非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎小鼠模型的建立方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種建立非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎小鼠模型的方法。該方法選擇高脂飼料喂養(yǎng)C3H/HeN小鼠12周，觀察小鼠體重、肝重、轉(zhuǎn)氨酶、糖脂代謝指標(biāo)及肝臟組織學(xué)變化，建立非酒精性脂肪性肝病小鼠。再選擇10PFU量的鼠肝炎3型病毒(MHV-3)感染小鼠，觀察受感染后小鼠的存活率、肝臟組織學(xué)及肝內(nèi)病毒復(fù)制，從而建立類似人類疾病過程的非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎小鼠模型。該模型的建立為系統(tǒng)研究非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎的病毒動力學(xué)、免疫學(xué)改變和防治措施提供了有力的工具。
【專利說明】非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎小鼠模型的建立方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，涉及一種動物模型的構(gòu)建方法，特別涉及一種用 于模擬、研究和防治非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎的小鼠模型的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是代謝綜 合征在肝臟的表現(xiàn)，包括單純性脂肪肝（simple steatosis),脂肪性肝炎（Non-alcoholic steatohepatitis，NASH),以及NASH相關(guān)的肝纖維化/肝硬化、肝癌。隨著生活水平的提 高，NAFLD在發(fā)展中國家的發(fā)病率顯著上升，我國NAFLD發(fā)病率在過去的10年增加了近一 倍，部分地區(qū)的發(fā)病率已達(dá)四分之一。我國是肝炎病毒感染的高發(fā)地區(qū)，約有1億乙型肝炎 病毒（Hepatitis B virus, HBV)感染者及 4000 萬丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV) 感染者，其中合并NAFLD的患者有逐年增加的趨勢，NAFLD合并病毒性肝炎是我國面臨的一 個新的健康問題。目前，關(guān)于NAFLD對病毒性肝炎的病毒動力學(xué)、免疫學(xué)及肝臟損傷影響機 制仍不明確。
[0003] 對于NAFLD合并病毒性肝炎的人群研究存在很多難點。首先，研究中多用肝臟超 聲診斷脂肪肝。肝臟超聲檢查僅能檢出肝內(nèi)脂肪沉積超過30%的中度脂肪肝，難以檢出輕 度脂肪肝（肝臟內(nèi)脂肪沉積為5% -30% )，因此在分組時，可能將輕度脂肪肝患者作為無脂 肪肝的對照。其次，在研究NAFLD合并慢性乙型肝炎（Chronic h印atitis B，CHB)時，難以 保證受試者在代謝、病毒、治療等多種因素上的一致性。第三，人群研究難以獲取肝組織觀 察肝內(nèi)免疫、代謝等方面的改變。建立可以模擬人類NAFLD合并病毒性肝炎疾病特點的動 物模型，可以克服上述臨床研究中的不足。
[0004] 相關(guān)的模型建立方法極少，中國科技大學(xué)傅苗苗在2009年發(fā)表的碩士研究生 學(xué)位論文《乙肝病毒轉(zhuǎn)基因小鼠對營養(yǎng)性脂肪肝炎更敏感》中，曾采用膽堿蛋氨酸缺乏 (Methionine-Choline_Deficient，MCD)飲食喂養(yǎng)轉(zhuǎn)有乙肝表面抗原（Hepatitis B surface antigen，HBsAg)的轉(zhuǎn)基因小鼠，建立NASH合并HBsAg表達(dá)的小鼠模型。但該模型與非酒精 性脂肪性肝病合并病毒性肝炎患者的臨床特點仍存在些許不同。第一，該小鼠模型僅轉(zhuǎn)入 了含有編碼HBsAg的基因片段，并不是完整的病毒基因，在體內(nèi)不能形成完整的病毒顆粒， 不能模擬病毒復(fù)制情況；第二，該模型為轉(zhuǎn)基因小鼠，小鼠免疫系統(tǒng)對轉(zhuǎn)入的基因片段所表 達(dá)的HBsAg產(chǎn)生耐受，不能產(chǎn)生抗病毒免疫應(yīng)答；第三，MCD飲食誘導(dǎo)的小鼠模型，只是在肝 臟病理上具有和非酒精性脂肪性肝炎一致的特征，但是模型小鼠會出現(xiàn)體重降低，外周胰 島素敏感，甚至出現(xiàn)低血糖，與臨床患者的代謝情況相反。范建高等（Fatty liver reduces hepatitis B virus replication in a genotype B hepatitis B virus transgenic mice model，Journal of gastroenterology and hepatology，27(2012) 1858 - 1864)使用高脂飲 食喂養(yǎng)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠，構(gòu)建了具有非酒精性脂肪性肝病及HBV病毒表達(dá)的小鼠模型。該 動物模型較傅苗苗建立的小鼠模型更接近臨床病人表現(xiàn)，但是無法克服轉(zhuǎn)基因小鼠所共有 的缺陷。第一，轉(zhuǎn)基因小鼠對HBV病毒耐受，小鼠免疫系統(tǒng)對HBV病毒不會產(chǎn)生免疫應(yīng)答， 不能進(jìn)行免疫學(xué)方面的研究；第二，轉(zhuǎn)基因小鼠雖然可以復(fù)制并釋放HBV顆粒，但是HBV病 毒本身并不能感染小鼠肝細(xì)胞，不能模擬病毒感染及復(fù)制的完整周期。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有NAFLD合并病毒性肝炎動物模型所存在的不足，提供 一種建立NAFLD合并病毒性肝炎小鼠模型的方法，用該方法建立的小鼠模型克服了現(xiàn)有 NAFLD合并病毒性肝炎動物模型所存在的不足，模型小鼠構(gòu)建成本低廉、易于復(fù)現(xiàn)、臨床癥 狀明顯、具有完整的病毒感染及復(fù)制周期，并可以刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗病毒免疫應(yīng)答，可以 復(fù)制出NAFLD合并病毒性肝炎的多種特征且與人類情況類似。
[0006] 為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明一方面提供一種非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝 炎小鼠模型的建立方法，包括對小鼠依次進(jìn)行高脂飲食誘導(dǎo)、鼠肝炎病毒感染，構(gòu)建非酒精 性脂肪性肝病合并病毒性肝炎模型小鼠。
[0007] 其中，所述小鼠選擇C3H/HeN純系近交小鼠。
[0008] 特別是，所述小鼠選擇雌性C3H/HeN純系近交小鼠。
[0009] 其中，所述C3H/HeN純系近交小鼠的年齡為6-7周胎齡。
[0010] 特別是，所述小鼠的動物級別為SPF級。
[0011] 尤其是，所述C3H/HeN純系近交小鼠的體重為15. 8-19. 4g。
[0012] 其中，所述高脂飲食誘導(dǎo)是采用高脂飼料喂養(yǎng)小鼠至少12周，構(gòu)建非酒精性脂肪 性肝病小鼠。
[0013] 特別是，所述高脂飲食誘導(dǎo)時間優(yōu)選為12周。
[0014] 特別是，每千克所述1?脂詞料含有258g釀蛋白、162g糊精、89g鹿糖、32g ?油、 317g豬油、65g纖維素、58g礦物質(zhì)、13g維生素、4gL -胱氨酸、3g酒石酸膽堿及0. 069g食 物抗氧化劑。
[0015] 尤其是，將小鼠喂養(yǎng)于無菌過濾空氣鼠籠內(nèi)，控制籠內(nèi)溫度為22°C，相對濕度為 40%，12小時光照/黑暗交替進(jìn)行，供給雙蒸水，小鼠于籠內(nèi)自由進(jìn)食；每周更換兩次墊料 及飼料。
[0016] 尤其是，喂養(yǎng)過程中每周更換兩次墊料及飼料，可防止高脂飼料變質(zhì)，影響小鼠進(jìn) 食。
[0017] 其中，所述鼠肝炎病毒感染是對高脂飲食誘導(dǎo)后的小鼠注射鼠肝炎病毒，感染小 鼠，建立非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎小鼠模型。
[0018] 特別是，所述鼠肝炎病毒選擇鼠肝炎3型病毒。
[0019] 特別是，采用腹腔注射的方式注射所述的鼠肝炎3型病毒。
[0020] 尤其是，所述腹腔注射是在小鼠中下腹壁行腹腔內(nèi)注射。
[0021] 其中，所述鼠肝炎病毒的注射量為每只小鼠體內(nèi)注射至少5PFU(病毒噬斑形成單 位）的鼠肝炎病毒，優(yōu)選為5-15PFU，進(jìn)一步優(yōu)選為10PFU。
[0022] 本發(fā)明另一方面提供一種非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎小鼠模型的建立 方法，包括如下順序進(jìn)行的步驟：
[0023] A)高脂飲食誘導(dǎo)處理
[0024] 在無菌過濾空氣鼠籠內(nèi)，自由攝取食水的條件下，采用高脂飼料喂養(yǎng)小鼠至少12 周，誘導(dǎo)獲得非酒精性脂肪性肝病小鼠；
[0025] B)第一次體征監(jiān)測
[0026] 對高脂飲食誘導(dǎo)處理的小鼠進(jìn)行體重、體型，肝臟形態(tài)、肝臟組織學(xué)變化以及血液 中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、空腹血糖、膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、胰島素水平及 胰島素抵抗水平測定；
[0027] C)病毒感染處理
[0028] 將鼠肝炎病毒通過注射的方式注入非酒精性脂肪性肝病小鼠體內(nèi)，感染小鼠，建 立非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎小鼠模型；
[0029] D)第二次體征監(jiān)測
[0030] 分別于病毒感染第4、8、12、16、20、30天對病毒感染小鼠外周血檢測轉(zhuǎn)氨酶，觀察 病毒感染小鼠肝臟組織學(xué)及肝內(nèi)病毒復(fù)制變化。
[0031] 其中，步驟A)中所述小鼠選擇C3H/HeN純系近交小鼠。
[0032] 特別是，所述小鼠選擇雌性C3H/HeN純系近交小鼠。
[0033] 其中，所述C3H/HeN純系近交小鼠的年齡為6-7周胎齡。
[0034] 特別是，所述小鼠的動物級別為SPF級。
[0035] 尤其是，所述C3H/HeN純系近交小鼠的體重為15. 8-19. 4g。
[0036] 特別是，所述高脂飲食誘導(dǎo)時間優(yōu)選為12周。
[0037] 特別是，每千克所述1?脂詞料含有258g釀蛋白、162g糊精、89g鹿糖、32g ?油、 317g豬油、65g纖維素、58g礦物質(zhì)、13g維生素、4gL -胱氨酸、3g酒石酸膽堿及0. 069g食 物抗氧化劑。
[0038] 尤其是，將小鼠喂養(yǎng)于無菌過濾空氣鼠籠內(nèi)，控制籠內(nèi)溫度為22°C，相對濕度為 40%，12小時光照/黑暗交替進(jìn)行，供給雙蒸水，小鼠于籠內(nèi)自由進(jìn)食；每周更換兩次墊料 及飼料。
[0039] 尤其是，喂養(yǎng)過程中每周更換兩次墊料及飼料，可防止高脂飼料變質(zhì)，影響小鼠進(jìn) 食。
[0040] 其中，步驟C)中所述鼠肝炎病毒選擇鼠肝炎3型病毒。
[0041] 特別是，采用腹腔注射的方式注射所述的鼠肝炎3型病毒。
[0042] 尤其是，所述腹腔注射是在小鼠中下腹壁行腹腔內(nèi)注射。
[0043] 其中，所述鼠肝炎病毒的注射量為每只小鼠體內(nèi)注射至少5PFU(病毒噬斑形成單 位）的鼠肝炎病毒，優(yōu)選為5-15PFU，進(jìn)一步優(yōu)選為10PFU。
[0044] 本發(fā)明方法所建立的模型具有如下優(yōu)點：
[0045] 1、本發(fā)明方法首先采用高脂飲食喂養(yǎng)小鼠制備NAFLD小鼠，然后再采用鼠肝炎3 型病毒感染NAFLD小鼠，避免了因為MHV-3感染后，小鼠肝內(nèi)免疫微環(huán)境的顯著改變，導(dǎo)致 在病毒感染后的小鼠的基礎(chǔ)上誘導(dǎo)非酒精性脂肪性肝病自然病理過程發(fā)生變化，與人類非 酒精性脂肪性肝病病變產(chǎn)生差異；本發(fā)明先誘導(dǎo)產(chǎn)生NAFLD再感染MHV-3,才能觀察NAFLD 對MHV - 3感染的影響，本發(fā)明的模型小鼠的構(gòu)建方法具有簡便易行、成本低廉、可重復(fù)性 高、遺傳背景清晰、模擬人類代謝綜合征和抗病毒免疫應(yīng)答，以及完整的病毒感染與復(fù)制周 期的優(yōu)點；
[0046] 小鼠感染MHV-3后，小鼠肝內(nèi)會發(fā)生顯著的免疫微環(huán)境改變，包括：肝內(nèi)雙陰性T 細(xì)胞（double negative T cell，DN Treg cell)、CD4+CD25+T 細(xì)胞、CD8+PD-1+T 細(xì)胞及 CD8+FasL+T 細(xì)胞比例增加，肝內(nèi) IFN-γ、IFN-β、IL-I β、IL-6、IL-12、IL-4、TNF-α 表達(dá) 及含量增加。在這樣的基礎(chǔ)上誘導(dǎo)NAFLD的形成，會對NAFLD的自然病理過程產(chǎn)生較顯著 的影響，例如加快NASH的形成。因此，應(yīng)當(dāng)先誘導(dǎo)NAFLD再感染MHV-3,才能觀察NAFLD對 MHV-3感染的影響。
[0047] 2、本發(fā)明方法選用的C3H/HeN小鼠自由攝取高脂飲食至少12周后，小鼠體形肥 胖、體重增加、轉(zhuǎn)氨酶輕度升高、糖脂代謝異常及肝內(nèi)脂肪沉積，與人類的NAFLD的各種臨 床癥狀相類似；
[0048] 3、本發(fā)明方法所選鼠肝炎3型病毒感染NAFLD C3H/HeN小鼠先患有急性肝炎，約 80%的存活小鼠2周后轉(zhuǎn)為持續(xù)性感染，對合并肝炎小鼠的免疫狀態(tài)及病毒復(fù)制情況進(jìn)行 研究，是探討NAFLD對病毒性肝炎免疫學(xué)影響的有力工具；
[0049] 4、本發(fā)明方法建立的小鼠模型重復(fù)性好，遺傳背景清晰，為系統(tǒng)性、動態(tài)性研究 NAFLD對病毒性肝炎的免疫學(xué)、病毒學(xué)影響提供新的研究思路；
[0050] 5、本發(fā)明方法選用的高脂飼料易于獲取，鼠肝炎3型病毒易于體內(nèi)、體外培養(yǎng)，所 建模型成本相對較低，同時也克服了轉(zhuǎn)基因小鼠對病毒耐受，對病毒不產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并缺 乏病毒感染與復(fù)制完整周期的局限型。
[0051] 本發(fā)明采用免疫力健全的小鼠，成年小鼠感染病毒后產(chǎn)生免疫應(yīng)答，而轉(zhuǎn)基因小 鼠在胚胎發(fā)育階段，免疫細(xì)胞因識別轉(zhuǎn)入的病毒抗原，而產(chǎn)生克隆敲除，不會產(chǎn)生針對病毒 抗原的免疫應(yīng)答；本發(fā)明的模型小鼠在MHV-3感染后，外周血抗檢測到MHV3抗體，呈陽性 的，淋巴細(xì)胞也出現(xiàn)激活，證明小鼠感染MHV3病毒后產(chǎn)生免疫應(yīng)答；轉(zhuǎn)基因小鼠雖然是轉(zhuǎn) 入的HBV全部基因組，也能合成完整的病毒顆粒，但是新合成的HBV病毒是不能感染小鼠肝 細(xì)胞的（HBV只能感染靈長類動物肝細(xì)胞）。故，轉(zhuǎn)基因小鼠缺乏完整的病毒感染過程。一 部分轉(zhuǎn)基因小鼠，甚至只轉(zhuǎn)入部分HBV基因，只能合成一些病毒抗原，連完整的病毒顆粒都 無法合成。因此說轉(zhuǎn)基因小鼠中，缺乏完整的病毒復(fù)制周期。而MHV3病毒,是鼠肝炎病毒， 即感染小鼠肝細(xì)胞的病毒，并能在小鼠肝細(xì)胞中復(fù)制。本發(fā)明的模型小鼠采用活病毒注入 小鼠體內(nèi)，并觀察到小鼠出現(xiàn)癥狀、轉(zhuǎn)氨酶升高、甚至死亡，這就是一個感染的過程。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0052] 圖1是本發(fā)明高脂飲食及正常飲食喂養(yǎng)C3H/HeN小鼠體重變化曲線圖；
[0053] 圖2是喂養(yǎng)12周后的小鼠外觀圖，其中A為高脂飲食喂養(yǎng)小鼠外觀圖，B為正常 飲食喂養(yǎng)小鼠外觀圖；
[0054] 圖3是喂養(yǎng)12周后的小鼠肝臟外觀改變圖，其中A為正常飲食喂養(yǎng)小鼠肝臟，B為 高脂飲食喂養(yǎng)小鼠肝臟；
[0055] 圖4是本發(fā)明喂養(yǎng)12周的小鼠肝組織HE染色及油紅0染色顯微鏡觀察圖，其中 A為正常飲食小鼠肝組織HE染色鏡檢圖；B為正常飲食小鼠肝組織油紅0染色鏡檢圖；C為 高脂飲食小鼠肝組織HE染色鏡檢圖；D為高脂飲食小鼠肝組織油紅0染色鏡檢圖，箭頭所 示為肝細(xì)胞內(nèi)沉積之脂肪滴；
[0056] 圖5本發(fā)明NAFLD合并病毒性肝炎小鼠生存曲線；
[0057] 圖6本發(fā)明NAFLD合并病毒性肝炎小鼠肝臟組織學(xué)變化鏡檢圖（HEX400)，其中， A為對照組NAFLD小鼠肝臟切片圖；B、C、D依次為感染4、8、20天小鼠肝臟切片圖；圖中▲ 所示為肝細(xì)胞腫脹，胞漿疏松，丨所示為肝細(xì)胞壞死灶；
[0058] 圖7本發(fā)明NAFLD合并病毒性肝炎小鼠肝內(nèi)MHV-3病毒檢測凝膠電泳圖，其中A 為未感染MHV-3的對照組NAFLD小鼠樣本，未見病毒條帶；B為MHV-3感染30天小鼠樣本， 4只小鼠中有3只小鼠肝內(nèi)可擴(kuò)增到病毒條帶，條帶大小位于100-150bp，與目的片段117bp 吻合。
【具體實施方式】
[0059] 下面結(jié)合具體實施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式 進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0060] 實施例1
[0061] 1、高脂飲食誘導(dǎo)處理
[0062] 1A)選擇6-7周齡SPF級雌性C3H/HeN小鼠125只，予以高脂飼料喂養(yǎng)（簡稱為高 脂飼料組小鼠），其中，高脂飼料購于南通特洛菲飼料科技有限公司，貨號TP23520,每千克 飼料含有258g酪蛋白、162g糊精、89g蔗糖、32g豆油、317g豬油、65g纖維素、58g礦物質(zhì)、 13g維生素、4gL -胱氨酸、3g酒石酸膽堿及0. 069g食物抗氧化劑；
[0063] 本發(fā)明中實驗小鼠選擇性格溫順的雌性小鼠，既方便飼養(yǎng)又利于試驗處理的順利 進(jìn)行。
[0064] 1B)另取6-7周齡SPF級雌性C3H/HeN小鼠15只，予以正常飼料喂養(yǎng)（簡稱正常 對照組小鼠）；
[0065] 1C)每周稱取兩組小鼠體重，并觀察小鼠一般情況，連續(xù)喂養(yǎng)12周后高脂飼料組 小鼠體重顯著高于正常對照組小鼠的體重，并且高脂飼料組小鼠體型肥胖，皮毛油膩，不喜 活動；小鼠的體重、體型從喂養(yǎng)的第3周開始表現(xiàn)出顯著的差異性；2組小鼠的體重測定結(jié) 果如圖1所示；體型及形態(tài)如圖2所示。
[0066] 1D)喂養(yǎng)12周后高脂飼料誘導(dǎo)的小鼠構(gòu)建為非酒精性脂肪性肝病（NAFLD)小鼠， 然后隨機取高脂飼料組小鼠15只，及正常對照組15只小鼠，收集外周血檢測轉(zhuǎn)氨酶及糖脂 代謝指標(biāo)，觀察肝臟外觀及皮下脂肪堆積情況，稱取肝臟重量，收集肝組織進(jìn)行蘇木素一伊 紅染色和油紅〇染色，觀察肝臟組織學(xué)變化，檢測結(jié)果如下：
[0067] 肝臟的外觀變化如圖3所示，其中：正常對照組小鼠的肝臟紅潤有光澤，邊緣銳 利，質(zhì)韌（圖3A);高脂飼料組小鼠的肝臟顯著增大、邊緣圓鈍、色澤紅黃、表面光滑、有油膩 感、質(zhì)地變脆，同時可見內(nèi)臟及皮下脂肪增多（圖3B);
[0068] 肝臟組織學(xué)可見肝細(xì)胞脂肪變（如圖4);
[0069] 肝臟的重量以及血液中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST)、空腹血糖、膽固 醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、胰島素水平及胰島素抵抗水平測定結(jié)果如表1所示；
[0070] 表1喂養(yǎng)12周后的小鼠肝臟以及血相指標(biāo)檢測結(jié)果
[0071]
【權(quán)利要求】
1. 一種非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎小鼠模型的建立方法，其特征是包括對小 鼠依次進(jìn)行高脂飲食誘導(dǎo)、鼠肝炎病毒感染，構(gòu)建非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎模 型小鼠。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述小鼠選擇C3H/HeN純系近交小鼠。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是所述高脂飲食誘導(dǎo)是采用高脂飼料喂養(yǎng)小 鼠至少12周，構(gòu)建非酒精性脂肪性肝病小鼠。
4. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是所述鼠肝炎病毒感染是對高脂飲食誘導(dǎo)后 的小鼠注射鼠肝炎病毒，感染小鼠，建立非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎小鼠模型。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征是所述鼠肝炎病毒選擇鼠肝炎3型病毒。
6. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征是采用腹腔注射的方式注射所述的鼠肝炎3型病 毒。
7. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征是所述鼠肝炎病毒的注射量為每只小鼠體內(nèi)注射 至少5PFU的鼠肝炎病毒。
8. -種非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎小鼠模型的建立方法，其特征是包括如下 順序進(jìn)行的步驟： A) 高脂飲食誘導(dǎo)處理 在無菌過濾空氣鼠籠內(nèi)，自由攝取食水的條件下，采用高脂飼料喂養(yǎng)小鼠至少12周， 誘導(dǎo)獲得非酒精性脂肪性肝病小鼠； B) 第一次體征監(jiān)測 對高脂飲食誘導(dǎo)處理的小鼠進(jìn)行體重、體型，肝臟形態(tài)、肝臟組織學(xué)觀察以及血液中丙 氨酸轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、空腹血糖、膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、胰島素水平及胰島 素抵抗水平測定； C) 病毒感染處理 將鼠肝炎病毒通過注射的方式注入非酒精性脂肪性肝病小鼠體內(nèi)，感染小鼠，建立非 酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎小鼠模型； D) 第二次體征監(jiān)測 分別于病毒感染第4、8、12、16、20、30天對病毒感染小鼠外周血檢測轉(zhuǎn)氨酶，觀察病毒 感染小鼠肝臟組織學(xué)及肝內(nèi)病毒復(fù)制變化。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征是步驟A)中所述小鼠選擇C3H/HeN純系近交小 鼠；步驟C)中所述鼠肝炎病毒選擇鼠肝炎3型病毒。
10. -種非酒精性脂肪性肝病合并病毒性肝炎模型小鼠，其特征是按照如權(quán)利要求 1-9任一所述方法構(gòu)建而成。
【文檔編號】A61K35/76GK104365543SQ201410588721
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月28日
【發(fā)明者】寧琴, 羅小平, 習(xí)東, 吳婷, 王宏武, 王曉晶, 嚴(yán)偉明 申請人:華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院