一種骨骼肌脫細胞基質生物補片及其制備方法
【專利摘要】本發明涉及生物醫學工程【技術領域】，公開了一種骨骼肌脫細胞基質生物補片及其制備方法，該制備方法包含以下步驟：(1)前期處理：取已死亡動物的腹直肌肌肉組織，沖洗除去表面的血凝塊，無菌條件下剔除表面脂肪組織和筋膜組織后沖洗；(2)脫細胞處理：反復凍融，漂洗，浸入烷基糖苷溶液中，常溫振蕩12～24小時；將烷基糖苷廢液倒掉，沖洗；加入含DNA酶和RNA酶的鹽溶液中，37℃下振蕩24～36小時，將組織取出沖洗；(3)凍干和消毒，即制得骨骼肌脫細胞基質生物補片。所制得的生物補片在徹底除去組織表面和內部的細胞的基礎上，更好地保留了骨骼肌的三維框架微結構，適用于作為生物修復材料廣泛應用于生物醫學工程領域。
【專利說明】一種骨骼肌脫細胞基質生物補片及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫學工程【技術領域】，特別涉及一種生物補片及其制備方法。
【背景技術】
[0002]脫細胞基質生物補片作為常用的生物修復材料，來源于牛、豬、馬、人等哺乳動物的小腸粘膜下層、皮膚、膀胱、心包等這些富含膠原的組織。經過脫細胞技術處理后，保留有正常細胞外基質的三維立體結構。生物補片植入到缺損處，能起到很好的支架作用，填補受損部位的缺失組織，并在該材料的誘導下，促進宿主細胞在其三維結構上生長并分泌細胞外基質，形成自身組織并完成在缺損部位的修復重建，完成器官組織再生的過程。生物補片憑借其具有的完全可降解性、較好的生物相容性及促進宿主組織長入等優點，越來越受到醫學研究者的關注。
[0003]脫細胞基質補片主要由膠原、糖蛋白、彈性纖維、粘多糖、生長因子構成。膠原成分占細胞外基質干重的90%;肝素、硫酸肝素、軟骨素A和B、透明質酸等粘多糖結合有生長因子和細胞因子成分，他們促進細胞外基質保留水分并維持凝膠狀形態；VEGF和TGF-β等生長因子雖然總量不多，但它們在調節細胞遷移、增殖和分化方面具有重要作用。這些脫細胞基質支架植入人體或動物體內后容易降解，降解后形成單肽類結構物質，對宿主組織和細胞具有趨化性和促進其增殖分化等作用。盡管這些生物補片有的取自異體組織，但由于去除了引起宿主免疫排斥反應的成分，只保留有同源性的細胞外基質成分，故組織相容性較好，移植后很少產生排斥反應。
[0004]除此之外，ECM還具有傳遞信號分子的作用，這種信號分子的傳遞作用表現在ECM支架的降解過程中。ECM支架除了具有很多生物結構大分子外還含有大量生長因子等活性成分。同時，在伴隨支架降解過程中會釋放一些可溶性的單肽片段，相應支架的結構會發生改變，抑制ECM支架降解的肽類會被合成和釋放，并啟動化學交聯過程，從而調節宿主組織對ECM支架的重塑步驟。
[0005]骨骼肌脫細胞基質生物補片來源于肌肉組織，肌肉組織主要由肌細胞和肌細胞分泌的細胞外基質組成。其中骨骼肌細胞外基質不僅具備像其他組織來源的細胞外基質的生物活性成分和結構，而且由于骨骼肌組織擁有良好的收縮性和豐富的毛細血管，其細胞外基質成分中I，IV等膠原和生長因子等活性成分含量非常高。因此骨骼肌脫細胞基質補片是一種具有很好應用前景的生物支架。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于提供一種骨骼肌脫細胞基質生物補片及其制備方法，按照該方法制得的骨骼肌脫細胞基質生物補片在徹底除去存在于組織表面和內部的細胞的基礎上，更好地保留骨骼肌的三維框架微結構。
[0007]為解決上述技術問題，本發明的實施方式提供的骨骼肌脫細胞基質的制備方法，包含以下步驟:
[0008](1)前期處理:取已死亡動物的腹直肌肌肉組織，沖洗除去表面的血凝塊，在無菌條件下剔除表面的脂肪組織和筋膜組織，再次沖洗；
[0009](2)脫細胞處理:將上述經過前期處理后的腹直肌組織進行反復凍融，然后漂洗，浸入到質量濃度為1?10%的烷基糖苷溶液中，常溫下振蕩12?24小時；將烷基糖苷廢液倒掉，沖洗；再加入含DNA酶和RNA酶的MgCl2溶液中，在37°C下振蕩24?36小時，將組織取出，沖洗；
[0010](3)凍干和消毒:將上述經過脫細胞處理后的腹直肌組織進行凍干處理，然后以Y射線輻射滅菌，即制得骨骼肌脫細胞基質生物補片。
[0011]本發明的實施方式提供了一種骨骼肌脫細胞基質生物補片的制備方法。相對于現有技術中的骨骼肌脫細胞基質制備方法，本發明的實施方式所提供的方法簡單、有效、成本低，在徹底除去存在于組織表面和內部的細胞的基礎上，更好地保留有骨骼肌的三維框架微結構，具有較好的力學性能和生物活性。
[0012]現有技術文獻中報道的脫細胞基質的制備方法主要有:酶消化法、醇類溶液法和化學洗滌劑法等，在制備過程中多是結合使用。以上幾種方法要達到脫細胞徹底的效果，必然或多或少會破壞基質內部的支架結構，引起基質內部活性蛋白變性，從而在一定程度上影響制備得到的脫細胞基質材料的力學性能和生物活性。本發明的實施方式在保證脫細胞效果的基礎上，為了減少制備方法對支架內部結構和活性的影響，采用了烷基糖苷進行脫細胞處理。烷基糖苷是由可再生資源天然脂肪醇和葡萄糖合成的，是一種性能較全面的新型非離子表面活性劑，無毒，且易于生物降解，對人體無害，性能溫和，對細胞外基質的超微結構和活性蛋白幾乎沒有損傷。同時烷基糖苷還具有高表面活性、良好的生態安全性和相溶性。為了進一步加強烷基糖苷脫細胞效果，本發明的實施方式還結合了凍融方法和核酸酶溶液共同處理腹壁骨骼肌。經體外試驗表明，本發明的方法在保證脫細胞效果的同時具備有良好的力學性能和生物活性成分，證實本發明的實施方式所提供的方法在骨骼肌脫細胞基質材料的制備中有重要的應用意義。
[0013]優選地，本發明的實施方式中，步驟(1)取已死亡動物的腹直肌肌肉組織時，供體動物優為新鮮健康牛或豬，取材時間為動物死亡后30分鐘內。組織和器官的細胞外基質提供了細胞發揮功能和維持表型的微環境，這種微環境的結構和成分在不同組織器官具有一定的差異，因此同源性脫細胞基質材料修復相應組織的效果較好。肌肉脫細胞基質來源的成分對于促進成肌細胞增殖和分化具有重要的影響，因此本發明的實施方式采用死亡動物的腹直肌肌肉組織作為制備脫細胞基質生物補片的材料來源，可使最終制備得到的生物補片更好地適應于對肌肉缺失的生物修復。
[0014]優選地，本發明的實施方式中，步驟(1)中的兩次沖洗操作所采用的沖洗液為含有鏈霉素和青霉素的去離子水或PBS緩沖液；所述青霉素在所述沖洗液中的濃度為100 μ g/ml、所述鏈霉素在所述沖洗液中的濃度為100yg/ml。采用含有鏈霉素和青霉素雙抗的去離子水或PBS緩沖液作為沖洗液，對動物的腹直肌肌肉組織材料進行沖洗，可達到抑制細菌和真菌生長的作用。
[0015]優選地，本發明的實施方式中，步驟(2)中反復凍融的方法為:將所述腹直肌組織置于-80°C冰箱3?6小時，然后取出放在37°C水浴箱中30?60分鐘左右，凍融的次數為3次。上述步驟(2)中對腹直肌組織進行反復凍融的作用為:凍融方法可以有效地使組織和器官中的細胞裂解，單次凍融可以減少免疫排斥反應，反復凍融多用于脫細胞處理。凍融處理最大的優點是對組織的機械性能影響不大，因為其不會減少細胞外基質膠原纖維的含量。
[0016]優選地，本發明的實施方式中，步驟(2)中所采用的MgCl2溶液的濃度為0.05mol/L，，所述18(:12溶液中含DNA酶的濃度為100?200μ g/ml，含RNA酶的濃度為100?200 μ g/ml。在烷基糖苷處理后，采用含有核酸酶和脫氧核酸酶的MgCl2溶液繼續對腹直肌進行處理，裂解核酸的序列，可以清除細胞內殘留的核酸物質。
[0017]優選地，本發明的實施方式中，步驟(3)中，凍干處理的方法為:置于-60?_50°C真空冷凍干燥機進行凍干處理18?24小時。通過該凍干處理步驟，使得殘留在補片內的水分去掉，便于將制得的生物補片更好地保存。
[0018]本發明的實施方式也提供根據上述方法制備得到的骨骼肌脫細胞基質生物補片。該骨骼肌脫細胞基質生物補片由于在徹底除去存在于組織表面和內部的細胞的基礎上，保留有骨骼肌的三維框架微結構，因而具有較好的力學性能和生物活性，適用于作為生物修復材料廣泛應用于生物醫學工程領域，尤其是作為骨骼肌缺損的修復材料。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]圖1是實施例3中的HE染色結果對比示意圖:
[0020]其中，1A為實施例1制得的生物補片的HE染色結果圖、IB為實施例2制得的生物補片的HE染色結果圖、1C為正常骨骼肌的HE染色結果圖；
[0021]圖2是實施例3中的殘留DNA測定試驗的數據圖；
[0022]圖3是實施例3中的組織結構成分檢測結果對比示意圖:
[0023]其中，3A為實施例1制得的生物補片的Masson染色結果圖、3B為實施例2制得的生物補片的Masson染色結果圖、
[0024]3C為實施例1制得的生物補片的PAS染色結果圖、3D為實施例2制得的生物補片的PAS染色結果圖、
[0025]3E為實施例1制得的生物補片的I型膠原免疫組化染色結果圖、3F為實施例2制得的生物補片的I型膠原免疫組化染色結果圖、
[0026]3G為實施例1制得的生物補片的纖連蛋白免疫組化染色結果圖、3H為實施例2制得的生物補片的纖連蛋白免疫組化染色結果圖；
[0027]圖4是實施例3中的Elisa定量檢測活性蛋白含量試驗的結果示意圖:
[0028]其中，4A為總蛋白含量檢測結果圖、4B為VEGF蛋白含量檢測結果圖、4C為IGF-1蛋白含量檢測結果圖；
[0029]圖5是實施例3中的掃描電鏡超微結構示意圖:
[0030]其中，5A為實施例1制得的生物補片的掃描電鏡圖、5B為實施例2制得的生物補片的掃描電鏡圖。
【具體實施方式】
[0031]為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明的各實施方式進行詳細的闡述。然而，本領域的普通技術人員可以理解，在本發明各實施方式中，為了使讀者更好地理解本申請而提出了許多技術細節。但是，即使沒有這些技術細節和基于以下各實施方式的種種變化和修改，也可以實現本申請各權利要求所要求保護的技術方案。
[0032]實施例1豬源性骨骼肌脫細胞基質支架的制備
[0033]本實施例涉及豬源性骨骼肌脫細胞基質生物補片的制備實例:(1)前期處理:從死亡的供體豬的體內取出腹直肌，使用0?8°C的去離子水或者ph值為7.4左右的緩沖鹽溶液(PBS)反復沖洗以除去表面的血凝塊，無菌條件下剔除表面脂肪組織，筋膜組織后，剪成2X 2cm2大小片狀，繼續用去離子水或者ph值為7.4左右的緩沖鹽溶液(PBS)進行沖洗。上述兩次沖洗步驟所使用的去離子水或者緩沖鹽溶液中含有青霉素100 μ g/ml和鏈霉素100 μ g/ml.(2)脫細胞處理:本部分將凍融法，烷基糖苷和核酸酶溶液相結合進行脫細胞處理，步驟如下，將上述腹直肌組織置于_80°C冰箱4h，然后取出放在37°C水浴箱中30min，如此反復凍融3次。無菌去離子水漂洗30min后，將其浸入到1%烷基糖苷溶液(APG0810)中，常溫下置于搖床中以lOOrpm/min的速度振蕩12h。將烷基糖苷廢液倒掉，去離子水沖洗30min, PBS 溶液沖洗 2 次，每次 30min。然后加入 150 μ g/ml Dnase 和 100 μ g/mlRnase 的
0.05M MgCl2溶液中，以100rpm/min的速度在37°C搖床中振蕩24h。最后將組織取出，PBS沖洗2次，每次30min，去離子水沖洗2次，每次30min。(3)凍干和消毒:將脫細胞后的腹直肌組織置于-50°C真空冷凍干燥機行凍干處理18h，然后γ射線輻射滅菌，無菌環境下保存于-80°C冰箱備用。
[0034]實施例2對比制備實驗例(Badylak制備方法)
[0035]根據Badylak提供的標準骨骼肌脫細胞基質制備方法制備脫細胞基質生物補片:前期處理和凍干消毒步驟與本發明實施例1相同，脫細胞處理步驟如下:將胰酶，洗滌劑，醇類和螯合劑相結合進行脫細胞處理。首先將經過前期處理后的腹直肌組織在配有0.2%胰蛋白酶/0.2% EDTA的燒瓶中，燒瓶放入37°C恒溫振蕩箱2?4h，然后將燒瓶里廢液棄掉，去離子水沖洗30min，PBS沖洗2次，每次30min。加入2%脫氧膽酸鈉溶液，常溫下振蕩箱5?7h，將廢液棄掉，去離子水沖洗30min，PBS沖洗2次，每次30min。加入新鮮2%脫氧膽酸鈉溶液，繼續常溫下振蕩箱14?16min,廢液棄掉，加入1% TritonX-ΙΟΟΙ?3h,去離子水沖洗30min后，加入0.1 %過氧乙酸/4%乙醇溶液2h，PBS沖洗2次，每次30min，去離子水沖洗2次，每次30min后，將其行凍干和消毒，最后保存在_80°C冰箱備用。
[0036]實施例3體外試驗測定結果對比
[0037]將上述實施例1和實施例2兩種制備方案得到的骨骼肌脫細胞基質生物補片進行體外試驗測定比較，證實本發明得到的骨骼肌脫細胞基質材料生物活性較好，結果如下:
[0038](1)脫細胞程度測定:兩種支架材料經石蠟包埋后切片行蘇木素-伊紅染色(HE染色)，證實無明顯細胞核殘留，正常骨骼肌HE染色后細胞核有表達(圖1A顯示實施例1制備的生物補片無明顯細胞核殘留，圖1B顯示實施例2制備的生物補片無明顯細胞核殘留，圖1C示正常骨骼肌的細胞核)。結合PicoGreen assay試劑盒進行殘留DNA測定發現(圖2顯示殘留DNA測定結果)，本發明實施例1制備得到的骨骼肌脫細胞基質生物補片中DNA含量為68.59± 10.lng/mg,實施例2制備得到的骨骼肌脫細胞基質生物補片中DNA含量為81.35±8.5ng/mg，兩者之間無統計學差異，正常骨骼肌DNA含量為838.7±57.94ng/mg，相對于脫細胞基質差異具有統計學意義。
[0039](2)組織結構成分:通過馬森染色(Masson染色)發現，實施例1制備得到的骨骼肌脫細胞基質生物補片(圖3A)和實施例2制備得到的脫細胞基質生物補片(圖3B)中的膠原纖維排列整齊，呈波浪狀平行排列，無明顯斷裂。PAS染色主要用來檢測組織中的糖類成分，實施例1制備得到的骨骼肌脫細胞基質生物補片(圖3C)和實施例2制備得到的脫細胞基質生物補片(圖3D)中的糖類成分也被保留下來。為了進一步驗證脫細胞處理后的細胞外基質成分是否改變，我們選擇細胞外基質中表達比較廣泛的兩類蛋白，I型膠原(圖3E顯示實施例1制備得到的骨骼肌脫細胞基質生物補片、圖3F顯示實施例2制備得到的骨骼肌脫細胞基質生物補片)和纖連蛋白(圖3G顯示實施例1制備得到的骨骼肌脫細胞基質生物補片、圖3H顯示實施例2制備得到的脫細胞基質生物補片)，進行免疫組化染色檢測，發現它們同樣在兩類骨骼肌脫細胞基質生物補片上有陽性表達。
[0040](3)生長因子和活性蛋白含量:Elisa定量檢測(圖4A)發現:盡管實施例1制備得到的脫細胞基質生物補片中總蛋白含量要比實施例2制備得到的生物補片中總蛋白含量高(33.89±4.139mg/g vs 27.27±2.096mg/g)，但兩者之間差異無統計學意義，其中VEGF蛋白含量(圖4B)和IGF-1蛋白含量(圖4C)也是實施例1所制得的脫細胞基質生物補片中較高，VEGF蛋白在實施例1制備的補片中含量為1.228±0.04571ng/mg，在實施例2制得的補片中含量為0.7806±0.01773ng/mg, VEGF蛋白含量之間的差異有統計學意義；IGF-1蛋白在實施例1制備的補片中含量為47.23±9.495ng/mg，在實施例2制得的生物補片中含量為18.78±4.625ng/mg, IGF-1蛋白含量之間的差異有統計學意義。
[0041](4)超微結構:掃描電鏡(SEM)顯示實施例1制備得到的骨骼肌脫細胞基質生物補片(圖5A)和實施例2制備得到的骨骼肌脫細胞基質(圖5B)均保留了天然骨骼肌細胞外基質排列的周期性條索狀肌膜微結構，其中看不到無明顯的細胞成分。
[0042]綜上所述，本發明提供的改良方法簡單，原料來源成本低，所用試劑無毒，對細胞外基質活性成分影響小，有較好的力學性能和生物活性，并能有效的去除組織內部的細胞成分，是一種具有良好應用前景的骨骼肌脫細胞基質支架材料。
[0043]本領域的普通技術人員可以理解，上述各實施方式是實現本發明的具體實施例，而在實際應用中，可以在形式上和細節上對其作各種改變，而不偏離本發明的精神和范圍。
【權利要求】
1.一種骨骼肌脫細胞基質生物補片的制備方法，其特征在于，包含以下步驟: (1)前期處理:取已死亡動物的腹直肌肌肉組織，沖洗除去表面的血凝塊，在無菌條件下剔除表面的脂肪組織和筋膜組織，再次沖洗； (2)脫細胞處理:將上述經過前期處理后的腹直肌肌肉組織進行反復凍融，然后漂洗，浸入到質量濃度為1?10%的烷基糖苷溶液中，常溫下振蕩12?24小時；將烷基糖苷廢液倒掉，沖洗；再加入含0嫩酶和謂\酶的1甙12溶液中，在371下振蕩24?36小時，將組織取出，沖洗； (3)凍干和消毒:將上述經過脫細胞處理后的腹直肌肌肉組織進行凍干處理，然后以V射線輻射滅菌，即制得骨骼肌脫細胞基質生物補片。
2.根據權利要求1所述的骨骼肌脫細胞基質生物補片的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中取已死亡動物的腹直肌肌肉組織時，供體動物為牛或豬，取材時間為動物死亡后30分鐘內。
3.根據權利要求1所述的骨骼肌脫細胞基質生物補片的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中的兩次沖洗操作所采用的沖洗液為含有鏈霉素和青霉素的去離子水或？83緩沖液；所述青霉素在所述沖洗液中的濃度為1009 8加1、所述鏈霉素在所述沖洗液中的濃度為 100 9 。
4.根據權利要求1所述的骨骼肌脫細胞基質生物補片的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中反復凍融的方法為:將所述腹直肌肌肉組織置于-801冰箱3?6小時，然后取出放在371水浴箱中30?60分鐘。
5.根據權利要求1所述的骨骼肌脫細胞基質生物補片的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中反復凍融的次數為3次。
6.根據權利要求1所述的骨骼肌脫細胞基質生物補片的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中的兩次振蕩操作均在搖床中進行，搖床的轉速為100?15011)111/111111。
7.根據權利要求1所述的骨骼肌脫細胞基質生物補片的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中的1甙12溶液的濃度為0.0511101/1。
8.根據權利要求1所述的骨骼肌脫細胞基質生物補片的制備方法，其特征在于，所述1^12溶液中含0嫩酶的濃度為100?200 ^ 8加1，含觀八酶的濃度為100?200 ^ 8加1。
9.根據權利要求1所述的骨骼肌脫細胞基質生物補片的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中凍干處理的方法為:置于-60?-501真空冷凍干燥機進行凍干18?24小時。
10.一種骨骼肌脫細胞基質生物補片，所述骨骼肌脫細胞基質生物補片根據權利要求1至9中任一項所述的方法制備得到。
【文檔編號】A61L27/36GK104383601SQ201410604161
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月30日 優先權日:2014年10月30日
【發明者】顧巖, 楊志, 楊建軍, 宋致成, 聶鑫, 王恵春, 劉正尼 申請人:上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院