏈可變區CDR2 ;
[0150] (c)包含SEQ ID NO :48的重鏈可變區CDR3 ;
[0151] (d)包含SEQ ID NO :58的輕鏈可變區CDRl ;
[0152] (e)包含SEQ ID NO :68的輕鏈可變區CDR2 ;和
[0153] (f)包含SEQ ID NO :78的輕鏈可變區CDR3。
[0154] 另一種優選的組合包括：
[0155] (a)包含SEQ ID NO :29的重鏈可變區CDRl ;
[0156] (b)包含SEQ ID NO :39的重鏈可變區CDR2 ;
[0157] (c)包含SEQ ID NO :49的重鏈可變區CDR3 ;
[0158] (d)包含SEQ ID NO :59的輕鏈可變區CDRl ;
[0159] (e)包含SEQ ID NO :69的輕鏈可變區CDR2 ;和
[0160] (f)包含SEQ ID NO :79的輕鏈可變區CDR3。
[0161] 另一種優選的組合包括：
[0162] (a)包含SEQ ID NO :30的重鏈可變區CDRl ;
[0163] (b)包含SEQ ID NO :40的重鏈可變區CDR2 ;
[0164] (c)包含SEQ ID NO :50的重鏈可變區CDR3 ;
[0165] (d)包含SEQ ID NO :60的輕鏈可變區CDRl ;
[0166] (e)包含SEQ ID NO :70的輕鏈可變區CDR2 ;和
[0167] (f)包含SEQ ID NO :80的輕鏈可變區CDR3。
[0168] 其他本發明優選的抗體或其抗原結合部分包括：
[0169] (a)包含選自SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的氨基酸序列的重鏈可變區；和
[0170] (b)包含選自 SEQ ID NO :11、12、13、14、15、16、17、18、19 和 20 的氨基酸序列的輕鏈可變區；
[0171] 其中該抗體與ro-Li特異性結合。
[0172] -種優選的組合包括：
[0173] (a)包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列的重鏈可變區；和
[0174] (b)包含SEQ ID NO : 11的氨基酸序列的輕鏈可變區。
[0175] 另一種優選的組合包括：
[0176] (a)包含SEQ ID NO :2的氨基酸序列的重鏈可變區；和
[0177] (b)包含SEQ ID NO : 12的氨基酸序列的輕鏈可變區。
[0178] 另一種優選的組合包括：
[0179] (a)包含SEQ ID NO :3的氨基酸序列的重鏈可變區；和
[0180] (b)包含SEQ ID NO : 13的氨基酸序列的輕鏈可變區。
[0181] 另一種優選的組合包括：
[0182] (a)包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列的重鏈可變區；和
[0183] (b)包含SEQ ID NO : 14的氨基酸序列的輕鏈可變區。
[0184] 另一種優選的組合包括：
[0185] (a)包含SEQ ID NO :5的氨基酸序列的重鏈可變區；和
[0186] (b)包含SEQ ID NO : 15的氨基酸序列的輕鏈可變區。
[0187] 另一種優選的組合包括：
[0188] (a)包含SEQ ID NO :6的氨基酸序列的重鏈可變區；和
[0189] (b)包含SEQ ID NO : 16的氨基酸序列的輕鏈可變區。
[0190] 另一種優選的組合包括：
[0191] (a)包含SEQ ID NO :7的氨基酸序列的重鏈可變區；和
[0192] (b)包含SEQ ID NO : 17的氨基酸序列的輕鏈可變區。
[0193] 另一種優選的組合包括：
[0194] (a)包含SEQ ID NO :8的氨基酸序列的重鏈可變區；和
[0195] (b)包含SEQ ID NO : 18的氨基酸序列的輕鏈可變區。
[0196] 另一種優選的組合包括：
[0197] (a)包含SEQ ID NO :9的氨基酸序列的重鏈可變區；和
[0198] (b)包含SEQ ID NO : 19的氨基酸序列的輕鏈可變區。
[0199] 另一種優選的組合包括：
[0200] (a)包含SEQ ID NO : 10的氨基酸序列的重鏈可變區；和
[0201] (b)包含SEQ ID NO :20的氨基酸序列的輕鏈可變區。
[0202] 在本發明的另一方面，提供了與上述任意抗體競爭結合ro-Ll的抗體或其抗原結合部分。
[0203] 本發明的抗體可以是，例如，如IgGl或IgG4同種型的全長抗體。或者，這些抗體可以是抗體片段，如Fab或Fab' 2片段，或單鏈抗體。
[0204] 本發明也提供一種免疫偶聯物，其包含與諸如細胞毒素或放射性同位素等治療劑連接的本發明的抗體或其抗原結合部分。本發明也提供一種雙特異性分子，其包含與第二功能部分連接的本發明的抗體或其抗原結合部分，該第二功能部分具有與該抗體或其抗原結合部分不同的結合特異性。
[0205] 還提供包含本發明的抗體或其抗原結合部分或免疫偶聯物或雙特異性分子和藥學上可接受的載體的組合物。
[0206] 本發明也包括編碼本發明的抗體或其抗原結合部分的核酸分子，以及包含這些核酸的表達載體，和包含這些表達載體的宿主細胞。而且，本發明提供一種含有人免疫球蛋白重鏈和輕鏈轉基因的轉基因小鼠，其中該小鼠表達本發明的抗體，以及由這種小鼠制備的雜交瘤，其中該雜交瘤產生本發明的抗體。
[0207] 在另一方面，本發明提供一種調節受試者中的免疫應答的方法，包括給該受試者施用本發明的抗體或其抗原結合部分，使得受試者中的免疫應答得到調節。優選地，本發明的抗體增強、刺激或提高受試者中的免疫應答。
[0208] 在另一方面，本發明提供一種抑制受試者中的腫瘤細胞生長的方法，包括給該受試者施用治療有效量的抗-PD-Ll抗體或其抗原結合部分。本發明的抗體優選地用于該方法中，盡管也可以使用其他抗-PD-Ll抗體代替（或者與本發明的抗-PD-Ll抗體組合）。例如，在抑制腫瘤生長的方法中可以使用嵌合、人源化或完全人類抗-PD-Ll抗體。
[0209] 在另一方面，本發明提供一種治療受試者中的傳染病的方法，包括給該受試者施用治療有效量的抗-PD-Ll抗體或其抗原結合部分，使得所述受試者的傳染病得到治療。本發明的抗體優選地用于該方法中，盡管也可以使用其他抗-PD-Ll抗體代替（或者與本發明的抗-PD-Ll抗體組合）。例如，在治療傳染病的方法中可以使用嵌合、人源化或完全人類抗-PD-Ll抗體。
[0210] 另外，本發明提供一種增強受試者中對抗原的免疫應答的方法，包括給該受試者施用：（i)抗原；和（ii)抗-PD-Ll抗體或其抗原結合部分，使得所述受試者中對抗原的免疫應答得到加強。所述抗原可以是，例如，腫瘤抗原、病毒抗原、細菌抗原或來自病原體的抗原。本發明的抗體優選地用于該方法中，盡管也可以使用其他抗-PD-Ll抗體代替（或者與本發明的抗-PD-Ll抗體組合）。例如，在增強受試者中對抗原的免疫應答的方法中可以使用嵌合、人源化或完全人類抗-PD-Ll抗體。
[0211] 本發明也提供基于本文提供的抗-PD-Ll抗體的序列制備"第二代"抗-PD-Ll抗體的方法。例如，本發明提供一種制備抗-PD-Ll抗體的方法，包括：
[0212] (a)提供：（i)重鏈可變區抗體序列，其包含選自SEQ ID NO :21、22、23、24、25、26、 27、28、29 和 30 的 CDRl 序列、選自 SEQ ID NO :31、32、33、34、35、36、37、38、39和40的〇?2 序列、和選自3￡010勵：41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的〇?3序列；或（^)輕鏈可變區抗體序列，其包含選自SEQ ID勵：51、52、53、54、55、56、57、58、59和60的〇)1?1序列、選自5￡010勵：61、62、63、64、65、66、67、68、69和70的〇)1?2序列、和選自5￡010勵：71、 72、73、74、75、76、77、78、79 和 80 的 CDR3 序列；
[0213] (b)改變至少一種可變區抗體序列內的至少一個氨基酸殘基，所述序列選自重鏈可變區抗體序列和輕鏈可變區抗體序列，從而產生至少一個改變的抗體序列；和
[0214] (C)將該改變的抗體序列表達為蛋白質。
[0215] 特別地，本發明涉及以下各項：
[0216] 1. 一種分離的人單克隆抗體或其抗原結合部分，其中該抗體特異性結合人 ro-Li，并且其中該抗體表現出至少一種以下性質：
[0217] (a)以I X KT7M或更低的Kd與人PD-Ll結合；
[0218] (b)在混合淋巴細胞反應（MLR)試驗中提高T細胞增殖；
[0219] (c)在MLR試驗中提高干擾素1產生；或
[0220] (d)在MLR試驗中提高白介素-2 (IL-2)分泌。
[0221] 2.如第1項的抗體，其為IgGl、IgG2或IgG4同種型的全長抗體。
[0222] 3.如第1項的抗體，其為抗體片段或單鏈抗體。
[0223] 4.如第1項的抗體，其中所述抗體以5X KT9M或更低的Kd與人PD-Ll結合。
[0224] 5.如第1項的抗體，其中所述抗體以2X KT9M或更低的Kd與人PD-Ll結合。
[0225] 6. -種分離的人單克隆抗體或其抗原結合部分，其中該抗體與參比抗體交叉競爭結合F1D-Ll,所述參比抗體包括：
[0226] (a)包含選自SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、9和10的氨基酸序列的人重鏈可變區；和
[0227] (b)包含選自 SEQ ID NO :11、12、13、14、15、16、17、18、19 和 20 的氨基酸序列的人輕鏈可變區。
[0228] 7.如第6項的抗體，其中所述人重鏈可變區包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列，人輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列。
[0229] 8.如第6項的抗體，其中所述人重鏈可變區包含SEQ ID NO :2的氨基酸序列，人輕鏈可變區包含SEQ ID NO : 12的氨基酸序列。
[0230] 9.如第6項的抗體，其中所述人重鏈可變區包含SEQ ID NO :3的氨基酸序列，人輕鏈可變區包含SEQ ID NO : 13的氨基酸序列。
[0231] 10. -種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括產自或源自AVh 1-18基因的重鏈可變區，其中該抗體與ro-Li特異性結合。
[0232] 11. -種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括產自或源自AVh 1-69基因的重鏈可變區，其中該抗體與I3D-Ll特異性結合。
[0233] 12. -種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括產自或源自AVh 1-3基因的重鏈可變區，其中該抗體與I3D-Ll特異性結合。
[0234] 13. -種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括產自或源自人Vk L6基因的輕鏈可變區，其中該抗體與I3D-Ll特異性結合。
[0235] 14. -種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括產自或源自AVk L15基因的輕鏈可變區，其中該抗體與I3D-Ll特異性結合。
[0236] 15. -種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括：
[0237] (a)人Vh 1-18基因的重鏈可變區；和
[0238] (b)人Vk L6的輕鏈可變區；
[0239] 其中該抗體與I3D-Ll特異性結合。
[0240] 16. -種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括：
[0241] (a)人Vh 1-69基因的重鏈可變區；和
[0242] (b)人Vk L6的輕鏈可變區；
[0243] 其中該抗體與H)-L1特異性結合。
[0244] 17. -種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括：
[0245] (a)人Vh 1-3基因的重鏈可變區；和
[0246] (b)人Vk Ll5的輕鏈可變區；
[0247] 其中該抗體與I3D-Ll特異性結合。
[0248] 18. -種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括包含⑶R1XDR2和⑶R3序列的重鏈可變區；和包含⑶RU⑶R2和⑶R3序列的輕鏈可變區；其中：
[0249] (a)重鏈可變區 CDR3 序列包含選自 SEQ ID 勵：41、42、43、44、45、46、47、48、49和 50的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；
[0250] (b)輕鏈可變區 CDR3 序列包含選自 SEQ ID 勵：71、72、73、74、75、76、77、78、79和 80的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；
[0251] (c)該抗體與人PD-Ll特異性結合。
[0252] 19.如第18項的抗體，其中重鏈可變區CDR2序列包含選自SEQ ID NO :31、32、33、 34、35、36、37、38、39和40的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；且輕鏈可變區⑶R2 序列包含選自SEQ ID NO :61、62、63、64、65、66、67、68、69和70的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列。
[0253] 20.如第19項的抗體，其中重鏈可變區CDRl序列包含選自SEQ ID NO :21、22、23、 24、25、26、27、28、29和30的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；且輕鏈可變區⑶Rl 序列包含選自SEQ ID NO :51、52、53、54、55、56、57、58、59和60的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列。
[0254] 21. -種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：
[0255] (a)重鏈可變區包含與選自SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的氨基酸序列至少80%同源的氨基酸序列；
[0256] (b)輕鏈可變區包含與選自 SEQ ID NO :11、12、13、14、15、16、17、18、19 和 20 的氨基酸序列至少80%同源的氨基酸序列；并且
[0257] 該抗體以I X KT7M或更低的Kd與人PD-Ll結合。
[0258] 22.如第21項的抗體，其中該抗體進一步包括一種或多種選自以下的性質：
[0259] (a)該抗體在混合淋巴細胞反應（MLR)試驗中提高T細胞增殖；
[0260] (b)該抗體在MLR試驗中提高干擾素1產生；和
[0261] (c)該抗體在MLR試驗中提高IL-2分泌。
[0262] 23. -種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括：
[0263] (a)包含選自 SEQ ID NO :21、22、23、24、25、26、27、28、29和30的氨基酸序列的重鏈可變區CDRl ;
[0264] (b)包含選自 SEQ ID NO :31、32、33、34、35、36、37、38、39和40的氨基酸序列的重鏈可變區CDR2 ;
[0265] (c)包含選自 SEQ ID NO :41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的氨基酸序列的重鏈可變區CDR3 ;
[0266] (d)包含選自 SEQ ID NO :51、52、53、54、55、56、57、58、59和60的氨基酸序列的輕鏈可變區CDRl ;
[0267] (e)包含選自 SEQ ID NO :61、62、63、64、65、66、67、68、69和70的氨基酸序列的輕鏈可變區CDR2 ;和
[0268] (f)包含選自 SEQ ID NO :71、72、73、74、75、76、77、78、79和80的氨基酸序列的輕鏈可變區CDR3 ;
[0269] 其中該抗體與I3D-Ll特異性結合。
[0270] 24.如第23項的抗體，其包括：
[0271] (a)包含SEQ ID NO :21的重鏈可變區CDRl ;
[0272] (b)包含SEQ ID NO :31的重鏈可變區CDR2 ;
[0273] (c)包含SEQ ID NO :41的重鏈可變區CDR3 ;
[0274] (d)包含SEQ ID NO :51的輕鏈可變區CDRl ;
[0275] (e)包含SEQ ID NO :61的輕鏈可變區CDR2 ;和
[0276] (f)包含SEQ ID NO :71的輕鏈可變區CDR3。
[0277] 25.如第23項的抗體，其包括：
[0278] (a)包含SEQ ID NO :22的重鏈可變區CDRl ;
[0279] (b)包含SEQ ID NO :32的重鏈可變區CDR2 ;
[0280] (c)包含SEQ ID NO :42的重鏈可變區CDR3 ;
[0281] (d)包含SEQ ID NO :52的輕鏈可變區CDRl ;
[0282] (e)包含SEQ ID NO :62的輕鏈可變區CDR2 ;和
[0283] (f)包含SEQ ID NO :72的輕鏈可變區CDR3。
[0284] 26.如第23項的抗體，其包括：
[0285] (a)包含SEQ ID NO :23的重鏈可變區CDRl ;
[0286] (b)包含SEQ ID NO :33的重鏈可變區CDR2 ;
[0287] (c)包含SEQ ID NO :43的重鏈可變區CDR3 ;
[0288] (d)包含SEQ ID NO :53的輕鏈可變區CDRl ;
[0289] (e)包含SEQ ID NO :63的輕鏈可變區CDR2 ;和
[0290] (f)包含SEQ ID NO :73的輕鏈可變區CDR3。
[0291] 27. -種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括：
[0292] (a)包含選自SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的氨基酸序列的重鏈可變區；和
[0293] (b)包含選自 SEQ ID NO :11、12、13、14、15、16、17、18、19 和 20 的氨基酸序列的輕鏈可變區；
[0294] 其中該抗體與I3D-Ll特異性結合。
[0295] 28.如第27項的抗體，其包括：
[0296] (a)包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列的重鏈可變區；和
[0297] (b)包含SEQ ID NO : 11的氨基酸序列的輕鏈可變區。
[0298] 29.如第27項的抗體，其包括：
[0299] (a)包含SEQ ID NO :2的氨基酸序列的重鏈可變區；和
[0300] (b)包含SEQ ID NO : 12的氨基酸序列的輕鏈可變區。
[0301] 30.如第27項的抗體，其包括：
[0302] (a)包含SEQ ID NO :3的氨基酸序列的重鏈可變區；和
[0303] (b)包含SEQ ID NO : 13的氨基酸序列的輕鏈可變區。
[0304] 31. -種組合物，其含有如第1-30任一項的抗體或其抗原結合部分，和藥學上可接受的載體。
[0305] 32. -種免疫偶聯物，其包含與治療劑連接的如第1-30任一項的抗體或其抗原結合部分。
[0306] 33. -種組合物，其含有如第32項的免疫偶聯物和藥學上可接受的載體。
[0307] 34.如第32項的免疫偶聯物，其中所述治療劑是細胞毒素。
[0308] 35. -種組合物，其含有如第34項的免疫偶聯物和藥學上可接受的載體。
[0309] 36.如第32項的免疫偶聯物，其中所述治療劑是放射性同位素。
[0310] 37. -種組合物，其含有如第34項的免疫偶聯物和藥學上可接受的載體。
[0311] 38. -種雙特異性分子，其包含與第二功能部分連接的如第1-30任一項的抗體或其抗原結合部分，該第二功能部分具有與該抗體或其抗原結合部分不同的結合特異性。
[0312] 39. -種組合物，其含有如第38項的雙特異性分子和藥學上可接受的載體。
[0313] 40. -種分離的核酸分子，其編碼如第1-30任一項的抗體或其抗原結合部分。
[0314] 41. 一種表達載體，其包含第40項的核酸分子。
[0315] 42. -種宿主細胞，其包含第41項的表達載體。
[0316] 43. -種含有人免疫球蛋白重鏈和輕鏈轉基因的轉基因小鼠，其中該小鼠表達如第1-30任一項的抗體。
[0317] 44.由第43項的小鼠制備的雜交瘤，其中該雜交瘤產生所述抗體。
[0318] 45. -種調節受試者中的免疫應答的方法，包括給該受試者施用如第1-30任一項的抗體或其抗原結合部分，使得受試者中的免疫應答得到調節。
[0319] 46. -種抑制受試者中的腫瘤細胞生長的方法，包括給該受試者施用治療有效量的抗-PD-Ll抗體或其抗原結合部分。
[0320] 47.如第46項的方法，其中所述抗體是嵌合抗體。
[0321] 48.如第46項的方法，其中所述抗體是人源化抗體。
[0322] 49.如第46項的方法，其中所述抗體是完全人類抗體。
[0323] 50.如第46項的方法，其中所述腫瘤細胞是選自黑素瘤、腎癌、前列腺癌、乳腺癌、結腸癌和肺癌的癌的腫瘤細胞。
[0324] 51.如第46項的方法，其中所述腫瘤細胞是選自以下癌的腫瘤細胞：骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚或眼內惡性黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛區癌、胃癌、睪丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、陰戶癌、何杰金病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、慢性或急性白血病，包括急性髓細胞樣白血病、慢性髓細胞樣白血病、急性成淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、兒童實體瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統（CNS)腫瘤、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管發生、脊柱腫瘤、腦干神經膠質瘤、垂體腺瘤、卡波西肉瘤、表皮狀癌、鱗狀細胞癌、T細胞淋巴瘤、環境誘發的癌癥，包括石棉誘發的癌癥，以及所述癌癥的組合。
[0325] 52. -種抑制受試者中的腫瘤細胞生長的方法，包括給該受試者施用有效抑制腫瘤生長的量的如第1-30任一項的抗體或其抗原結合部分。
[0326] 53. -種治療受試者中的傳染病的方法，包括給該受試者施用如第1-30任一項的抗體或其抗原結合部分，使得所述受試者的傳染病得到治療。
[0327] 54.如第53項的方法，其中所述傳染病選自：HIV，流行性感冒，皰疹，賈第蟲，瘧疾，利什曼原蟲，以下病毒引起的病原體感染：肝炎病毒（甲、乙、丙）、皰疹病毒（例如VZV、 HSV-I、HAV-6、HSV-II和CMV、EB病毒）、腺病毒、流感病毒、蟲媒病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯薩奇病毒、冠狀病毒、呼吸道合胞病毒、流行性腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、風疹病毒、細小病毒、痘苗病毒、HTLV病毒、登革熱病毒、乳頭瘤病毒、軟疣病毒、脊髓灰質炎病毒、狂犬病毒、JC病毒和蟲媒病毒腦炎病毒，以下細菌引起的病原體感染：衣原體、立克次氏體菌、分枝桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌、腦膜炎球菌和淋球菌、克雷伯氏桿菌、變形菌、雷氏菌、假單胞菌、軍團桿菌、白喉菌、沙門氏菌、芽孢桿菌、霍亂菌、破傷風菌、肉毒桿菌、炭疽桿菌、鼠疫桿菌、鉤端螺旋體、和萊姆病細菌，以下真菌引起的病原體感染：假絲酵母（白假絲酵母、克魯斯假絲酵母、光滑假絲酵母、熱帶假絲酵母等）、新型隱球菌、曲霉（煙曲霉、黑曲霉等）、毛霉屬（毛霉、犁頭霉、根霉）、申克孢子絲菌、皮炎芽生菌、巴西副球孢子菌、粗球孢子菌和夾膜組織胞漿菌，和以下寄生蟲引起的病原體感染：溶組織內阿米巴、結腸小袋纖毛蟲、福氏耐格里阿米巴、棘阿米巴屬的種、蘭伯賈第蟲、隱孢子蟲屬的種、卡氏肺囊蟲、間日瘧原蟲、果氏巴貝蟲、布氏錐蟲、克氏錐蟲、杜氏利什曼原蟲、鼠弓形體、巴西日圓線蟲。
[0328] 55. -種增強受試者中對抗原的免疫應答的方法，包括給該受試者施用：（i)抗原；和（ii)如第1-30任一項的抗體或其抗原結合部分，使得所述受試者中對抗原的免疫應答得到加強。
[0329] 56.如第55項的方法，其中所述抗原是腫瘤抗原、病毒抗原、細菌抗原或來自病原體的抗原。
[0330] 57. -種治療或預防受試者中的炎性疾病的方法，包括給該受試者施用如第1-30 任一項的抗體或其抗原結合部分，使得所述受試者的炎性疾病得到治療。
[0331] 58.如第57項的方法，其中所述炎性疾病是扁平苔蘚（LP)。
[0332] 59. -種制備抗-PD-Ll抗體的方法，包括：
[0333] (a)提供：⑴重鏈可變區抗體序列，其包含選自SEQ ID NO :21、22、23、24、25、26、 27、28、29 和 30 的 CDRl 序列、選自 SEQ ID NO :31、32、33、34、35、36、37、38、39和40的〇?2 序列、和選自3￡010勵：41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的〇?3序列；或（^)輕鏈可變區抗體序列，其包含選自SEQ ID勵：51、52、53、54、55、56、57、58、59和60的〇)1?1序列、選自5￡010勵：61、62、63、64、65、66、67、68、69和70的〇)1?2序列、和選自5￡010勵：71、 72、73、74、75、76、77、78、79 和 80 的 CDR3 序列；
[0334] (b)改變至少一種可變區抗體序列內的至少一個氨基酸殘基，所述可變區抗體序列選自重鏈可變區抗體序列和輕鏈可變區抗體序列，從而產生至少一個改變的抗體序列；和
[0335] (C)將該改變的抗體序列表達為蛋白質。
[0336] 60.抗I3D-Ll抗體或其抗原結合部分應用于抑制腫瘤細胞生長的方法。
[0337] 61.抗I3D-Ll抗體或其抗原結合部分在制備抑制腫瘤細胞生長的藥物中的用途。
[0338] 62.如第1-30任一項的抗體或其抗原結合部分應用于抑制腫瘤細胞生長的方法。
[0339] 63.如第1-30任一項的抗體或其抗原結合部分在制備抑制腫瘤細胞生長的藥物中的用途。
[0340] 64.如第1-30任一項的抗體或其抗原結合部分應用于治療傳染病的方法。
[0341] 65.如第1-30任一項的抗體或其抗原結合部分在制備治療傳染病的藥物中的用途。
[0342] 66.如第1-30任一項的抗體或其抗原結合部分應用于治療炎性疾病的方法。
[0343] 67.如第1-30任一項的抗體或其抗原結合部分在制備治療炎性疾病的藥物中的用途。
[0344] 本發明的其他特征和優點通過下面的詳述和實施例將是顯而易見的，該詳述和實施例不應理解為限制性的。貫穿本申請中引用的所有參考文獻、Genbank項、專利和公布的專利申請的內容均在此處特別引入作為參考。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0345] 圖IA顯示3G10人單克隆抗體重鏈可變區的核苷酸序列（SEQ ID NO :81)和氨基酸序列（SEQ ID N0:1)。勾畫出了 CDR1(SEQ ID N0:21)、CDR2(SEQ ID N0:31)和 CDR3(SEQ ID NO :41)區，并指出了 V、D和J的種系來源。
[0346] 圖IB顯示3G10人單克隆抗體輕鏈可變區的核苷酸序列（SEQ ID NO :91)和氨基酸序列（SEQ ID N0:11)。勾畫出了 CDR1(SEQ ID N0:51)、CDR2(SEQ ID N0:61)和 CDR3(SEQ ID NO :71)區，并指出了 V和J的種系來源。
[0347] 圖2A顯示12A4人單克隆抗體重鏈可變區的核苷酸序列（SEQ ID NO :82)和氨基酸序列（SEQ ID N0:2)。勾畫出了 CDR1(SEQ ID N0:22)、CDR2(SEQ ID N0:32)和 CDR3(SEQ ID NO :42)區，并指出了 V和J的種系來源。
[0348] 圖2B顯示12A4人單克隆抗體輕鏈可變區的核苷酸序列（SEQ ID NO :92)和氨基酸序列（SEQ ID N0:12)。勾畫出了 CDR1(SEQ ID N0:52)、CDR2(SEQ ID N0:62)和 CDR3(SEQ ID NO :72)區，并指出了 V和J的種系來源。
[0349] 圖3A顯示10A5人單克隆抗體重鏈可變區的核苷酸序列（SEQ ID NO :83)和氨基酸序列（SEQ ID N0:3)。勾畫出了 CDR1(SEQ ID N0:23)、CDR2(SEQ ID N0:33)和 CDR3(SEQ ID NO :43)區，并指出了 V和J的種系來源。
[0350] 圖3B顯示10A5人單克隆抗體輕鏈可變區的核苷酸序列（SEQ ID NO :93)和氨基酸序列（SEQ ID N0:13)。勾畫出了 CDR1(SEQ ID N0:53)、CDR2(SEQ ID N0:63)和 CDR3(SEQ ID NO :73)區，并指出了 V和J的種系來源。
[0351] 圖4A顯示5F8人單克隆抗體重鏈可變區的核苷酸序列（SEQ ID NO :84)和氨基酸序列（SEQ ID N0:4)。勾畫出了 CDR1(SEQ ID N0:24)、CDR2(SEQ ID N0:34)和 CDR3(SEQ ID NO :44)區，并指出了 V和J的種系來源。
[0352] 圖4B顯示5F8人單克隆抗體輕鏈可變區的核苷酸序列（SEQ ID NO :94)和氨基酸序列（SEQ ID N0:14)。勾畫出了 CDR1(SEQ ID N0:54)、CDR2(SEQ ID N0:64)和 CDR3(SEQ ID NO :74)區，并指出了 V和J的種系來源。
[0353] 圖5A顯示10H10人單克隆抗體重鏈可變區的核苷酸序列（SEQ ID NO :85)和氨基酸序列（SEQ ID N0:5)。勾畫出了 CDR1(SEQ ID N0:25)、CDR2(SEQ ID 勵：35和〇?3(5￡0 ID NO :45)區，并指出了 V和J的種系來源。
[0354] 圖5B顯示10H10人單克隆抗體輕鏈可變區的核苷酸序列（SEQ ID NO :95)和氨基酸序列（5￡0 10勵：15)。勾畫出了001?1(5￡0 10勵：55)、〇)1?2(5￡0 10勵：65)和〇)1?3(5￡0 ID NO :75)區，并指出了 V和J的種系來源。
[0355] 圖6A顯示1B12人單克隆抗體重鏈可變區的核苷酸序列（SEQ ID NO :86)和氨基酸序列（SEQ ID N0:6)。勾畫出了 CDR1(SEQ ID N0:26)、CDR2(SEQ ID N0:36)和 CDR3(SEQ ID NO :46)區，并指出了 V和J的種系來源。
[0356] 圖6B顯示1B12人單克隆抗體輕鏈可變區的核苷酸序列（SEQ ID NO :96)和氨基酸序列（SEQ ID N0:16)。勾畫出了 CDR1(SEQ ID N0:56)、CDR2(SEQ ID N0:66)和 CDR3(SEQ ID NO :76)區，并指出了 V和J的種系來源。
[0357] 圖7A顯示7H1人單克隆抗體重鏈可變區的核苷酸序列（SEQ ID NO :87)和氨基酸序列（SEQ ID N0:7)。勾畫出了 CDR1(SEQ ID N0:27)、CDR2(SEQ ID N0:37)和 CDR3(SEQ ID NO :47)區，并指出了 V和J的種系來源。
[0358] 圖7B顯示7H1人單克隆抗體輕鏈可變區的核苷酸序列（SEQ ID NO :97)和氨基酸序列（SEQ ID N0:17)。勾畫出了 CDR1(SEQ ID N0:57)、CDR2(SEQ ID N0:67)和 CDR3(SEQ ID NO :77)區，并指出了 V和J的種系來源。
[0359] 圖8A顯示11E6人單克隆抗體重鏈可變區的核苷酸序列（SEQ ID NO :88)和氨基酸序列（SEQ ID N0:8)。勾畫出了 CDR1(SEQ ID N0:28)、CDR2(SEQ ID N0:38)和 CDR3(SEQ ID NO :48)區，并指出了 V和J的種系來源。
[0360] 圖8B顯示11E6人單克隆抗體輕鏈可變區的核苷酸序列（SEQ ID NO :98)和氨基酸序列（SEQ ID N0:18)。勾畫出了 CDR1(SEQ ID N0:58)、CDR2(SEQ ID N0:68)和 CDR3(SEQ ID NO :78)區，并指出了 V和J的種系來源。
[0361] 圖9A顯示12B7人單克隆抗體重鏈可變區的核苷酸序列（SEQ ID NO :89)和氨基酸序列（SEQ ID N0:9)。勾畫出了 CDR1(SEQ ID N0:29)、CDR2(SEQ ID N0:39)和 CDR3(SEQ ID NO :49)區，并指出了 V和J的種系來源。
[0362] 圖9B顯示12B7人單克隆抗體輕鏈可變區的核苷酸序列（SEQ ID NO :99)和氨基酸序列（SEQ ID N0:19)。勾畫出了 CDR1(SEQ ID N0:59)、CDR2(SEQ ID N0:69)和 CDR3(SEQ ID NO :79)區，并指出了 V和J的種系來源。
[0363] 圖10A顯示13G4人單克隆抗體重鏈可變區的核苷酸序列（SEQ ID NO :90)和氨基酸序列（5￡0 10勵：10)。勾畫出了001?1(5￡0 10勵：30)、〇)1?2(5￡0 10勵：40)和〇)1?3(5￡0 ID NO :50)區，并指出了 V和J的種系來源。
[0364] 圖10B顯示13G4人單克隆抗體輕鏈可變區的核苷酸序列（SEQ ID NO : 100)和氨基酸序列（SEQ ID N0:20)。勾畫出了 CDR1(SEQ ID N0:60)、CDR2(SEQ ID N0:70)和 CDR3(SEQ ID NO :80)區，并指出了 V和J的種系來源。
[0365] 圖11顯示13G10的重鏈可變區氨基酸序列（SEQ ID NO :1)與人種系Vh 1-18氨基酸序列（SEQ ID N0:101)的比對。
[0366] 圖12顯示12A4的重鏈可變區氨基酸序列（SEQ ID NO :2)與人種系Vh 1-69氨基酸序列（SEQ ID N0:102)的比對。JH6b種系序列公開為SEQ ID N0:110。
[0367] 圖13顯示10A5的重鏈可變區氨基酸序列（SEQ ID NO :3)與人種系Vh 1-3氨基酸序列（SEQ ID N0:103)的比對。JH4b種系序列公開為SEQ ID N0:111。
[0368] 圖14顯示5F8的重鏈可變區氨基酸序列（SEQ ID NO :4)與人種系Vh 1-69氨基酸序列（SEQ ID N0:102)的比對。JH4b種系序列公開為SEQ ID N0:111。
[0369] 圖15顯示10H10的重鏈可變區氨基酸序列（SEQ ID NO :5)與人種系Vh 3-9氨基酸序列（SEQ ID N0:104)的比對。JH4b種系序列公開為SEQ ID N0:111。
[0370] 圖16顯示1B12的重鏈可變區氨基酸序列（SEQ ID NO :6)與人種系Vh 1-69氨基酸序列（SEQ ID N0:102)的比對。JH6b種系序列公開為SEQ ID N0:110。
[0371] 圖17顯示7H1的重鏈可變區氨基酸序列（SEQ ID NO :7)與人種系Vh 1-69氨基酸序列（SEQ ID N0:102)的比對。JH6b種系序列公開為SEQ ID N0:110。
[0372] 圖18顯示11E6的重鏈可變區氨基酸序列（SEQ ID NO :8)與人種系Vh 1-69氨基酸序列（SEQ ID N0:102)的比對。JH6c種系序列公開為SEQ ID N0:112。
[0373] 圖19顯示12B7的重鏈可變區氨基酸序列（SEQ ID NO :9)與人種系Vh 1-69氨基酸序列（SEQ ID N0:102)的比對。JH6b種系序列公開為SEQ ID N0:110。
[0374] 圖20顯示13G4的重鏈可變區氨基酸序列（SEQ ID NO :10)與人種系Vh 3-9氨基酸序列（SEQ ID N0:104)的比對。JH4b種系序列公開為SEQ ID N0:113。
[0375] 圖21顯示3G10的輕鏈可變區氨基酸序列（SEQ ID NO :11)與人種系Vk L6氨基酸序列（SEQ ID N0:105)的比對。JKl種系序列公開為SEQ ID N0:114。
[0376] 圖22顯示12A4的輕鏈可變區氨基酸序列（SEQ ID NO :12)與人種系Vk L6氨基酸序列（SEQ ID N0:105)的比對。JKl種系序列公開為SEQ ID N0:115。
[0377] 圖23顯示10A5的輕鏈可變區氨基酸序列（SEQ ID NO :13)與人種系Vk L15氨基酸序列（SEQ ID N0:106)的比對。JK2種系序列公開為SEQ ID N0:116。
[0378] 圖24顯示5F8的輕鏈可變區氨基酸序列（SEQ ID NO :14)與人種系Vk A27氨基酸序列（SEQ ID N0:107)的比對。JKl種系序列公開為SEQ ID N0:114。
[0379] 圖25顯示10H10的輕鏈可變區氨基酸序列（SEQ ID NO :15)與人種系Vk L15氨基酸序列（SEQ ID N0:106)的比對。JK2種系序列公開為SEQ ID N0:116。
[0380] 圖26顯示1B12的輕鏈可變區氨基酸序列（SEQ ID NO :16)與人種系Vk L6氨基酸序列（SEQ ID N0:105)的比對。JKl種系序列公開為SEQ ID N0:115。
[0381] 圖27顯示7H1的輕鏈可變區氨基酸序列（SEQ ID NO :17)與人種系Vk L6氨基酸序列（SEQ ID N0:105)的比對。JKl種系序列公開為SEQ ID N0:115。
[0382] 圖28顯示11E6的輕鏈可變區氨基酸序列（SEQ ID NO :18)與人種系Vk A27氨基酸序列（SEQ ID N0:107)的比對。JK4種系序列公開為SEQ ID N0:117。
[0383] 圖29顯示llE6a的輕鏈可變區氨基酸序列（SEQ ID NO :109)與人種系Vk A27氨基酸序列（SEQ ID N0:107)的比對。JK4種系序列公開為SEQ ID N0:118。
[0384] 圖30顯示12B7的輕鏈可變區氨基酸序列（SEQ ID NO :19)與人種系Vk L6氨基酸序列（SEQ ID N0:105)的比對。JK5種系序列公開為SEQ ID N0:119。
[0385] 圖31顯示13G4的輕鏈可變區氨基酸序列（SEQ ID NO :20)與人種系Vk L18氨基酸序列（SEQ ID N0:108)的比對。JK3種系序列公開為SEQ ID N0:120。
[0386] 圖32A_C顯不流式細胞頭驗結果，該結果證明抗人]3D-Ll的人單克隆抗體3G10、 10A5和12A4與全長人I3D-Ll轉染的CHO細胞的細胞表面結合。（A) 3G10的流式細胞分析圖，（B) 10A5的流式細胞分析圖，（C) 12A4的流式細胞分析圖。
[0387] 圖33顯示流式細胞實驗的結果，該結果證明抗人H)-L1的人單克隆抗體3G10、 10A5和12A4以濃度依賴的方式與全長人H)-L1轉染的CHO細胞的細胞表面結合。
[0388] 圖34顯示ELISA實驗的結果，該結果證明抗人H)-L1的人單克隆抗體3G10、10A5 和12A4與ro-Ll-Fc融合蛋白結合。
[0389] 圖35顯示證明在刺激的人⑶4+T細胞上HuMab滴定的實驗的結果。
[0390] 圖36顯示證明在刺激的食蟹猴PBMC上HuMab滴定的實驗的結果。
[0391] 圖37A_C顯不流式細胞頭驗的結果，該結果證明抗人]3D-Ll的人單克隆抗體3G10、 10A5和12A4與活化的T細胞表面上的H)-L1結合。（A) 3G10的流式細胞分析圖，（B) 10A5 的流式細胞分析圖，（C) 12A4的流式細胞分析圖。
[0392] 圖38證明HuMab與ES-2細胞結合。
[0393] 圖39A-D顯示實驗結果，證明抗人H)-L1的人單克隆抗體在混合淋巴細胞反應試驗中促進T細胞增殖、IFN- Y分泌和IL-2分泌。圖39A是顯示使用HuMb 10A5的濃度依賴性T細胞增殖的條圖；圖39B是顯示使用HuMb 10A5的濃度依賴性IFN- Y分泌的條圖；圖39C是顯示使用HuMb 3G10和12A4的濃度依賴性IFN- Y分泌的條圖；圖39D是顯示使用HuMb 10A5的濃度依賴性IL-2分泌的條圖。
[0394] 圖40證明在MLR中使用異基因樹突細胞和T細胞（CD4+效應T細胞）樹突細胞，人抗I 3D-Ll抗體對增殖和IFN-Y分泌的影響。
[0395] 圖41A-D顯示實驗結果，證明抗人H)-L1的人單克隆抗體在含有T調節細胞的MLR 中促進T細胞增殖和IFN- Y分泌。圖41A是顯示使用HuMb 10A5的濃度依賴性T細胞增殖的條圖；圖41B是顯示使用HuMb 10A5的濃度依賴性IFN-Y分泌的條圖。
[0396] 圖42證明在存在調節T細胞的混合淋巴細胞反應中抗H)-L1抗體對細胞增殖的結果。
[0397] 圖43證明在存在調節T細胞的混合淋巴細胞反應中抗PD-Ll抗體對細胞因子產生的結果。
[0398] 圖44證明抗PD-Ll抗體對CMV裂解液刺激的人PBMC IFN- Y分泌的結果。
[0399] 圖45顯示流式細胞實驗結果，證明抗人H)-L1的人單克隆抗體阻斷H)-L1與表達 ro-i的CHO轉染細胞的結合。
[0400] 圖46顯示抗PD-Ll抗體阻斷PD-Ll與IFN- Y處理的ES-2細胞的結合。
[0401] 圖47顯示抗I3D-Ll抗體對體內腫瘤生長的影響。
[0402] 發明詳沭
[0403] 在一個方面，本發明涉及特異性結合ro-Ll的分離的單克隆抗體，特別是人單克隆抗體。在某些實施方案中，本發明的抗體表現出一種或多種所需的功能性質，如與人 PD-Ll的高親和力結合，在混合淋巴細胞反應中增強T細胞增殖、IFN- Y和/或IL-2分泌的能力，抑制ro-Ll與ro-1受體結合的能力，刺激抗體應答的能力，和/或逆轉T調節細胞的抑制功能的能力。另外或者可替代地，本發明的抗體源自特定重鏈和輕鏈種系序列，和/ 或包含特定結構特征，如包含特定氨基酸序列的⑶R區。
[0404] 例如，本發明提供分離的抗體、制備該抗體的方法、含有該抗體的免疫偶聯物和雙特異性分子、和含有本發明的抗體、免疫偶聯物或雙特異性分子的藥物組合物。
[0405] 在另一方面，本發明涉及使用抗ro-Li抗體抑制受試者中腫瘤細胞生長的方法。本發明也涉及利用該抗體改變免疫應答，以及治療疾病如癌癥或傳染病，或刺激保護性自身免疫應答或刺激抗原特異性免疫應答的方法（例如通過抗ro-Li和目標抗原的共給藥）。
[0406] 為了使本發明更容易理解，首先定義了一些術語。其他的定義在發明詳述內容中說明。
[0407] 術語"免疫應答"是指例如淋巴細胞、抗原呈遞細胞、吞噬細胞、粒細胞和上述細胞或肝臟產生的可溶性大分子（包括抗體、細胞因子和補體）的作用，其導致選擇性損傷、破壞或從人體中清除侵入的病原體、被病原體感染的細胞或組織、癌細胞，或（在自身免疫或病理性炎癥的情況下）正常人細胞或組織。
[0408] "信號轉導途徑"是指在信號從一個細胞的一部分向一個細胞的另一部分傳送中起作用的多種信號轉導分子之間的生化關系。本文使用的短語"細胞表面受體"包括，例如，能夠接收信號和跨過細胞質膜傳播這種信號的分子和分子復合物。本發明的"細胞表面受體"的一個例子是ro-Li受體。
[0409] 這里提到的術語"抗體"包括完整抗體及其任何抗原結合片段（即"抗原結合部分"）或單鏈。"抗體"是指包含通過二硫鍵互相連接在一起的至少兩條重（H)鏈和兩條輕 (L)鏈的糖蛋白，或其抗原結合部分。每條重鏈由重鏈可變區（在此縮寫為V h)和重鏈恒定區組成。重鏈恒定區由三個結構域CH1、CH2和C h3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區（在此縮寫為')和輕鏈恒定區組成。輕鏈恒定區由一個結構域Q組成。V1^P'區可進一步再分為高變區，稱為互補決定區（CDR)，CDR散布在被稱為構架區（FR)的更加保守的區域中。每個 V h和八均由三個CDR和四個FR組成，它們從氨基端向羧基端以如下順序排列：FR1，CDRl， FR2,⑶R2，FR3,⑶R3，FR4。重鏈和輕鏈的可變區含有可與抗原相互作用的結合結構域。抗體的恒定區可以介導免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合，該宿主組織或因子包括免疫系統的各種細胞（例如效應細胞）和經典補體系統的第一成分（Clq)。
[0410] 本文所用的術語抗體的"抗原結合部分"（或簡稱為"抗體部分"）是指保留與抗原 (例如ro-Li)特異性結合的能力的抗體的一個或多個片段。已證明抗體的抗原結合功能可由全長抗體的片段來行使。術語抗體的"抗原結合部分"中所包括的結合片段的例子包括： (1汗 &13片段，即由^11、(^和〇11結構域組成的單價片段；出汗妯'） 2片段，即包含在鉸鏈區處通過二硫鍵連接的兩個Fab片段的雙價片段；（iii)由V1^P Chi結構域組成的Fd片段； (iv)由抗體單臂的Vlj和Vh結構域組成的Fv片段；(V)由V h結構域組成的dAb片段（Ward 等（1989)Nature 341 :544-546);和（vi)分離的互補決定區（CDR)。此外，盡管Fv片段的兩個結構域'和Vh由單獨的基因編碼，但是它們可以利用重組方法通過合成連接體連接在一起，該連接體使它們能夠制成一條蛋白質鏈，其中 '和Vh區配對構成單價分子（稱為單鏈 Fv(scFv);參見，例如 Bird 等（1988) Science 242 :423-426;和 Huston 等（1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879-5883)。這種單鏈抗體也包括在術語抗體的"抗原結合部分" 內。這些抗體片段用本領域技術人員公知的常規技術獲得，并用與完整抗體相同的方法對這些片段的實用性進行篩選。
[0411] 本文使用的"分離的抗體"是指基本不含具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體 (例如，與PD-Ll特異性結合的分離的抗體基本不含與除PD-Ll以外的抗原特異性結合的抗體）。但是，與ro-Li特異性結合的分離的抗體與諸如來自其他物種的ro-Li分子等其他抗原可能具有交叉反應性。而且，分離的抗體可基本不含其他細胞材料和/或化學物質。
[0412] 本文使用的術語"單克隆抗體"或"單克隆抗體組合物"是指單一分子組成的抗體分子的制劑。單克隆抗體組合物表現出對特定表位的單一結合特異性和親和性。
[0413] 本文使用的術語"人抗體"包括具有如下可變區的抗體，在該可變區中，構架區和 CDR區都源自人種系免疫球蛋白序列。而且，如果該抗體含有恒定區，則恒定區也源自人種系免疫球蛋白序列。本發明的人抗體可包含并非由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基（例如，通過體外隨機或位點特異性誘變或通過體內體細胞突變引入的突變）。但是，本文使用的術語"人抗體"不包括其中源自另一哺乳動物種如小鼠的種系的CDR序列已被移植到人構架序列上的抗體。
[0414] 術語"人單克隆抗體"是指表現單一結合特異性的抗體，其具有其中構架區和CDR 區均源自人種系免疫球蛋白序列的可變區。在一個實施方案中，人單克隆抗體由雜交瘤產生，該雜交瘤包括與無限增殖化細胞融合的B細胞，該B細胞從具有含人重鏈轉基因和輕鏈轉基因的基因組的轉基因非人動物（例如轉基因小鼠）中獲得。
[0415] 本文使用的術語"重組人抗體"包括通過重組方法制備、表達、產生或分離的所有人抗體，例如：(a)從對于人免疫球蛋白基因的轉基因或轉染色體動物（例如小鼠）或由其制備的雜交瘤（下文進一步描述）中分離的抗體，（b)從經轉化表達人抗體的宿主細胞如轉染瘤中分離的抗體，（c)從重組組合人抗體文庫中分離的抗體，和（d)通過包括將人免疫球蛋白基因序列剪接為其他DNA序列的任何其他方法制備、表達、產生或分離的抗體。這些重組人抗體具有其中構架區和⑶R區均源自人種系免疫球蛋白序列的可變區。但是在某些實施方案中，這些重組人抗體可以經歷體外誘變（或者，當使用人Ig序列的轉基因動物時，經歷體內體細胞誘變），因此重組抗體的V h和' 區的氨基酸序列盡管是源自人種系 %和'序列并與之相關的序列，但可能不是在體內天然存在于人抗體種系的所有組成成分 (repertoire)中。
[0416] 本文使用的術語"同種型"是指由重鏈恒定區基因編碼的抗體類別（例如IgM或 IgGl)。
[0417] 短語"識別抗原的抗體"和"抗原特異性抗體"在此與術語"與抗原特異性結合的抗體"可互換使用。
[0418] 術語"人抗體衍生物"是指人抗體的任何修飾形式，例如抗體和其它試劑或抗體的偶聯物。
[0419] 術語"人源化抗體"是指其中來源于另外一種哺乳動物種如小鼠的種系的CDR序列已經被移植到人構架序列上的抗體。在人構架序列內也可以進行其它的構架區修飾。
[0420] 術語"嵌合抗體"是指其中可變區序列來源于一個物種而恒定區序列來源于另一個物種的抗體，例如其中可變區序列來源于小鼠抗體而恒定區序列來源于人抗體的抗體。
[0421] 本文使用的術語"與人ro-Ll特異性結合"的抗體是指以IXKT7M或更低、更優選 5 X KT8M或更低、更優選I X KT8M或更低、更優選5 X KT9M或更低、甚至更優選I X KT8M至 I X KTwM或更低的Kd與人PD-Ll結合的抗體。
[0422] 本文使用的術語"Kass。。"或"Ka"是指特定抗體_抗原相互作用的結合速率，而本文使用的術語"K dis"或"Kd"是指特定抗體-抗原相互作用的解離速率。本文使用的術語"Kd" 是指解離常數，它是由心與心的比值獲得的（即Kd/Ka)，并且表示為摩爾濃度（M)。抗體的 Kd值可能用本領域建立的方法測定。測定抗體Kd的一種優選方法是使用表面等離振子共振法，優選使用生物傳感器系統，如Biacore?系統。
[0423] 本文使用的術語IgG抗體的"高親和力"是指抗體對于靶抗原的Kd為KT 8M或更低、更優選KT9M或更低、甚至更優選KTwM或更低。但是對于其他抗體同種型來說，"高親和力"結合可能不同。例如，對于IgM同種型來說，"高親和力"結合是指抗體具有KT 7M或更低、更優選KT8M或更低、甚至更優選KT9M或更低的K d。
[0424] 本文使用的術語"受試者"包括任何人或非人類動物。術語"非人類動物"包括所有脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，如非人靈長類動物、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲類動物、爬行類動物等。
[0425] 本申請的各個方面在下面的章節中進一步詳細描述。
[0426] 抗-PD-Ll 抗體
[0427] 本發明的抗體的特征在于抗體的特定功能特征或特性。例如，這些抗體與人I3D-Ll 特異性結合。優選地，本發明的抗體以高親和力與ro-Ll結合，例如K d為IX KT7M或更低。本發明的抗-PD-Ll抗體優選地表現出以下一種或多種特性：
[0428] (a)以I X KT7M或更低的Kd與人PD-Ll結合；
[0429] (b)在混合淋巴細胞反應（MLR)試驗中提高T細胞增殖；
[0430] (c)在MLR試驗中提高干擾素-Y產生；
[0431] (d)在MLR試驗中提高IL-2分泌；
[0432] (e)刺激抗體應答；和/或
[0433] (f)逆轉T調節細胞對T細胞效應細胞和/或樹突細胞的作用。
[0434] 優選地，該抗體以5 X KT8M或更低的Kd與人PD-Ll結合，以I X KT8M或更低的Kd 與人ro-Ll結合，以5X1(T9M或更低的Kd與人ro-Ll結合，以4X1(T9M或更低的K d與人 PD-Ll結合，或以2X KT9M或更低的Kd與人I3D-Ll結合，或以IX KT9M至IX KTkiM或更低的Kd與人ro-Li結合。
[0435] 評價抗體對I3D-Ll的結合能力的標準試驗在本領域中是公知的，包括，例如 ELISA、We Stem印跡分析和RIA。合適的試驗在實施例中詳細描述。抗體的結合動力學（例如結合親和力）也可以通過本領域公知的標準試驗（如Biacore?分析）來評價。
[0436] 單克降抗體 3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7 和 13G4
[0437] 本發明優選的抗體是如實施例1和2所述分離并進行結構表征的人單克隆抗體 3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7 和 13G4。 3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、 1B12、7H1、11E6、12B7 和 13G4 的％氨基酸序列分別顯示在 SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、9 和10中。3610、12六4、1(^5、5?8、101110、1812、7111、1比6、1287和1364的\氨基酸序列分別顯示在 SEQ ID 吣：11、12、13、14、15、16、17、18、19和20中。
[0438] 假定這些抗體中的每一個都能夠與H)-L1結合，則V1^P '序列可以"混合并匹配"，從而產生本發明的其他的抗-PD-Ll結合分子。PD-Ll與這些"混合并匹配的"抗體的結合可以用上文及實施例中所述的結合試驗（例如ELISA)檢測。優選地，當V 1^P'鏈混合并匹配時，來自特定VH/\配對的Vh序列被替換為結構上相似的V h序列。同樣，優選地，來自特定VH/\配對的 '序列被替換為結構上相似的' 序列。
[0439] 因此，在一個方面，本發明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括：
[0440] (a)包含選自SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的氨基酸序列的重鏈可變區；和
[0441] (b)包含選自 SEQ ID NO :11、12、13、14、15、16、17、18、19 和 20 的氨基酸序列的輕鏈可變區；
[0442] 其中該抗體與ro-Ll、優選與人ro-Ll特異性結合。
[0443] 優選的重鏈和輕鏈組合包括：
[0444] (a)包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列的重鏈可變區；和（b)包含SEQ ID NO :11的氨基酸序列的輕鏈可變區；或
[0445] (a)包含SEQ ID NO :2的氨基酸序列的重鏈可變區；和（b)包含SEQ ID NO :12的氨基酸序列的輕鏈可變區；或
[0446] (a)包含SEQ ID NO :3的氨基酸序列的重鏈可變區；和（b)包含SEQ ID NO :13的氨基酸序列的輕鏈可變區；或
[0447] (a)包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列的重鏈可變區；和（b)包含SEQ ID NO : 14的氨基酸序列的輕鏈可變區；或
[0448] (a)包含SEQ ID NO :5的氨基酸序列的重鏈可變區；和（b)包含SEQ ID NO :15的氨基酸序列的輕鏈可變區；或
[0449] (a)包含SEQ ID NO :6的氨基酸序列的重鏈可變區；和（b)包含SEQ ID NO : 16的氨基酸序列的輕鏈可變區；或
[0450] (a)包含SEQ ID NO :7的氨基酸序列的重鏈可變區；和（b)包含SEQ ID NO :17的氨基酸序列的輕鏈可變區；或
[0451] (a)包含SEQ ID NO :8的氨基酸序列的重鏈可變區；和（b)包含SEQ ID NO : 18的氨基酸序列的輕鏈可變區；或
[0452] (a)包含SEQ ID NO :9的氨基酸序列的重鏈可變區；和（b)包含SEQ ID NO : 19的氨基酸序列的輕鏈可變區；或
[0453] (a)包含SEQ ID NO :10的氨基酸序列的重鏈可變區；和（b)包含SEQ ID NO :20 的氨基酸序列的輕鏈可變區。
[0454] 在另一方面，本發明提供包含 3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7 和13G4的重鏈和輕鏈CDR1、CDR2和CDR3或其組合的抗體。3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、比12、7111、1比6、1287和1364的￥ 11〇)1?1的氨基酸序列示于5￡0 10吣：21、22、23、24、25、 26、27、28、29 和 30 中。3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7 和 13G4 的 Vh CDR2 的氨基酸序列示于 SEQ ID N0:31、32、33、34、35、36、37、38、39 和 40 中。3G10、12A4、 10八5、5?8、101110、1812、7111、1比6、1287和1364的￥11〇)1?3的氨基酸序列示于5￡0 10吣： 41、42、43、44、45、46、47、48、49和50中。3610、12六4、1(^5、5卩8、101110、1812、7111、1比6、1287 和 13G4 的 Vk CDRl 的氨基酸序列示于 SEQ ID 勵：51、52、53、54、55、56、57、58、59和60中。 3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7 和 13G4 的 Vk CDR2 的氨基酸序列示于 SEQ ID N0:61、62、63、64、65、66、67、68、69 和 70 中。3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、 7111、1比6、1287和1364的￥1?〇)1?3的氨基酸序列示于5￡0 10吣：71、72、73、74、75、76、77、 78、79 和 80 中。CDR 區用 Kabat 系統（Kabat，E.A?等（1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版，U. S. Department of Health and Human Services, NIH 出版號91-3242)勾畫出。
[0455] 假如這些抗體均能與H)-L1結合，并且抗原結合特異性主要是由⑶Rl、2和3區提供的，則V h⑶町、⑶R 2和⑶R 3序列與Vk⑶町、⑶R 2和⑶R 3序列可以"混合并匹配"（即來自不同抗體的⑶R可以混合并匹配，但是每個抗體必須含有Vh OTR1XDR2和⑶R 3和Vk OTR1XDR 2和⑶R 3)，從而產生本發明的其他的抗-PD-Ll結合分子。PD-Ll與這些 "混合并匹配的"抗體的結合可以用上文及實施例中所述的結合試驗（例如ELISA，Biacore 分析）檢測。優選地，當V h OTR序列混合并匹配時，來自特定Vh序列的⑶Rl、⑶R2和/或 ⑶R3序列被替換為結構上相似的⑶R序列。同樣，當V k OTR序列混合并匹配時，來自特定 Vk序列的⑶Rl、⑶R2和/或⑶R3序列優選地被替換為結構上相似的⑶R序列。對于本領域技術人員而言顯而易見的是，通過將一個或多個V h和/或' CDR區序列替換為來自此處公開的單克隆抗體 3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7 和 13G4 的 CDR 序列的結構上相似的序列，可以產生新的Vh和' 序列。
[0456] 因此，在另一個方面，本發明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括：
[0457] (a)包含選自 SEQ ID NO :21、22、23、24、25、26、27、28、29和30的氨基酸序列的重鏈可變區CDRl ;
[0458] (b)包含選自 SEQ ID NO :31、32、33、34、35、36、37、38、39和40的氨基酸序列的重鏈可變區CDR2 ;
[0459] (c)包含選自 SEQ ID NO :41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的氨基酸序列的重鏈可變區CDR3 ;
[0460] (d)包含選自 SEQ ID NO :51、52、53、54、55、56、57、58、59和60的氨基酸序列的輕鏈可變區CDRl ;
[0461] (e)包含選自 SEQ ID NO :61、62、63、64、65、66、67、68、69和70的氨基酸序列的輕鏈可變區CDR2 ;和
[0462] (f)包含選自 SEQ ID NO :71、72、73、74、75、76、77、78、79和80的氨基酸序列的輕鏈可變區CDR3 ;
[0463] 其中該抗體與ro-Ll、優選與人ro-Ll特異性結合。
[0464] 在一個優選實施方案中，該抗體包括：
[0465] (a)包含SEQ ID NO :21的重鏈可變區CDRl ;
[0466] (b)包含SEQ ID NO :31的重鏈可變區CDR2 ;
[0467] (c)包含SEQ ID NO :41的重鏈可變區CDR3 ;
[0468] (d)包含SEQ ID NO :51的輕鏈可變區CDRl ;
[0469] (e)包含SEQ ID NO :61的輕鏈可變區CDR2 ;和
[0470] (f)包含SEQ ID NO : 71的輕鏈可變區CDR3。
[0471] 在另一優選實施方案中，該抗體包括：
[0472] (a)包含SEQ ID NO :22的重鏈可變區CDRl ;
[0473] (b)包含SEQ ID NO :32的重鏈可變區CDR2 ;
[0474] (c)包含SEQ ID NO :42的重鏈可變區CDR3 ;
[0475] (d)包含SEQ ID NO :52的輕鏈可變區CDRl ;
[0476] (e)包含SEQ ID NO :62的輕鏈可變區CDR2 ;和
[0477] (f)包含SEQ ID NO :72的輕鏈可變區CDR3。
[0478] 在另一優選實施方案中，該抗體包括：
[0479] (a)包含SEQ ID NO丨3的重鏈可變區CDRl ;
[0480] (b)包含SEQ ID NO :33的重鏈可變區CDR2 ;
[0481] (c)包含SEQ ID NO :43的重鏈可變區CDR3 ;
[0482] (d)包含SEQ ID NO :53的輕鏈可變區CDRl ;
[0483] (e)包含SEQ ID NO :63的輕鏈可變區CDR2 ;和
[0484] (f)包含SEQ ID NO J3的輕鏈可變區CDR 3。
[0485] 在另一優選實施方案中，該抗體包括：
[0486] (a)包含SEQ ID NO丨4的重鏈可變區CDRl ;
[0487] (b)包含SEQ ID NO : 34的重鏈可變區CDR2 ;
[0488] (c)包含SEQ ID NO :44的重鏈可變區CDR 3 ;
[0489] (d)包含SEQ ID NO :54的輕鏈可變區CDRl ;
[0490] (e)包含SEQ ID NO :64的輕鏈可變區CDR2 ;和
[0491] (f)包含SEQ ID NO :74的輕鏈可變區CDR3。
[0492] 在另一優選實施方案中，該抗體包括：
[0493] (a)包含SEQ ID NO :?的重鏈可變區CDRl ;
[0494] (b)包含SEQ ID NO :35的重鏈可變區CDR2 ;
[0495] (c)包含SEQ ID NO :4 5的重鏈可變區CDR3 ;
[0496] (d)包含SEQ ID NO :55的輕鏈可變區CDRl ;
[0497] (e)包含SEQ ID NO :65的輕鏈可變區CDR2 ;和
[0498] (f)包含SEQ ID NO J5的輕鏈可變區CDR 3。
[0499] 在另一優選實施方案中，該抗體包括：
[0500] (a)包含SEQ ID NO :26的重鏈可變區CDRl ;
[0501] (b)包含SEQ ID NO :36的重鏈可變區CDR2 ;
[0502] (c)包含SEQ ID NO :46的重鏈可變區CDR3 ;
[0503] (d)包含SEQ ID NO :56的輕鏈可變區CDRl ;
[0504] (e)包含SEQ ID NO :66的輕鏈可變區CDR2 ;和
[0505] (f)包含SEQ ID NO :76的輕鏈可變區CDR3。
[0506] 在另一優選實施方案中，該抗體包括：
[0507] (a)包含SEQ ID NO :27的重鏈可變區CDRl ;
[0508] (b)包含SEQ ID NO :37的重鏈可變區CDR2 ;
[0509] (c)包含SEQ ID NO :47的重鏈可變區CDR3 ;
[0510] (d)包含SEQ ID NO :57的輕鏈可變區CDRl ;
[0511] (e)包含SEQ ID NO :67的輕鏈可變區CDR2 ;和
[0512] (f)包含SEQ ID NO :77的輕鏈可變區CDR3。
[0513] 在另一優選實施方案中，該抗體包括：
[0514] (a)包含SEQ ID NO :28的重鏈可變區CDRl ;
[0515] (b)包含SEQ ID NO :38的重鏈可變區CDR2 ;
[0516] (c)包含SEQ ID NO :48的重鏈可變區CDR3 ;
[0517] (d)包含SEQ ID NO :58的輕鏈可變區CDRl ;
[0518] (e)包含SEQ ID NO :68的輕鏈可變區CDR2 ;和
[0519] (f)包含SEQ ID NO :78的輕鏈可變區CDR3。
[0520] 在另一優選實施方案中，該抗體包括：
[0521] (a)包含SEQ ID NO :29的重鏈可變區CDRl ;
[0522] (b)包含SEQ ID NO :39的重鏈可變區CDR2 ;
[0523] (c)包含SEQ ID NO :49的重鏈可變區CDR3 ;
[0524] (d)包含SEQ ID NO :59的輕鏈可變區CDRl ;
[0525] (e)包含SEQ ID NO :69的輕鏈可變區CDR2 ;和
[0526] (f)包含SEQ ID NO :79的輕鏈可變區CDR3。
[0527] 在另一優選實施方案中，該抗體包括：
[0528] (a)包含SEQ ID NO :30的重鏈可變區CDRl ;
[0529] (b)包含SEQ ID NO :40的重鏈可變區CDR2 ;
[0530] (c)包含SEQ ID NO :50的重鏈可變區CDR3 ;
[0531] (d)包含SEQ ID NO :60的輕鏈可變區CDRl ;
[0532] (e)包含SEQ ID NO :70的輕鏈可變區CDR2 ;和
[0533] (f)包含SEQ ID NO :80的輕鏈可變區CDR3。
[0534] 本領域公知，不依賴于⑶Rl和/或⑶R2域，單獨的⑶R3域即可以決定抗體對于同源抗原的結合特異性，并且基于共同的CDR3序列可以預測性地產生具有相同結合特異性的多種抗體。參見，例如，Klimka 等，British J.of Cancer 83(2) :252-260(2000)(描述了僅使用鼠抗-⑶30抗體Ki-4的重鏈可變域⑶R3產生人源化抗-⑶30抗體）；Beib 〇er等， J. Mol Biol. 296 :833-849(2000)(描述了僅使用親本鼠 M0C-31 抗-EGP-2 抗體的重鏈 CDR3 序列產生重組上皮糖蛋白-2 (EGP-2)抗體）；Rader 等，Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A. 95 : 8910-8915(1998)(描述了使用鼠抗整聯蛋白a J3抗體LM609的重鏈和輕鏈可變CDR3域的一組人源化抗整聯蛋白a J 3抗體，其中每個成員抗體在CDR3域之外含有不同的序列，并且能夠與親本鼠抗體結合相同的表位，其親和力與親本鼠抗體一樣高或更高）；Barbas 等，J. Am. Chem. Soc. 116 :2161-2162(1994)(公開了 CDR3域對抗原結合提供了最重要的貢獻）；Barbas 等，Proc，Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92 :2529-2533 (I"5)(描述了三種抗人胎盤 DNA的Fab (SI-1，SI-40和SI-32)的重鏈CDR3序列向抗破傷風類毒素Fab的重鏈上的移植，由此替換了存在的重鏈⑶R3,并且證明單獨的⑶R3提供結合特異性）；和Ditzel等， J. Immunol. 157 :739-749(1996)(描述了移植研究，其中僅向單特異性IgG破傷風類毒素結合Fab p313抗體轉移親本多特異性Fab LNA3的重鏈⑶R3足以保留親本Fab的結合特異性）。上述每一參考文獻都全文引入作為參考。
[0535] 因此，在某些方面，本發明提供包含一個或多個來自非人抗體如小鼠或大鼠抗體的重鏈和/或輕鏈CDR3域的單克隆抗體，其中該單克隆抗體能夠特異性結合CD19。在某些實施方案中，這些本發明的包含一個或多個來自非人抗體的重鏈和/或輕鏈CDR3域的抗體與相應的親本非人抗體（a)能夠競爭結合；(b)保留功能特性；（c)結合相同的表位；和/ 或（d)具有類似的結合親和力。
[0536] 在其他方面，本發明提供包含一個或多個來自第一人抗體（如從非人動物獲得的人抗體）的重鏈和/或輕鏈CDR3域的單克隆抗體，其中該第一人抗體能夠特異性結合 CD19,并且其中來自該第一人抗體的CD3域代替了缺乏對H)-L1的結合特異性的人抗體中的CDR3域，從而產生能夠特異性結合H)-L1的第二人抗體。在某些實施方案中，本發明的包含一個或多個來自第一人抗體的重鏈和/或輕鏈CDR3域的抗體與相應的親本第一人抗體（a)能夠競爭結合；(b)保留功能特性；(c)結合相同的表位；和/或（d)具有類似的結合親和力。
[0537] 具有特定種系序列的抗體
[0538] 在某些實施方案中，本發明的抗體包含來自特定種系重鏈免疫球蛋白基因的重鏈可變區和/或來自特定種系輕鏈免疫球蛋白基因的輕鏈可變區。
[0539] 例如，在一個優選實施方案中，本發明涉及一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含產自或源自人V h 1-18基因的重鏈可變區，其中該抗體與ro-L 1特異性結合。在另一優選實施方案中，本發明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含產自或源自人V h 1-69基因的重鏈可變區，其中該抗體與H)-L1特異性結合。在另一優選實施方案中，本發明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包含產自或源自人V h 1-3基因的重鏈可變區，其中該抗體與ro-Li特異性結合。在另一優選實施方案中，本發明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含產自或源自人V h 3-9基因的重鏈可變區，其中該抗體與ro-Li特異性結合。在另一優選實施方案中，本發明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含產自或源自人V k L6基因的輕鏈可變區，其中該抗體與H)-L1特異性結合。在另一優選實施方案中，本發明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包含產自或源自人V k L15基因的輕鏈可變區，其中該抗體與H)-L1 特異性結合。在另一優選實施方案中，本發明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包含產自或源自人V k A27基因的輕鏈可變區，其中該抗體與H)-L1特異性結合。在另一優選實施方案中，本發明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包含產自或源自人V k L18基因的輕鏈可變區，其中該抗體與H)-L1特異性結合。在另一優選實施方案中，本發明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其中該抗體：
[0540] (a)包含產自或源自人Vh 1-18、1-69、1-3或3-9基因（該基因分別編碼SEQ ID NO : 101、102、103和104所示的氨基酸序列）的重鏈可變區；
[0541] (b)包含產自或源自人Vk L6、L15、A27或Ll基因（該基因分別編碼SEQ ID NO : 105、106、107和108所示的氨基酸序列）的輕鏈可變區；且
[0542] (c)與ro-Ll、優選與人PD-Ll特異性結合。
[0543] 分別具有￥11 1-18和Vk 的抗體的一個例子是3G10。分別具有￥11 1-69 和Vk L6的Vk的抗體的例子是12A4、1B12、7H1和12B7。分別具有Vh 1-3和Vk L15的 Vh和Vk的抗體的一個例子是10A5。分別具有Vh 1-69和Vk A27的Vh和Vk的抗體的例子是 5F8U1E6和llE6a。分別具有V h 3-9和Vk L15的Vh和Vk的抗體的一個例子是10H10。分另Ij具有Vh 1-3和Vk L15的Vh和Vk的抗體的一個例子是10A5。分別具有Vh 3-9和Vk L18 的Vh和Vk的抗體的一個例子是13G4。
[0544] 在本文中，如果一種人抗體的可變區是從使用人種系免疫球蛋白基因的系統中獲得的，則該人抗體包含"產自"或"源自"特定種系序列的重鏈或輕鏈可變區。這樣的系統包括用目標抗原免疫攜帶人免疫球蛋白基因的轉基因小鼠，或者用目標抗原篩查展示在噬菌體上的人免疫球蛋白基因文庫。"產自"或"源自"人種系免疫球蛋白序列的人抗體可以這樣鑒定：將該人抗體的氨基酸序列與人種系免疫球蛋白的氨基酸序列進行比較，選擇在序列上最接近于該人抗體序列（即有最高％同一性）的人種系免疫球蛋白序列。"產自"或 "源自"特定人種系免疫球蛋白序列的人抗體與該種系序列相比可能包含氨基酸差異，例如由于天然發生的體細胞突變或定點突變的有意引入而導致的氨基酸差異。但是，選擇的人抗體在氨基酸序列上與人種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列通常至少90%相同，并且含有當與其他物種的種系免疫球蛋白氨基酸序列（例如鼠種系序列）相比較時確認該人抗體屬于人類抗體的氨基酸殘基。在某些情況下，人抗體在氨基酸序列上與該種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列可以至少95%、或者甚至至少96%、97%、98%或99%相同。在某些實施方案中，源自特定人種系序列的人抗體表現與該人種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列有不超過10個氨基酸的差異。在某些其他實施方案中，該人抗體可能表現與該種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列有不超過5個、或者甚至不超過4、3、2或1個氨基酸的差異。
[0545] 同源抗體
[0546] 在另一實施方案中，本發明的抗體包含的重鏈和輕鏈可變區含有與此處所述優選抗體的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且其中該抗體保留了本發明抗-PD-Ll抗體的所需功能特性。
[0547] 例如，本發明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：
[0548] (a)重鏈可變區包含與選自SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的氨基酸序列至少80%同源的氨基酸序列；
[0549] (b)輕鏈可變區包含與選自 SEQ ID NO :11、12、13、14、15、16、17、18、19 和 20 的氨基酸序列至少80%同源的氨基酸序列；
[0550] (c)該抗體以I X KT7M或更低的Kd與人PD-Ll結合；
[0551] (d)該抗體在混合淋巴細胞反應（MLR)試驗中提高T細胞增殖；
[0552] (e)該抗體在MLR試驗中提高干擾素-Y產生；
[0553] (f)該抗體在MLR試驗中提高IL-2分泌；
[0554] (g)該抗體刺激抗體應答；且
[0555] (h)該抗體逆轉T調節細胞對T細胞效應細胞和/或樹突細胞的作用。
[0556] 在另外一些實施方案中，￥11和/或'氨基酸序列可以與上述序列 95 %、96 %、97%、98 %或99 %同源。具有與上述序列的Vh和'區高度（即80 %或更高）同源的Vh和 '區的抗體可以如下獲得：誘變（例如定點誘變或PCR介導的誘變）編碼SEQ ID NO :25、26、27、28、29和30的核酸分子，然后用此處所述的功能試驗檢測編碼的被改變抗體的保留的功能（即以上（c)到（h)所述的功能）。
[0557] 本文使用的兩個氨基酸序列之間的百分同源性等同于兩個序列之間的百分同一性。考慮為了兩個序列之間進行最佳比對所需要引入的空位的數目和每個空位的長度后，兩個序列之間的百分同一性是這兩個序列共有的相同位點的數目的函數（即％同源性= 相同位點的數目/位點的總數X100)。兩個序列之間的序列比較和百分同一性的確定可以如下面的非限制性實施例中所述用數學算法實現。
[0558] 兩個氨基酸序列之間的百分同一性可以用已經整合入ALIGN程序（2.0版本）中的 E. Meyers 和 W. Miller (Comput. Appl. Biosci.，4 :11-17(1988))的算法來確定，其使用PAM120權重殘基表，12的空位長度罰分，4的空位罰分。另外，兩個氨基酸序列之間的百分同一'I"生也可以用已經整合入GCG軟件包（可從www. gcg. com獲得）的GAP程序中的 Needleman 和 Wunsch (J. Mol. Biol. 48 :444-453 (1970))的算法來確定，其使用 Blossum 62 矩陣或PAM250矩陣，16、14、12、10、8、6或4的空位權重，和1、2、3、4、5或6的長度權重。
[0559] 在某些情況中，本發明的蛋白質序列可以進一步作為"查詢序列"用于進行公共數據庫的檢索，例如鑒定相關序列。這種檢索可以用Altschul等（1990)J. Mol. Biol. 215: 403-10的XBLAST程序（2. 0版本）進行。BLAST蛋白質檢索可以用XBLAST程序進行，得分=50,字長=3,以獲得與本發明的抗體分子同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的空位比對，可以采用如 Altschul 等（1997)Nucleic Acids Res. 25(17) :3389-3402 所述的空位BLAST。當采用BLAST和空位BLAST程序時，可以使用各自程序（例如XBLAST和 NBLAST)的缺省參數。參見 www. ncbi. nlm. nih. gov。
[0560] 具有保守修飾的抗體
[0561] 在某些實施方案中，本發明的抗體包括含⑶Rl XDR2和⑶R3序列的重鏈可變區和含⑶Rl、⑶R2和⑶R3序列的輕鏈可變區，其中這些⑶R序列中的一個或多個包含基于本文所述優選抗體（例如3610、12八4、1(^5、5?8、101110、1812、7111、11￡6、1287或1364)的特定氨基酸序列或其保守修飾，并且其中該抗體保留本發明抗-PD-Ll抗體的所需功能特性。因此，本發明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的重鏈可變區和含CDR1、CDR2和CDR3序列的輕鏈可變區，其中：
[0562] (a)重鏈可變區 CDR3 序列包含選自 SEQ ID 勵：41、42、43、44、45、46、47、48、49和 50的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列，
[0563] (b)輕鏈可變區 CDR3 序列包含選自 SEQ ID 勵：71、72、73、74、75、76、77、78、79和 80的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列，
[0564] (c)該抗體以I X KT7M或更低的Kd與人PD-Ll結合；
[0565] (d)該抗體在混合淋巴細胞反應（MLR)試驗中提高T細胞增殖；
[0566] (e)該抗體在MLR試驗中提高干擾素-Y產生；
[0567] (f)該抗體在MLR試驗中提高IL-2分泌；
[0568] (g)該抗體刺激抗體應答；且
[0569] (h)該抗體逆轉T調節細胞對T細胞效應細胞和/或樹突細胞的作用。
[0570] 在一個優選實施方案中，重鏈可變區CDR2序列包含選自SEQ ID N0:31、32、33、 34、35、36、37、38、39和40的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列；且輕鏈可變區⑶R2 序列包含選自SEQ ID勵：61、62、63、64、65、66、67、68、69和70的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列。在另一優選實施方案中，重鏈可變區⑶Rl序列包含選自SEQ ID NO :21、 22、23、24、25、26、27、28、29和30的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列；且輕鏈可變區 CDRl序列包含選自SEQ ID勵：51、52、53、54、55、56、57、58、59和60的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列。
[0571] 本文使用的術語"保守序列修飾"是指不會顯著影響或改變含該氨基酸序列的抗體的結合特性的氨基酸修飾。這樣的保守修飾包括氨基酸置換、添加和缺失。可以通過本領域公知的標準技術，如定點誘變和PCR介導的誘變，向本發明抗體中引入修飾。保守氨基酸置換是將氨基酸殘基替換為具有相似側鏈的氨基酸殘基。具有相似側鏈的氨基酸殘基的家族在本領域中已經定義。這些家族包括：具有堿性側鏈（例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸）、酸性側鏈（例如天冬氨酸、谷氨酸）、不帶電荷極性側鏈（例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸）、非極性側鏈（例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸）、￠-分支側鏈（例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸）和芳族側鏈（例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸）的氨基酸。因此，本發明抗體的CDR區內的一個或多個氨基酸殘基可以被置換為來自相同側鏈家族的其他氨基酸殘基，并且可以用此處所述的功能試驗檢測改變的抗體保留的功能（即以上（c)至（h)所述的功能）。
[0572] 與本發明的抗-PD-Ll抗體結合相同表位的抗體
[0573] 在另一實施方案中，本發明提供與本發明的任意I3D-Ll單克隆抗體結合相同表位的抗體（即能夠與本發明的任意單克隆抗體交叉競爭結合ro-Li的抗體）。在優選實施方案中，用于交叉競爭研究的參比抗體可以是單克隆抗體3G10 (具有分別如SEQ ID NO :1和11 所示的Vh和 '序列），或單克隆抗體12A4 (具有分別如SEQ ID NO :2和12所示的Vh和' 序列），或單克隆抗體10A5 (具有分別如SEQ ID NO :3和13所示的Vh和 '序列），或單克隆抗體10A5 (具有分別如SEQ ID NO :3和13所示的Vh和 '序列），或單克隆抗體5F8 (具有分別如SEQ ID NO :4和14所示的Vh和 '序列），或單克隆抗體10H10 (具有分別如SEQ ID NO :5和15所示的Vh和八序列），或單克隆抗體1B12 (具有分別如SEQ ID NO :6和16 所示的Vh和 '序列），或單克隆抗體7H1 (具有分別如SEQ ID NO :7和17所示的Vh和 '序列），或單克隆抗體11E6 (具有分別如SEQ ID NO :8和18所示的Vh和 '序列），或單克隆抗體12B7 (具有分別如SEQ ID NO :9和19所示的Vh和八序列），或單克隆抗體13G4 (具有分別如SEQ ID NO: 10和20所示的V1^P'序列）。這些交叉競爭抗體可以根據它們在標準 PD-Ll 結合測定中與 3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7 或 13G4 交叉競爭的能力來鑒定。例如，可以利用BIAcore分析、ELISA測定或流式細胞分析來證明與本發明抗體的交叉競爭。被測試抗體抑制例如3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、 12B7或13G4與人I 3D-Ll結合的能力證明，該測試抗體可以與3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、 1812、7111、11￡6、1287或1364競爭結合人^)-11，因此所結合的人^)-11上的表位與3610、 12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7或13G4相同。在一個優選實施方案中，所結合的人 PD-Ll 上的表位與 3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7 或 13G4 相同的抗體是人單克隆抗體。這些人單克隆抗體可以如實施例所述制備和分離。
[0574] 工稈化抗體和修飾的抗體
[0575] 本發明的抗體進一步可以利用具有此處所公開的一種或多種Vh和/或\序列的抗體作為起始材料來制備，以構建一種修飾的抗體，該修飾的抗體相對于與起始抗體相比可以具有改變的特性。可以通過修飾一個或兩個可變區（即％和/或^例如一個或多個 CDR區內和/或一個或多個構架區內的一個或多個殘基來構建抗體。另外，或者，可以通過修飾恒定區內的殘基來構建抗體，例如改變該抗體的效應功能。
[0576] 可以進行的一種類型的可變區工程化是⑶R移植。抗體主要是通過位于六個重鏈和輕鏈互補決定區（CDR)中的氨基酸殘基與靶抗原相互作用。由于這個原因，CDR內的氨基酸序列比CDR外的序列在各個抗體之間更加多樣化。由于CDR序列負責大多數抗體-抗原相互作用，因此通過構建如下的表達載體能夠表達模擬特定天然存在抗體的特性的重組抗體：該表達載體包含來自特定天然存在抗體的⑶R序列，該⑶R序列被移植到來自具有不同特性的不同抗體的構架序列上（參見，例如，Riechmann，L.等（1998)Nature 332 :323-327 Jones，P?等（1986)Nature 321:522-525 ;Queen，C?等（1989)Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 :10029-10033 ;Winter 的美國專利 5, 225, 539,和 Queen 等的美國專利 5, 530, 101 ;5, 585, 089 ;5, 693, 762 和 6, 180, 370)。
[0577] 因此，本發明的另一個實施方案涉及一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括含⑶Rl、⑶R2和⑶R3序列的重鏈可變區，該⑶Rl、⑶R2和⑶R3序列分別包含選自 5￡〇10恥：21、22、23、24、25、26、27、28、29和30,5￡〇10從）：31、32、33、34、35、36、37、38、39 和 40,和 SEQ ID NO :41、42、43、44、45、46、47、48、49 和 50 的氨基酸序列，并且包括含 CDRl、 CDR2和CDR3序列的輕鏈可變區，該CDR1、CDR2和CDR3序列分別包含選自SEQ ID NO :51、 52、53、54、55、56、57、58、59和60,5￡01〇勵：61、62、63、64、65、66、67、68、69和70，和5￡0 ID勵：71、72、73、74、75、76、77、78、79和80的氨基酸序列。因此，這些抗體含有單克隆抗體3610、12八4、1(^5、5?8、101110、1812、7111、11￡6、1287或1364的￥ 11和'〇)1?序列，但是可能含有與這些抗體不同的構架序列。
[0578] 這些構架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數據庫或發表的參考文獻中獲得。例如，人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在以下資源中發現： "VBase"人種系序列數據庫（可從因特網上www. mrc~cpe. cam, ac. uk/vbase獲得），以及 Rabat, E. A.等(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版， U. S. Department of Health and Human Services,NIH出版號91-3242 ;Tomlinson, I. M?等 (1992)"The Repertoire of Human Germline Vh Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol.Biol. 227 :776-798;和 Cox, J. P. L?等（1994)''A Directory of Human Germ-line Vh Segments Reveals a Strong Bias in their Usage"Eur. J. Immunol. 24 :827-836 ;其內容均引入本文作為參考。
[0579] 使用本領域技術人員公知的一種被稱為缺口 BLAST(Altschul等（1997)Nucleic Acids Research 25:3389-3402)的序列相似性檢索方法，將抗體蛋白質序列與匯編的蛋白質序列數據庫進行比較。BLAST是一種啟發式算法，其中抗體序列和數據庫序列之間的統計學顯著性比對可能含有所比對的字句的高得分的片段對（HSP)。延伸或修剪不能提高其得分的片段對被稱為命中（hit)。簡要地說，翻譯VBASE來源的核苷酸序列（vbase. mrc-cpe. cam. ac. uk/vbasel/list2. php)，而保留FRl至FR3構架區之間并且包括該構架區的區域。數據庫數據的平均長度為98個殘基。除去在蛋白質全長上準確匹配的重復序列。使用程序blastp，除關閉的低復雜性過濾器和BL0SUM62置換矩陣以外應用缺省標準參數對蛋白質進行BLAST檢索，對于排名前5位的命中，過濾器產生序列匹配。在所有6個框架內的核苷酸序列都翻譯，在數據庫序列的匹配片段中沒有終止密碼子的框架被認為是潛在命中。然后使用BLAST程序tblastx進行證實。該程序翻譯所有6個框架內的抗體序列，并且比較其翻譯與在所有6個框架內動態翻譯的VBASE核苷酸序列。
[0580] 同一性是抗體序列和蛋白質數據庫之間在序列全長上的完全氨基酸匹配。陽性 (同一性+置換匹配）不同，但是氨基酸置換由BL0SUM62置換矩陣指導。如果抗體序列以相同的同一性匹配兩個數據庫序列，則陽性最強的命中被判斷為匹配序列命中。
[0581] 用于本發明抗體的優選構架序列在結構上類似于所選擇的本發明抗體使用的構架序列，例如，類似于本發明優選的單克隆抗體使用的V h 1-18構架序列（SEQ ID NO :101) 和/*VH 1-69 構架序列（SEQ ID NO: 102)和/或 Vh 1-3 構架序列（SEQ ID NO: 103)和 / *VH 3-9 構架序列（SEQ ID N0:104)和 / 或Vk L6 構架序列（SEQ ID N0:105)和/*VK L15 構架序列（SEQ ID NO :106)和 / 或 Vk A27 構架序列（SEQ ID NO :107)和 / 或 Vk L18 構架序列（SEQ ID NO : 107)。Vh CDRl、CDR 2 和 CDR 3 序列和 Vk CDRl、CDR 2 和 CDR 3 序列可以被移植到與該構架序列的來源種系免疫球蛋白基因具有相同序列的構架區上，或者 CDR序列可以被移植到與該種系序列相比含有一個或多個突變的構架區上。例如，已經發現，在某些情況中，將構架區內的殘基進行突變對于保持或增強抗體的抗原結合能力是有利的（參見,例如，Queen 等的美國專利 5, 530, 101 ;5, 585, 089 ;5, 693, 762 和 6, 180, 370)。
[0582] 另一種類型的可變區修飾是突變VjP /或Vk CDRUCDR2和/或CDR3區內的氨基酸殘基，從而改善目標抗體的一種或多種結合特性（例如親和力）。可以進行定點誘變或 PCR介導的誘變，以引入突變，對抗體結合的影響，或者其他目標功能特性，可以用此處所述和實施例中提供的體外或體內試驗來評價。優選引入（如上文所述的）保守修飾。這些突變可以是氨基酸置換、添加或缺失，但是優選置換。而且，一般改變⑶R區內的不超過1、2、 3、4或5個殘基。
[0583] 因此，在另一個實施方案中，本發明提供分離的抗-PD-Ll單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含的重鏈可變區含有：（a)V H CDRl區，其包含選自SEQ ID N0:21、22、23、24、 25、26、27、28、29和30的氨基酸序列，或與5￡01〇勵：21、22、23、24、25、26、27、28、29和30 相比具有1、2、3、4或5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(b) Vh OTR2區，其包含選自5￡01〇勵：31、32、33、34、35、36、37、38、39和40的氨基酸序列，或與5￡01〇勵：31、32、 33、34、35、36、37、38、39和40相比具有1、2、3、4或5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；（c)V H CDR3 區，其包含選自 SEQ ID 勵：41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的氨基酸序列，或與5￡0 1〇勵：41、42、43、44、45、46、47、48、49和50相比具有1、2、3、4或5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；（d)V K CDRl區，其包含選自SEQ ID N0:51、52、53、54、55、 56、57、58、59和60的氨基酸序列，或與5￡01〇勵：51、52、53、54、55、56、57、58、59和60相比具有1、2、3、4或5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(e) Vk OTR2區，其包含選自 5￡01〇勵：61、62、63、64、65、66、67、68、69和70的氨基酸序列，或與5￡01〇勵：61、62、63、 64、65、66、67、68、69和70相比具有1、2、3、4或5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；和（f)V K CDR3 區，其包含選自 SEQ ID 勵：71、72、73、74、75、76、77、78、79和80的氨基酸序列，或與5￡0 1〇勵：71、72、73、74、75、76、77、78、79和80相比具有1、2、3、4或5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列。
[0584] 本發明的工程化抗體包括例如為了改善抗體特性而對其Vh和/或Vk內的構架殘基進行了修飾的抗體。進行這樣的構架修飾一般是為了降低抗體的免疫原性。例如，一種方法是將一個或多個構架殘基"回復突變"為相應的種系序列。更特別地，經歷體細胞突變的抗體可含有與衍生該抗體的種系序列不同的構架殘基。通過比較抗體構架序列與衍生該抗體的種系序列，可以鑒定這些殘基。例如，如下所述，抗-PD-I抗體3G10、12A4、10A5、5F8、 10H10、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4的構架區中的大量氨基酸改變不同于親本種系序列。為了使構架區序列中的一個或多個氨基酸殘基恢復為其種系構型，可以通過（例如）定點誘變或PCR介導的誘變，將該體細胞突變"回復突變"為種系序列。3G10的V h區與親本種系VH1-18序列的比對顯示在圖11中。12A4的Vh區與親本種系V h 1-69序列的比對顯示在圖12中。10A5的Vh區與親本種系Vh 1-3序列的比對顯示在圖13中。5F8的Vh區與親本種系Vh 1-69序列的比對顯示在圖14中。IOHlO的Vh區與親本種系Vh 3-9序列的比對顯示在圖15中。川12的Vh區與親本種系Vh 1-69序列的比對顯示在圖16中。7H1的VHg 與親本種系Vh 1-69序列的比對顯示在圖17中。11E6的Vh區與親本種系Vh 1-69序列的比對顯示在圖18中。12B7的Vh區與親本種系Vh 1-69序列的比對顯示在圖19中。13G4 的Vh區與親本種系Vh 3-9序列的比對顯示在圖20中。
[0585] 例如，對于3G10, Vh的氨基酸殘基#79 (FR3內）是纈氨酸，而在相應的Vh 1-18種系序列中該殘基為丙氨酸。為了使構架區序列恢復為其種系構型，可以通過（例如）定點誘變或PCR介導的誘變，將該體細胞突變"回復突變"為種系序列（例如，3G10的V h的殘基 #79 (FR3的殘基#13)可以從纈氨酸"回復突變"為丙氨酸）。
[0586] 另一個例子是，對于12A4, Vh的氨基酸殘基#24(FR1內）是蘇氨酸，而在相應的 Vh 1-69種系序列中該殘基為丙氨酸。為了使構架區序列恢復為其種系構型，例如，可以將 12A4的Vh的殘基#24從蘇氨酸"回復突變"為丙氨酸。這種"回復突變"的抗體也包括在本發明內。
[0587] 另一個例子是，對于12A4, Vh的氨基酸殘基#27 (FR1內）是天冬氨酸，而在相應的 Vh 1-69種系序列中該殘基為甘氨酸。為了使構架區序列恢復為其種系構型，例如，可以將 12A4的Vh的殘基#27從天冬氨酸"回復突變"為甘氨酸。這種"回復突變"的抗體也包括在本發明內。
[0588] 另一個例子是，對于12A4, Vh的氨基酸殘基#95 (FR3內）是苯丙冬氨酸，而在相應的Vh 1-69種系序列中該殘基為酪氨酸。為了使構架區序列恢復為其種系構型，例如，可以將12A4的￥11的殘基#95(FR3的殘基#29)從苯丙氨酸"回復突變"為酪氨酸。這種"回復突變"的抗體也包括在本發明內。
[0589] 另一個例子是，對于5F8,氨基酸殘基#24 (FR1內）是纈氨酸，而在相應的Vh 1-69 種系序列中該殘基為丙氨酸。為了使構架區序列恢復為其種系構型，例如，可以將5F8的Vh 的殘基#24從纈氨酸"回復突變"為丙氨酸。這種"回復突變"的抗體也包括在本發明內。
[0590] 另一個例子是，對于5F8,氨基酸殘基#28 (FR1內）是異亮氨酸，而在相應的Vh 1-69種系序列中該殘基為蘇氨酸。為了使構架區序列恢復為其種系構型，例如，可以將5F8 的Vh的殘基#28從異亮氨酸"回復突變"為蘇氨酸。這種"回復突變"的抗體也包括在本發明內。
[0591] 另一個例子是，對于10H10,氨基酸殘基#24(FR1內）是纈氨酸，而在相應的Vh 3-9 種系序列中該殘基為丙氨酸。為了使構架區序列恢復為其種系構型，例如，可以將10H10的 Vh的殘基#24從纈氨酸"回復突變"為丙氨酸。這種"回復突變"的抗體也包括在本發明內。
[0592] 另一個例子是，對于10H10,可以在氨基酸殘基#97 (FR3內）后插入氨基酸。該氨基酸為纈氨酸。為了使構架區序列恢復為其種系構型，例如，可以將在10H10的Vh的殘基 #97之后插入的氨基酸"回復突變"，從而刪除該纈氨酸。這種"回復突變"的抗體也包括在本發明內。
[0593] 另一個例子是，對于1B12,氨基酸殘基#24(FR1內）是蘇氨酸，而在相應的Vh 1-69 種系序列中該殘基為丙氨酸。為了使構架區序列恢復為其種系構型，例如，可以將1B12的 Vh的殘基#24從蘇氨酸"回復突變"為丙氨酸。這種"回復突變"的抗體也包括在本發明內。
[0594] 另一個例子是，對于1B12,氨基酸殘基#27 (FR1內）是天冬氨酸，而在相應的Vh 1-69種系序列中該殘基為甘氨酸。為了使構架區序列恢復為其種系構型，例如，可以將 1B12的Vh的殘基#27從天冬氨酸"回復突變"為甘氨酸。這種"回復突變"的抗體也包括在本發明內。
[0595] 另一個例子是，對于1B12,氨基酸殘基#95 (FR3內）是苯丙氨酸，而在相應的Vh 1-69種系序列中該殘基為酪氨酸。為了使構架區序列恢復為其種系構型，例如，可以將 1B12的Vh的殘基#95 (FR3的殘基#29)從苯丙氨酸"回復突變"為酪氨酸。這種"回復突變"的抗體也包括在本發明內。
[0596] 另一個例子是，對于7H1，氨基酸殘基#24 (FR1內）是蘇氨酸，而在相應的Vh 1-69 種系序列中該殘基為丙氨酸。為了使構架區序列恢復為其種系構型，例如，可以將7H1的Vh 的殘基#24從蘇氨酸"回復突變"為丙氨酸。這種"回復突變"的抗體也包括在本發明內。
[0597] 另一個例子是，對于7H1，氨基酸殘基#77 (FR3內）是蘇氨酸，而在相應的Vh 1-69 種系序列中該殘基為絲氨酸。為了使構架區序列恢復為其種系構型，例如，可以將7H1的Vh 的殘基#72(FR3的殘基#11)從蘇氨酸"回復突變"為絲氨酸。這種"回復突變"的抗體也包括在本發明內。
[0598] 另一個例子是，對于11E6,氨基酸殘基#78(FR3內）是丙氨酸，而在相應的Vh 1-69 種系序列中該殘基為蘇氨酸。為了使構架區序列恢復為其種系構型，例如，可以將11E6的 Vh的殘基#78 (FR3的殘基12)從丙氨酸"回復突變"為蘇氨酸。這種"回復突變"的抗體也包括在本發明內。
[0599] 另一個例子是，對于12B7,氨基酸殘基#13 (FR1內）是谷氨酸，而在相應的Vh 1-69 種系序列中該殘基為賴氨酸。為了使構架區序列恢復為其種系構型，例如，可以將12B7的 Vh的殘基#13從谷氨酸"回復突變"為賴氨酸。這種"回復突變"的抗體也包括在本發明內。 [0600] 另一個例子是，對于12B7,氨基酸殘基#30 (FR1內）是天冬酰胺，而在相應的Vh 1-69種系序列中該殘基為絲氨酸。為了使構架區序列恢復為其種系構型，例如，可以將 12B7的Vh的殘基#30從天冬酰胺"回復突變"為絲氨酸。這種"回復突變"的抗體也包括在本發明內。
[0601] 另一個例子是，對于12B7,氨基酸殘基#77 (FR3內）是天冬酰胺，而在相應的Vh 1-69種系序列中該殘基為絲氨酸。為了使構架區序列恢復為其種系構型，例如，可以將 12B7的Vh的殘基#377 (FR3的殘基11)從天冬酰胺"回復突變"為絲氨酸。這種"回復突變"的抗體也包括在本發明內。
[0602] 另一個例子是，對于12B7,氨基酸殘基#82 (FR3內）是天冬氨酸，而在相應的Vh 1-69種系序列中該殘基為谷氨酸。為了使構架區序列恢復為其種系構型，例如，可以將 12B7的Vh的殘基#82 (FR3的殘基#16)從天冬氨酸"回復突變"為谷氨酸。這種"回復突變"的抗體也包括在本發明內。
[0603] 另一個例子是，對于13G4,氨基酸殘基#27 (FR1內）是異亮氨酸，而在相應的Vh 1-69種系序列中該殘基為苯丙氨酸。為了使構架區序列恢復為其種系構型，例如，可以將 12B7的Vh的殘基#27從異亮氨酸"回復突變"為苯丙氨酸。這種"回復突變"的抗體也包括在本發明內。
[0604] 另一種類型的構架修飾涉及對構架區內、乃至一個或多個CDR區內的一個或多個殘基進行突變，以除去T細胞表位，從而降低該抗體的潛在的免疫原性。該方法也被稱為 "脫免疫"，在Carr等的公布號為20030153043的美國專利中詳細記載。
[0605] 除了在構架區或CDR區內進行的修飾以外，或者作為它的替代方案，也可以將本發明的抗體改造為在Fc區內包括修飾，一般是為了改變該抗體的一種或多種功能特性，如血清半衰期、補體固定、Fc受體結合和/或抗原依賴性細胞毒性。此外，也可以將本發明的抗體化學修飾（例如一個或多個化學部分可以連接到該抗體上），或者修飾改變其糖基化，以改變該抗體的一種或多種功能特性。這些實施方案均在下文詳細描述。Fc區中殘基的編號是Kabat的EU指數的編號。
[0606] 在一個實施方案中，修飾CHl的鉸鏈區，使該鉸鏈區中半胱氨酸殘基的數目改變，例如增加或減少。該方法在Bodmer等的美國專利No. 5, 677, 425號中詳細記載。改變CHl 鉸鏈區中半胱氨酸的數目是為了（例如）促進輕鏈和重鏈的裝配，或提高或降低抗體的穩定性。
[0607] 在另一實施方案中，對抗體的Fc鉸鏈區進行突變，以降低該抗體的生物半衰期。更具體地，向Fc-鉸鏈片段的CH2-CH3結構域界面區引入一個或多個氨基酸突變，使得該抗體與葡萄球菌蛋白A(SpA)的結合比天然Fc-鉸鏈結構域與SpA的結合減弱。該方法在 Ward等的美國專利No. 6, 165, 745號中詳細記載。
[0608] 在另一實施方案中，修飾抗體以提高其生物半衰期。可以使用各種方法。例如，如 Ward的美國專利No. 6, 277, 375所述，可以引入一個或多個如下突變：T252L、T254S、T256F。或者，如Presta等的美國專利No. 5, 869, 046和6, 121，022所述，為了提高生物半衰期，該抗體可以在CHl或CL區內進行改變，使之含有來自IgG Fc區CH2結構域的兩個環的補救受體結合表位。
[0609] 在其他一些實施方案中，通過將至少一個氨基酸殘基置換為不同的氨基酸殘基來改變Fc區，以改變抗體的效應功能。例如，可以將選自氨基酸殘基234、235、236、237、297、 318、320、322的一個或多個氨基酸置換為不同的氨基酸殘基，使得該抗體對效應配體的親和力改變，但是保留親本抗體的抗原結合能力。其親和力被改變的效應配體可以是，例如， Fc受體或補體的Cl成分。該方法在Winter等的美國專利No. 5, 624, 821和5, 648, 260中更詳細地描述。
[0610] 在另外一個實施例中，可以將選自氨基酸殘基329、331和322的一個或多個氨基酸置換為不同的氨基酸殘基，使得該抗體的Clq結合改變和/或補體依賴性細胞毒性（CDC) 降低或消除。該方法在Idusogie等的美國專利No. 6, 194, 551中更詳細地描述。
[0611] 在另外一個實施例中，改變氨基酸位點231和239中的一個或多個氨基酸殘基，從而改變該抗體固定補體的能力。該方法在Bodmer等的PCT公布WO 94/29351中進一步描述。
[0612] 在另外一個實施例中，為了提高抗體介導抗體依賴性細胞毒性（ADCC)的能力和/ 或提高抗體對Fe Y受體的親和力，通過在下列位點處修飾一個或多個氨基酸來修飾Fc區： 238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、 285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、 324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、 398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。該方法在？代8七&的？(：1'公布冊 00/42072 中進一步描述。而且，人IgGl上對于Fe Y RI、Fe Y RII、Fe Y RIII和FcRn的結合位點已經作圖，并且已經描述了具有改善的結合的變體（參見，Shields，R.L.等（2001) J. Biol. Chem. 276 :6591-6604)。位點 256、290、298、333、334 和 339 處的特定突變顯示改善了與 FcYRIII的結合。另外，下列組合突變體顯示改善了與FcYRIII的結合：T256A/S298A， S298A/E333A，S298A/K224A 和 S298A/E333A/K334A。
[0613] 在另一實施方案中，修飾抗體的糖基化。例如，可以制備無糖基化的抗體（即該抗體缺乏糖基化）。例如，為了提高抗體對抗原的親和力，可以改變糖基化。這樣的碳水化合物修飾可以通過（例如）改變抗體序列內的一個或多個糖基化位點來實現。例如，可以進行一個或多個氨基酸置換，使一個或多個可變區構架糖基化位點消失，從而消除該位點處的糖基化。這種無糖基化可以提高抗體對抗原的親和力。這種方法在Co等的美國專利 No. 5, 714, 350和6, 350, 861中更詳細地描述。
[0614] 在某些其他實施方案中，可以制備糖基化類型改變的抗體，如巖藻糖基殘基數目減少的低巖藻糖基化抗體，或等分GlcNac結構增多的抗體。已經證明這種改變的糖基化模式提高了抗體的ADCC能力。這種碳水化合物修飾可以通過（例如）在糖基化機制改變的宿主細胞中表達抗體來實現。糖基化機制改變的細胞在本領域中已有描述，能夠用作宿主細胞，在其中表達本發明的重組抗體，從而產生糖基化改變的抗體。例如，細胞系Ms704、Ms705 和Ms709缺乏巖藻糖基轉移酶基因，FUT8(a (1，6)巖藻糖基轉移酶基因），因此在Ms704、 Ms705和Ms709細胞系中表達的抗體在它們的碳水化合物中缺乏巖藻糖。通過使用兩種替代載體定向破壞CH0/DG44細胞中的FUT8基因，產生Ms704、Ms705和Ms709FUT8+細胞系 (參見 Yamane 等的美國專利申請 No. 20040110704 和 Yamane-Ohnuki 等?（2004) Biotechnol Bioeng 87 :614-22)。另一個例子是，Hanai等的EP 1，176, 195描述了具有功能破壞的 FUT8基因的細胞系，該基因編碼巖藻糖轉移酶，由于減少或消除了 a (1，6)鍵相關的酶，在這種細胞系中表達的抗體表現為低巖藻糖基化。Hanai等也描述了用于向結合抗體Fc區的 N-乙酰葡萄糖胺上添加巖藻糖的酶活性低或不具有酶活性的細胞系，例如大鼠骨髓瘤細胞系 YB2/0(ATCC CRL 1662)。Presta 的 PCT 公布 WO 03/035835 記載了一種變異 CHO 細胞系， Lecl3細胞，其將巖藻糖連接到Asn (297)-連接的碳水化合物上的能力降低，也導致在該宿主細胞中表達的抗體為低巖藻糖基化（參見，Shields，R.L.等（2001) J. Biol. Chem. 277 : 26733-26740)。Umana等的PCT公布WO 99/54342記載了表達糖蛋白修飾的糖基轉移酶 (例如Ml，4)-N-乙酰葡糖氨基轉移酶III(GnTIIl))的工程化細胞系，因此該工程化細胞系中表達的抗體表現為等分GlcNac結構增加，導致抗體的ADCC活性提高（參見，Umana 等（1999)Nat. Biotech. 17 :176-180)。此外，抗體的巖藻糖殘基可以用巖藻糖苷酶切下。例如，巖藻糖苷酶〇-1-巖藻糖苷酶從抗體上除去巖藻糖殘基0^代拉111 〇，尤1.等.（1975) Biochem. 14 :5516-23)。
[0615] 本發明涉及的對此處所述抗體的另一種修飾是PEG化。例如，為了提高抗體的生物（例如血清）半衰期，可以將該抗體PEG化。為了 PEG化一種抗體，一般在一個或多個 PEG基團與抗體或抗體片段連接的條件下，將該抗體或其片段與聚乙二醇（PEG)如PEG的反應性酯或醒衍生物反應。優選地，通過與反應性PEG分子（或類似的反應性水溶性聚合物）的酰化反應或烷基化反應進行PEG化。本文使用的術語"聚乙二醇"包括用來衍生化其他蛋白質的任何PEG形式，如單（Cl-ClO)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-馬來酰亞胺。在某些實施方案中，將要PEG化的抗體是一種無糖基化的抗體。將蛋白質PEG化的方法在本領域中公知，并且可以用于本發明的抗體。參見,例如，Nishimura等的EP 0 154 316 和 Ishikawa 等的 EP 0 401 384。
[0616] 抗體工稈化方法
[0617] 如上所述，能夠利用具有此處公開的V1^P Vk序列的抗-PD-Ll抗體，通過修飾Vh 和/或\序列或與之連接的恒定區，產生新的抗-PD-Ll抗體。因此，在本發明的另一方面，利用本發明的抗-PD-Ll 抗體（例如 3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7 或 13G4)的結構特征，產生結構上相關的抗-PD-Ll抗體，該結構上相關的抗體保留本發明抗體的至少一種功能特性，如與人I 3D-Ll結合。如上所述，例如，3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、 1B12、7H1、11E6、12B7或13G4的一個或多個⑶R區或其突變可以與已知的構架區和/或其他⑶R重組組合，從而產生另外的重組工程化的本發明的抗-PD-Ll抗體。其他類型的修飾包括以上部分所述的修飾。用于工程化方法的起始材料是此處提供的一種或多種％和/或 V k序列，或其一個或多個CDR區。為了產生工程化抗體，不一定必須實際制備（即表達為蛋白質）具有此處提供的一種或多種Vj^P/*V K序列，或其一個或多個CDR區的抗體。而是用該序列中所含的信息作為起始材料，產生由原始序列衍生的"第二代"序列，然后制備該 "第二代"序列，并將其表達為蛋白質。
[0618] 因此，在另一實施方案中，本發明提供一種制備抗-PD-Ll抗體的方法，包括：
[0619] (a)提供：（i)重鏈可變區抗體序列，其包含選自SEQ ID NO :21、22、23、24、25、26、 27、28、29 和 30 的 CDRl 序列、選自 SEQ ID NO :31、32、33、34、35、36、37、38、39和40的〇?2 序列、和 / 或選自 SEQ ID NO :41、42、43、44、45、46、47、48、49 和 50 的 CDR3 序列；和 / 或 (ii)輕鏈可變區抗體序列，其包含選自SEQ ID勵：51、52、53、54、55、56、57、58、59和60的 CDRl 序列、選自 SEQ ID NO :61、62、63、64、65、66、67、68、69 和 70 的 CDR2 序列、和 / 或選自 SEQ ID NO :71、72、73、74、75、76、77、78、79 和 80 的 CDR3 序列；
[0620] (b)改變重鏈可變區抗體序列和/或輕鏈可變區抗體序列內的至少一個氨基酸殘基，從而產生至少一個改變的抗體序列；和
[0621] (C)將該改變的抗體序列表達為蛋白質。
[0622] 可以利用標準分子生物學技術制備和表達所述改變的抗體序列。
[0623] 優選地，由改變的抗體序列編碼的抗體保留此處所述抗-PD-Ll抗體的一種、一些或全部功能特性，該功能特性包括但不限于：
[0624] ⑴以I X KT7M或更低的Kd與人PD-Ll結合；
[0625] (ii)在混合淋巴細胞反應（MLR)試驗中提高T細胞增殖；
[0626] (iii)在MLR試驗中提高干擾素1產生；
[0627] (iv)在MLR試驗中提高IL-2分泌；
[0628] (v)刺激抗體應答；和/或
[0629] (Vi)逆轉T調節細胞對T細胞效應細胞和/或樹突細胞的作用。
[0630] 改變的抗體的功能特性可以用本領域中使用的和/或此處所述的（如實施例中所述的）標準試驗（例如流式細胞術、結合測定）來評價。
[0631] 在本發明抗體的工程化方法的某些實施方案中，可以沿全部或部分抗-PD-Ll抗體編碼序列隨機或選擇性引入突變，并可以針對結合活性和/或如此處所述的其他功能特性，篩選獲得的修飾的抗-PD-Ll抗體。突變方法在本領域中已經描述。例如，Short的PCT 公布WO 02/092780記載了利用飽和誘變、合成連接裝配或它們的組合產生和篩選抗體突變的方法。另外，Lazar等的PCT公布WO 03/074679也記載了利用計算篩選方法優化抗體的生理化學性質的方法。
[0632] 編碼本發明的抗體的核酸分子
[0633] 本發明的另一方面涉及編碼本發明的抗體的核酸分子。該核酸可以存在于完整細胞、細胞裂解物中，或以部分純化或基本上純的形式存在。當通過包括堿/SDS處理、CsCl 顯帶、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳在內的標準技術和本領域公知的其他方法與其他細胞成分或其他污染物（例如其他細胞核酸或蛋白質）分離純化時，核酸是"分離的"或"基本上純的，'。參見，F. Ausubel 等 ed. (1987)Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York。本發明的核酸可以是例如 DNA 或 RNA, 并且可以含有或者可以不含內含子序列。在一個優選實施方案中，該核酸是cDNA分子。
[0634] 本發明的核酸可以利用標準分子生物學技術獲得。對于雜交瘤（例如，由如下文進一步描述的攜帶人免疫球蛋白基因的轉基因小鼠制備的雜交瘤）表達的抗體，編碼由雜交瘤制備的抗體輕鏈和重鏈的cDNA可以用標準PCR擴增或cDNA克隆技術獲得。對于從免疫球蛋白基因文庫中獲得的抗體（例如使用噬菌體展示技術），可以從文庫中回收編碼該抗體的一種或多種核酸。
[0635] 本發明優選的核酸分子是編碼 3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7 和13G4單克隆抗體的'序列的核酸分子。編碼3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、 7111、1比6、1287和1364的￥ 11序列的〇嫩序列分別在5￡0 1〇勵：81、82、83、84、85、86、87、 88、89 和 90 中示出。編碼 3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7 和 13G4 的' 序列的 DNA 序列分別在 SEQ ID N0:91、92、93、94、95、96、97、98、99 和 100 中示出。
[0636] -旦獲得編碼Vh和 '片段的DNA片段，即可通過標準重組DNA技術進一步操作這些DNA片段，例如將可變區基因轉化為全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在這些操作中，編碼\或V h的DNA片段與編碼另外一種蛋白質如抗體恒定區或柔性連接體的另一個DNA片段有效連接。如本文使用的術語"有效連接"意思是兩個DNA片段連接在一起，使得這兩個DNA片段編碼的氨基酸序列保持符合閱讀框。
[0637] 通過將編碼Vh的DNA與編碼重鏈恒定區（CHI、CH2和CH3)的另外一種DNA分子有效連接，可以將分離的編碼V h區的DNA轉化為全長重鏈基因。人重鏈恒定區基因的序列在本領域中公知（參見，例如，Kabat，E. A?等（1991) Sequences of Proteins of Immunologicl Interest,第五版，U. S. Department of Health and Human Services, NIH 出版號91-3242)，包括這些區域的DNA片段可以通過標準PCR擴增獲得。重鏈恒定區可以是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定區，但是最優選的是IgGl或IgG4恒定區。對于Fab片段重鏈基因，編碼Vh的DNA可以與只編碼重鏈CHl恒定區的另外一種DNA 分子有效連接。
[0638] 通過將編碼 '的DNA與編碼輕鏈恒定區CL的另外一種DNA分子有效連接，可以將分離的編碼'區的DNA轉化為全長輕鏈基因（以及Fab輕鏈基因）。人輕鏈恒定區基因的序列在本領域中公知（參見，例如，5^匕&1：，￡.4.等（1991)36911611068〇1^?1'(^6；[11801^ Immunologicl Interest,第五版，U. S. Department of Health and Human Services, NIH 出版號91-3242)，包括這些區域的DNA片段可以通過標準PCR擴增獲得。在優選的實施方案中，輕鏈恒定區可以是K或A恒定區，但最優選地是 K恒定區。
[0639] 為了產生scFv基因，將編碼VdP '的DNA片段與編碼柔性連接體例如編碼氨基酸序列（Gly4-Ser) 3的另外一個片段有效連接，使得Vh和'序列可以表達為連續的單鏈蛋白質，其'和V h區通過該柔性連接體連接（參見，例如Bird等（1988) Science 242 :423-426 ; Huston 等（1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879-5883 ;McCafTerty 等（1990)Nature 348 :552-554)〇
[0640] 本發明的單克降抗體的產牛
[0641] 本發明的單克隆抗體（mAb)能夠通過多種技術制備，包括常規的單克隆抗體方法，例如，Kohler和Milstein (1975)Nature 256 :495所述的標準體細胞雜交技術。雖然優選體細胞雜交技術，但是原則上，能使用制備單克隆抗體的其他技術，例如B淋巴細胞的病毒或致癌轉化。
[0642] 用于制備雜交瘤的優選的動物系統是鼠系統。用小鼠產生雜交瘤是一種完善建立的程序。免疫程序和分離用于融合的被免疫脾細胞的技術是本領域公知的。融合配偶體 (例如鼠骨髓瘤細胞）和融合程序也是公知的。
[0643] 本發明的嵌合或人源化抗體可以基于如上所述獲得的鼠單克隆抗體的序列來制備。編碼重鏈和輕鏈免疫球蛋白的DNA可以從目標鼠雜交瘤中獲得，并且使用標準分子生物學技術將其改造為含有非鼠（例如人類）免疫球蛋白序列。例如，為了產生嵌合抗體，可以利用本領域公知的方法將鼠可變區連接到人恒定區上（參見，例如，Cabilly等的美國專利No. 4, 816, 567)。為了產生人源化抗體，可以利用本領域公知的方法將鼠CDR 區插入人構架內（參見，例如，Winter的美國專利No. 5, 225, 539,和Queen等的美國專利 No. 5, 530, 101 ;5, 585, 089 ;5, 693, 762 和 6, 180, 370)。
[0644] 在一個優選實施方案中，本發明的抗體是人單克隆抗體。這種抗I3D-Ll人單克隆抗體能用攜帶部分人免疫系統而不是小鼠系統的轉基因或轉染色體小鼠產生。這些轉基因和轉染色體小鼠包括在此分別被稱作HuMab小鼠和KM小鼠?的小鼠，并且在此通稱為"人 Ig小鼠"。
[0645] HuMab小鼠? (Medarex, Inc.)包含編碼未重排的人重鏈（ii和Y)和K輕鏈免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座，和使內源U和K鏈基因座失活的定向突變 (參見，例如，Lonberg等（1994)Nature 368(6474) :856-859)。因此，該小鼠表現為小鼠 IgM或K表達降低，并且響應于免疫，導入的人重鏈和輕鏈轉基因經歷類別轉換和體細胞突變，從而產生高親和力人IgG K單克隆抗體（Lonberg，N?等（1994)，同上；綜述Lonberg, N. (1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113 :49-101;Lonberg,N. ^PHuszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 :65-93,和 Harding, F?和 Lonberg，N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci 764 :536-546)。HuMab小鼠的制備和使用，以及該小鼠攜帶的基因組修飾，在下面的文獻中詳細描述：Taylor，L?等（1992)Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen，J?等（1993)International Immunology 5 :647-656 ;Tuaillon 等（1993)Proc. Natl. Acad. Sci USA 90 :3720-3724 ;Choi 等（1993)Nature Genetics 4:117-123 ;Chen，J?等 (1993)EMB0 J. 12 :82卜830 ;Tuaillon 等（1994)J. Immunol. 152:2912-2920;Taylor， L?等（1994) International Immunology 6 :579-591;和 Fishwild，D?等（1996)Nature Biotechnology 14 :845-851,這些文獻的內容全文引入本文作為參考。進一步參見， Lonberg 和 Kay 的美國專利 No. 5, 545, 806 ;5, 569, 825 ;5, 625, 126 ;5, 633, 425 ;5, 789, 650 ; 5, 877, 397 ;5, 661，016 ;5, 814, 318 ;5, 874, 299 ;和 5, 770, 429 ;和 Surani 等的美國專利 No. 5, 545, 807 ;Lonberg 和 Kay 的 PCT 公布號 WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, TO 98/24884 和 TO 99/45962 ;和 Korman 等的 PCT 公布號 TO 01/14424。
[0646] 在另一實施方案中，可以用轉基因和轉染色體上攜帶人免疫球蛋白序列的小鼠，例如攜帶人重鏈轉基因和人輕鏈轉染色體的小鼠，產生本發明的人抗體。這種小鼠在此被稱為"KM小鼠?"，在Ishida等的PCT公布WO 02/43478中詳細描述。
[0647] 再者，表達人免疫球蛋白基因的替代轉基因動物系統在本領域中可以獲得，能夠用來產生本發明的抗-PD-Ll抗體。例如，可以使用一種被稱作Xenomouse (Abgenix， Inc.)的替代轉基因系統，這種小鼠在例如Kucherlapati等的美國專利No. 5, 939, 598 ; 6, 075, 181 ;6, 114, 598 ;6, 150, 584 和 6, 162, 963 中描述。
[0648] 而且，表達人免疫球蛋白基因的替代轉染色體動物系統在本領域中可以獲得，能夠用來產生本發明的抗-PD-Ll抗體。例如，可以使用攜帶人重鏈轉染色體和人輕鏈轉染色體的小鼠，其被稱作"TC小鼠"；這種小鼠在Tomizuka等（2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 :722-727中描述。另外，本領域中已經描述了攜帶人重鏈和輕鏈轉染色體的牛（Kuroiwa 等（2002)Nature Biotechnology 20:889-894)，其能夠用來產生本發明的抗-PD-Ll抗體。
[0649] 本發明的人單克隆抗體也可以使用用于篩查人免疫球蛋白基因文庫的噬菌體展示方法制備。這種用于分離人抗體的噬菌體展示方法在本領域中已經建立。參見，例如，Ladner 等的美國專利 No. 5, 223, 409 ;5, 403, 484 ;和 5, 571，698 ;Dower 等的美國專利 No. 5, 427, 908 和 5, 580, 717 ;McCafferty 等的美國專利 No. 5, 969, 108 和 6, 172, 197 ;和 Griffiths 等的美國專利 No. 5, 885, 793 ;6, Ml, 404 ;6, 544, 73I ;6, 555, 3I3 ;6, 582, 9I3O, 31，32, 33, 34, 35 和 36, 593, 081。
[0650] 本發明的人單克隆抗體也可以用SCID小鼠制備，該SCID小鼠中重構了人免疫細胞，因此在免疫時能夠產生人抗體應答。這種小鼠在例如Wilson等的美國專利 No. 5, 476, 996 和 5, 698, 767 中描述。
[0651] 人Ig小鼠的免疫
[0652] 當使用人Ig小鼠產生本發明的人抗體時，根據Lonberg，N.等（1994)Nature 368(6474) :856-859 ;Fishwild，D?等（1996)Nature Biotechnology 14 :845-851 JPPCT 公布WO 98/24884和WO 01/14424所述，用純化的或富集的H)-L1抗原和/或重組H)-L1 或F1D-Ll融合蛋白的制劑免疫該小鼠。優選地，第一次輸注時小鼠為6-16周齡。例如，可以使用純化的或重組的I 3D-Ll抗原的制劑（5-50 ii g)腹膜內免疫人Ig小鼠。
[0653] 產生抗H)-L1完全人單克隆抗體的詳細程序在下面的實施例1中描述。應用各種抗原積累的經驗證明，當最初使用弗氏完全佐劑中的抗原腹膜內（IP)免疫，接著隔周用弗氏不完全佐劑中的抗原腹膜內免疫（最多共六次）時，轉基因小鼠產生應答。但是，發現弗氏佐劑之外的佐劑也是有效的。另外，發現在沒有佐劑時，全細胞具有高度免疫原性。在免疫方案進程中用眼眶后取血獲得的血漿樣品監測免疫應答。通過ELISA(如下所述）篩選血漿，用具有足夠抗-PD-Ll人免疫球蛋白效價的小鼠進行融合。用抗原對小鼠進行靜脈內加強免疫，3天后處死并且取出脾臟。預期每次免疫可能需要2-3次融合。每一種抗原一般免疫6-24只小鼠。通常HCo7和HCol2系都使用。另外，HCo7和HCol2轉基因可以雜交，產生具有兩種不同人重鏈轉基因（HC 〇7/HC〇12)的一種小鼠。可替代地或者另外，如實施例 1所述，可以使用KM小鼠?系。
[0654] 產牛本發明的人單克降抗體的雜奪瘤的制各
[0655] 為了制備產生本發明的人單克隆抗體的雜交瘤，從被免疫的小鼠中分離脾細胞和 /或淋巴結細胞，并且與合適的無限增殖化細胞系（例如小鼠骨髓瘤細胞系）融合。根據抗原特異性抗體的產生篩選得到的雜交瘤。例如，可以使用50% PEG，將來自被免疫小鼠的脾淋巴細胞的單細胞懸液與六分之一數量的P3X63-Ag8. 653非分泌小鼠骨髓瘤細胞（ATCC， CRL 1580)融合。將細胞以大約2X IO5的密度接種于平底微量滴定板中，接著在含有20% 胎克隆血清，18%"653"條件基質，5%〇1^611(16￡沁，411111-谷氨酰胺，11111丙酮酸鈉，51111 HEPES，0. 055mM 2-巰基乙醇，50單位/毫升青霉素，50mg/ml鏈霉素，50mg/ml慶大霉素和 lXHAT(Sigma;融合后24小時加入HAT)的選擇性培養基中溫育兩周。大約兩周之后，在用 HT替換了 HAT的培養基中培養細胞。然后通過ELISA根據人單克隆IgM和IgG抗體篩選各孔。一旦發生廣泛的雜交瘤生長，則通常在10-14天之后觀察培養基。將分泌抗體的雜交瘤再次平板接種，再次篩選，如果對于人IgG仍然是陽性，則可以通過有限稀釋將單克隆抗體至少亞克隆兩次。然后體外培養穩定的亞克隆，以在組織培養基中產生少量抗體用于表征。
[0656] 為了純化人單克隆抗體，選擇的雜交瘤可以在用于單克隆抗體純化的兩升旋轉搖瓶中生長。過濾上清液，濃縮，之后用蛋白A-sepharose (Pharmacia, Piscataway，N. J.)進行親和層析。洗脫下來的IgG通過凝膠電泳和高效液相色譜法檢查以確保純度。將緩沖溶液換成PBS，用1. 43的消光系數根據0D280確定濃度。可將單克隆抗體分成等份并且在-80°C下保存。
[0657] 產牛本發明的單克降抗體的轉染瘤的制各
[0658] 利用（例如）本領域公知的重組DNA技術和基因轉染方法的組合（例如， Morrison，S. (1985)science 229:1202)，也能在宿主細胞轉染瘤中產生本發明的抗體。
[0659] 例如，為了表達抗體或其抗體片段，可通過標準分子生物學技術（例如，使用表達目標抗體的雜交瘤進行PCR擴增或cDNA克隆），獲得編碼部分或全長輕鏈和重鏈的DNA，并將該DNA插入到表達載體中，使得基因與轉錄和翻譯控制序列有效連接。在上下文中，術語 "有效連接"意思是抗體基因連接到載體中，使得載體中的轉錄和翻譯控制序列發揮它們調節該抗體基因的轉錄和翻譯的預期功能。選擇與所用的表達宿主細胞相匹配的表達載體和表達控制序列。抗體輕鏈基因和抗體重鏈基因可被插入到分開的載體中，或者，更通常地，將兩個基因插入到同一表達載體中。通過標準方法將抗體基因插入到表達載體中（例如，抗體基因片段上的互補限制性位點與載體連接，或者如果不存在限制性位點的活，則平端連接）。通過插入到已經編碼期望的同種型的重鏈恒定區和輕鏈恒定區的表達載體中，使得 Vh區段與載體中的C h區段有效連接，而Vk區段與載體中的Q區段有效連接，可以利用本文描述的抗體的輕鏈和重鏈可變區產生任意抗體同種型的全長抗體基因。另外，或者可替代地，重組表達載體能編碼有利于宿主細胞分泌抗體鏈的信號肽。可將抗體鏈基因克隆到載體中，使得信號肽與該抗體鏈基因的氨基末端符合閱讀框地連接。信號肽可以是免疫球蛋白信號肽或異源信號肽（即，來自非免疫球蛋白的蛋白質的信號肽）。
[0660] 除了抗體鏈基因，本發明的重組表達載體還帶有控制該抗體鏈基因在宿主細胞中表達的調節序列。術語"調節序列"包括啟動子、增強子和控制抗體鏈基因轉錄或翻譯的其他表達控制元件（例如，多腺苷酸化信號）。這樣的調節序列例如在Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego， CA(1990))中描述。本領域技術人員應當理解，表達載體的設計，包括調節序列的選擇，取決于諸如要轉化的宿主細胞的選擇、期望的蛋白質表達水平等因素。用于哺乳動物宿主細胞表達的優選調節序列包括指導蛋白質在哺乳動物細胞中高水平表達的病毒元件，例如來源于巨細胞病毒（CMV)、猿病毒40 (SV40)、腺病毒（例如，腺病毒主要晚期啟動子（AdMLP))和多瘤病毒的啟動子和/或增強子。可替代地可以使用非病毒調節序列，例如泛蛋白啟動子或珠蛋白啟動子。另外，調節元件也可由來自諸如SRa啟動子系統等不同來源的序列組成，SRa啟動子系統含有來自SV40早期啟動子的序列和人1型T細胞白血病病毒的長末端重復序列（Takebe，Y?等（1988)Mol. Cell. Biol. 8:466-472)。
[0661] 除了抗體鏈基因和調節序列以外，本發明的重組表達載體還可以攜帶另外的序列，例如調節載體在宿主細胞中復制的序列（例如，復制起點）和選擇性標記基因。選擇性標記基因有利于篩選載體已經導入其中的宿主細胞（參見，例如，Axel等的美國專利 No. 4, 399, 216,4, 634, 665和5, 179, 017)。例如，選擇性標記基因一般給已經導入載體的宿主細胞帶來抗藥性，例如G418、潮霉素或氨甲喋呤抗性。優選的選擇性標記基因包括二氫葉酸還原酶（DHFR)基因（在dhfr-宿主細胞中用于氨甲喋呤選擇/擴增）和neo基因（用于G418選擇）。
[0662] 為了表達輕鏈和重鏈，通過標準技術將編碼重鏈和輕鏈的表達載體轉染到宿主細胞中。術語"轉染"的各種形式包括常用于將外源DNA導入原核或真核宿主細胞中的各種技術，例如，電穿孔、磷酸鈣沉淀、DEAE-葡聚糖轉染等等。雖然在理論上可以在原核或真核宿主細胞中表達本發明的抗體，但是優選在真核細胞中，最優選在哺乳動物宿主細胞中表達該抗體，因為這樣的真核細胞，特別是哺乳動物細胞，比原核細胞更可能組裝和分泌正確折疊并且具有免疫活性的抗體。據報道，原核表達抗體基因無法高產率地產生活性抗體 (Boss，M. A?和 Wood，C.R. (1985) Immunology Today 6:12-13)。
[0663] 用于表達本發明的重組抗體的優選哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢（CH0細胞）（包括 Urlaub 和 Chasin，（1980)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 :4216-4220 中描述的 dhfr-CHO細胞，和DHFR選擇性標記一起使用，例如，如R. J. Kaufman和P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159 :601-621所述）、NS0骨髓瘤細胞、COS細胞和SP2細胞。特別地，用于NSO骨髓瘤細胞的另一種優選表達系統是WO 87/04462、W0 89/01036和EP 338, 841公開的GS基因表達系統。當將編碼抗體基因的重組表達載體導入哺乳動物宿主細胞中時，通過將宿主細胞培養足以使抗體在宿主細胞中表達的時間，或更優選地，培養足以使抗體分泌到宿主細胞生長的培養基中的時間，而產生抗體。可應用標準蛋白質純化方法從培養基中回收抗體。
[0664] 抗體與抗原結合的表征
[0665] 通過（例如）標準ELISA，可以檢測本發明的抗體與H)-L1的結合。簡要地說，用 0. 25 ii g/ml的純化H)-L1在PBS中的溶液包被微量滴定板，然后用PBS中的5 %牛血清白蛋白封閉。向各個孔中加入抗體的稀釋液（例如，來自PD-Ll免疫小鼠的血漿的稀釋液），并且在37°C下溫育1-2小時。用PBS/Tween洗滌培養板，之后和與堿性磷酸酶偶聯的第二試劑（例如，對于人抗體，為山羊抗人IgG Fc特異性多克隆試劑）一起在37°C下溫育1小時。洗滌后，培養板用PNPP底物（lmg/ml)顯色，并且在OD 405-650下分析。優選地，用表現出最高效價的小鼠進行融合。
[0666] 如上所述的ELISA分析也可以用來篩選表現出與H)-L1免疫原有陽性反應性的雜交瘤。將與ro-Li高親合力結合的雜交瘤進行亞克隆，并且進一步表征。從每個雜交瘤中選擇保留母細胞反應性的一個克隆（通過ELISA)，制備5-10小瓶細胞庫，保存在-140°C下，用于抗體純化。
[0667] 為了純化抗-PD-Ll抗體，選擇的雜交瘤在用于單克隆抗體純化的兩升旋轉搖瓶中生長。過濾上清液并且濃縮，然后用蛋白A-sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ)進行親和層析。通過凝膠電泳和高效液相色譜檢查洗脫的IgG以確保純度。將緩沖溶液換成 PBS，并且使用1. 43的消光系數根據OD28tl確定濃度。將單克隆抗體分成等份并且在-80°C 下保存。
[0668] 為了確定選擇的抗-PD-Ll單克隆抗體是否與獨特表位結合，可以使用商售試劑 (Pierce，Rockford，IL)將每種抗體生物素化。可以使用如上所述的H)-L1包被的ELISA 板，應用未標記的單克隆抗體和生物素化單克隆抗體進行競爭研究。可以使用鏈霉抗生物素蛋白-堿性磷酸酶探針檢測生物素化mAb的結合。
[0669] 為了確定被純化的抗體的同種型，可以用對特定同種型抗體具有特異性的試劑進行同種型ELISA。例如，為了確定人單克隆抗體的同種型，在4°C下用I y g/ml抗人免疫球蛋白包被微量滴定板的孔過夜。用1% BSA封閉之后，平板與I y g/ml或更少的測試單克隆抗體或純化的同種型對照物在室溫下反應1-2小時。這些孔然后與人IgGl或人IgM特異性堿性磷酸酶偶聯的探針反應。如上所述使平板顯色并且分析。
[0670] 可以通過Western印跡法進一步檢測抗-PD-Ll人IgG與F1D-Ll抗原的反應性。簡要地說，制備ro-Li并進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后，將分離的抗原轉移到硝酸纖維素膜上，用10%胎牛血清封閉，并用待檢測的單克隆抗體探查。人IgG的結合可以用抗人IgG堿性磷酸酶檢測，并用BCIP/NBT底物片（Sigma Chem. Co.，St. Louis，Mo.) 顯色。
[0671] 抗體的物理件質
[0672] 本發明的抗體可以進一步通過抗I3D-Ll抗體的各種物理性質進行表征。可以利用各種試驗基于這些物理性質檢測和/或區分不同類別的抗體。
[0673] 在某些實施方案中，本發明的抗體可以在輕鏈或重鏈可變區中含有一個或多個糖基化位點。可變區中一個或多個糖基化位點的存在可能由于抗原結合改變而導致抗體的免疫原性提高或者抗體的pK改變（Marshall等（1972)Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala FA 和 Morrison SL(2004)J Immunol 172 :5489-94 ;Wallick 等人（1988)J Exp Med 168 :1099-109 ;Spiro RG (2002) Glycobiology 12 :43R-56R ;Parekh等（1985) Nature 316 : 452-7 ;Mimura 等人（2000) Mol Immunol 37:697-706)。已知糖基化在含有 N-X-S/T 序列的基序處發生。可變區糖基化可以用Glycoblot試驗進行檢測，該試驗切割抗體，產生Fab，然后利用測定高碘酸鹽氧化和席夫堿形成的試驗檢測糖基化。或者，可變區糖基化也可以用 Dionex光層析法（Dionex-LC)檢測，該方法從Fab上切下糖成為單糖，并且分析各個糖的含量。在某些情況中，優選不含可變區糖基化的抗-PD-Ll抗體。這可以通過選擇在可變區中不含糖基化基序的抗體或者利用本領域公知的標準技術突變糖基化基序內的殘基來實現。
[0674] 在一個優選實施方案中，本發明的抗體不含天冬酰胺異構化位點。脫酰胺或異天冬氨酸作用可以分別在N-G或D-G序列上發生。脫酰胺或異天冬氨酸作用導致產生異天冬氨酸，這通過在側鏈羧基末端而不是在主鏈上產生扭結的結構而降低了抗體的穩定性。異天冬氨酸的產生可以用iso-quant試驗來測定，該試驗利用反相HPLC檢測異天冬氨酸。
[0675] 每種抗體具有獨特的等電點（pi)，但是通常抗體落入6至9. 5的pH范圍內。IgGl 抗體的Pl -般落入7-9. 5的pH范圍內，IgG4抗體的pi -般落入6-8的pH范圍內。抗體可以具有該范圍之外的pi。盡管這種作用通常未知，但是推測Pl落于正常范圍之外的抗體在體內條件下可能具有一定的解折疊和不穩定性。等電點可以用毛細管等電聚焦試驗來測定，該試驗產生PH梯度，并且可以利用激光聚焦來提高精確性（Janini等（2002) Electrophoresis 23 :16〇5_11 ;Ma 等（2OOl)Chromatographia 53 :S75-89 ;Hunt 等（I"8) J Chromatogr A 800:355-67)。在某些情況中，優選pi值落入正常范圍內的抗H)-L1抗體。這可以通過選擇Pl位于正常范圍內的抗體或者通過利用本領域公知的標準技術突變帶電荷的表面殘基來實現。
[0676] 每種抗體的烙解溫度指示熱穩定性（Krishnamurthy R和Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3 :361-71)。較高的熱穩定性表示在體內有較高的總體抗體穩定性。抗體的熔點可以用諸如差示掃描量熱法（Chen等（2003)Pharm Res 20 :1952-60 ;Ghirlando 等（1999) Immunol Lett 68 :47-52)等技術來測量。Tm表示抗體最初解折疊的溫度。Tm2表示抗體完全解折疊的溫度。通常，優選地本發明的抗體的T m大于60°C，優選大于65°C，甚至更優選大于70°C。此外，抗體的熱穩定性也可以利用圓二色性來測量（Murray等（2002) J. Chromatogr Sci 40 :343-9)。本文公開的抗F1D-Ll抗體的熱穩定性總結在表1中。
[0677] 表 1
[0678]

【權利要求】
1. 一種單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括： (a) 包含具有選自SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的序列的氨基酸的重鏈可變區；和 (b) 包含具有選自SEQ ID NO :11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的序列的氨基酸的輕鏈可變區；其中該抗體或其抗原結合部分特異性地結合ro-Li。
2. -種單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括： (a) 包含具有SEQ ID NO :1所示的序列的氨基酸的重鏈可變區；和 (b) 包含具有SEQ ID NO :11所示的序列的氨基酸的輕鏈可變區；其中該抗體或其抗原結合部分特異性地結合ro-Li。
3. -種單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括： (a) 包含具有SEQ ID NO :2所示的序列的氨基酸的重鏈可變區；和 (b) 包含具有SEQ ID NO :12所示的序列的氨基酸的輕鏈可變區；其中該抗體或其抗原結合部分特異性地結合ro-Li。
4. 一種人單克隆抗體或其抗原結合部分，其特異性地結合人ro-Li且表現出至少一種以下性質： (a) 以1 X 1(T7M或更低的KD與人PD-L1結合； (b) 在混合淋巴細胞反應（MLR)試驗中提高T細胞增殖； (c) 在MLR試驗中提高干擾素產生；或 ⑷在MLR試驗中提高白介素-2 (IL-2)分泌。
5. -種單克隆抗體或其抗原結合部分，其中該抗體與參比抗體或其抗原結合部分交叉競爭結合人H)-L1，所述參比抗體或其抗原結合部分包括： (a) 包含具有選自SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的序列的氨基酸的重鏈可變區；和 (b) 包含具有選自SEQ ID NO :11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的序列的氨基酸的輕鏈可變區。
6. -種單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括： (a) 源自人VH 1-18種系基因的重鏈可變區；和 (b) 源自人VK L6種系基因的輕鏈可變區；其中該抗體或其抗原結合部分與ro-Li特異性結合。
7. -種單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括： (a) 源自人VH 1-69種系基因的重鏈可變區；和 (b) 源自人VK L6種系基因的輕鏈可變區；其中該抗體或其抗原結合部分與ro-Li特異性結合。
8. 權利要求1-7任一項的單克隆抗體或其抗原結合部分在制備用于抑制受試者中的腫瘤細胞生長的藥物中的用途。
9. 權利要求1-7任一項的單克隆抗體或其抗原結合部分在制備用于治療受試者中的傳染病的藥物中的用途。
10. -種制備抗-PD-L1抗體的方法，包括： (a) 提供編碼抗體或其抗原結合部分的核酸，該抗體或其抗原結合部分包含：（i)包含具有選自SEQ ID勵：21、22、23、24、25、26、27、28、29和30的序列的氨基酸的重鏈可變區 CDR1、具有選自SEQ ID勵：31、32、33、34、35、36、37、38、39和40的序列的氨基酸的重鏈可變區CDR2、和具有選自SEQ ID N0:41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的序列的氨基酸的重鏈可變區 CDR3;或（ii)包含具有選自 SEQ ID 勵：51、52、53、54、55、56、57、58、59和60 的序列的氨基酸的輕鏈可變區CDR1、具有選自SEQ ID NO:61、62、63、64、65、66、67、68、69 和70的序列的氨基酸的輕鏈可變區CDR2、和具有選自SEQ ID NO :71、72、73、74、75、76、77、 78、79和80的序列的氨基酸的輕鏈可變區CDR3 ; (b) 改變編碼至少一種可變區內的至少一個氨基酸殘基的核酸以產生編碼包含至少一個氨基酸改變的經改變的抗體序列或其抗原結合部分； (c) 表達所述改變的抗體序列或其抗原結合部分為蛋白質；和 (d) 評估所述改變的抗體序列或其抗原結合部分的結合活性，其中所述改變的抗體序列或其抗原結合部分以1 X 1(T7M或更低的KD與人ro-Li特異性結合。
【文檔編號】A61P35/00GK104356236SQ201410639719
【公開日】2015年2月18日申請日期:2006年6月30日優先權日:2005年7月1日
【發明者】A·J·科曼, M·J·塞爾比, 王常宇, M·斯里尼瓦桑, D·B·帕斯莫爾, 黃海春, 陳海斌申請人:梅達雷克斯有限責任公司

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技術研發人員：A·J·科曼;M·J·塞爾比;王常宇;M·斯里尼瓦桑;D·B·帕斯莫爾;黃海春;陳海斌;
技術所有人：梅達雷克斯有限責任公司;
我是此專利的發明人

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