一種調控小尾寒羊動脈平滑肌發育的csrp2基因及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于生物【技術領域】，特別提供了一種可以調控小尾寒羊動脈平滑肌發育的CSRP2基因cDNA序列及其克隆方法，該基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；應用該基因可以通過調控CSRP2基因的表達，將這一基因進行重組表達生產蛋白，為研究綿羊以及其他哺乳動物血管類疾病的分子藥物提供科學依據，在治療綿羊動脈損傷和檢測心血管疾病方面應用前景廣闊。
【專利說明】-種調控小尾寒羊動脈平滑肌發育的CSRP2基因及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學領域，具體地說，本發明涉及一種可以調控小尾寒羊動脈 平滑肌發育的CSRP2基因及其在綿羊疾病治療中的應用。
【背景技術】
[0002] 隨著生活水平的不斷提高，人們的膳食結構有了新變化，羊肉日益受到青睞，從而 促進了養羊業的規模化發展，羊病的危害給養羊業帶來極大損失，從分子生物學角度研究 治療羊病的方法越來越受到重視。
[0003] CRP家族是UM結構域蛋白中一類蛋白家族，有四個成員分別是CRPI、CRP2、 CRP3、TLP(Weiskirchen et al·，1995 ;Kirchner et al·，2001)，其中 CRP2 蛋白的編碼基 因 CSRP2(Cysteine and glycine-rich protein2)高表達于血管平滑肌中，動脈表達量 高于靜脈，在血管平滑肌發育過程中主要在肌細胞分化和維持細胞結構方面有重要作用 (Kihara T et al.，2011)。有研究報道稱，CRP2蛋白的缺乏會造成血管內膜增生并增強 動脈損傷后血管平滑肌細胞的遷移，并將CSRP2歸類到平滑肌細胞（SMC)的標記基因一列 (J. Herrmann et al.，2006)〇
[0004] 但到目前為止，尚未見到有關小尾寒羊CSRP2基因克隆和功能的研究報道，而其 對于血管平滑肌生長和發育的調控作用更是未知。
【發明內容】
[0005] 基于上述的原因，本發明提供了一種可以調控小尾寒羊平滑肌發育的CSRP2基 因，其cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示，全長899bp ;該序列中的開放閱讀框編碼氨基酸序列 如SEQ ID NO. 2所示，共編碼193個氨基酸；該基因具有調控血管平滑肌發育的功能，應用 該基因可以通過對該基因的表達調控進行操作，為研究綿羊以及其他哺乳動物血管類疾病 的分子藥物提供科學依據，而該分子藥物在治療綿羊動脈損傷和檢測心血管疾病方面應用 前景廣闊。
[0006] 本發明所提供的調控平滑肌發育的CSRP2基因，CDNA序列如SEQ ID NO. 1所示， 其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，CSRP2的cDNA序列長899bp，該序列中的開放閱 讀框編碼193個氨基酸。
[0007] 上述的CSRP2基因是通過如下方法獲得的：
[0008] (1)小尾寒羊主動脈總RNA的提取和反轉錄：
[0009] 采用TRIzol法提取小尾寒羊主動脈組織總RNA，提取的總RNA用核酸蛋白分析儀 進行檢測，要求總RNA吸光度0D260/280在1. 8至2. 0之間，并根據現有技術采用TaKaRa 公司的RrimeScript? RT reagent Kit試劑盒反轉錄合成cDNA第一鏈；
[0010] ⑵CSRP2基因 CDNA序列保守區的擴增：
[0011] 比對已有物種CSRP2基因的cDNA序列，根據保守區設計上下游引物，以步驟（1) 中的cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增，克隆測序得到保守區序列；
[0012] (3)應用降落巢式PCR法對CSRP2基因 cDNA序列的3'端進行擴增：
[0013] 根據步驟（2)所得保守區序列設計CSRP2基因的3'特異性內側和外側引物；
[0014] 以步驟⑴中提取的總RNA為模板，以OligodT-AP為引物，反轉錄獲得cDNA第一 鏈模板；
[0015] 以3'特異性外側引物和3'通用外側引物采用降落PCR法以步驟⑶中cDNA第 一鏈為模板進行第一輪PCR擴增；
[0016] 以3'特異性內側引物和3'通用內側引物采用同樣降落PCR法，以第一輪PCR擴 增產物為模板進行第二輪PCR擴增；
[0017] 對第二輪PCR產物經克隆測序得到CSRP2基因 cDNA序列的：V端序列；
[0018] (4)應用RACE法對CSRP2基因 cDNA序列的5'端進行擴增：
[0019] 以步驟（1)中提取的總RNA為模板依次進行去磷酸化處理、"去帽子"反應、接頭序 列連接反應并以TaKaRa公司的5' -Full RACE Kit With TAP試劑盒反轉錄合成cDNA的 第一鏈；
[0020] 根據步驟（2)所得保守區序列設計CSRP2基因的5'特異性內側和外側引物；
[0021] 以5'特異性外側和5'通用外側引物，以步驟⑷中得到的cDNA第一鏈為模板 進行第一輪PCR擴增；
[0022] 以5'特異性內側和5'通用內側引物，以第一輪PCR擴增產物為模板，進行第二 輪PCR擴增；
[0023] 對第二輪PCR產物經克隆測序得到CSRP2基因 cDNA序列的Y端序列；
[0024] (5)全長序列拼接及克隆測序驗證：
[0025] 根據重疊區域對上述步驟獲得的cDNA的保守區、5'和3'所得序列進行拼接， 獲得CSRP2基因的全長cDNA序列；設計兩端序列為上下游引物，PCR擴增并克隆測序得到 CSRP2基因的全長cDNA序列，獲得了 CSRP2的cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示，其編碼的氨 基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0026] 之后發明人利用qRT-PCR法測定CSRP2基因 cDNA序列在小尾寒羊心臟、主動 脈、肌肉等組織間的表達量，并最終發現CSRP2在主動脈中的表達量極顯著高于其他組織 (p〈0. 01)，初步表明該基因具有調控動脈平滑肌發育的功能。
[0027] 相對于現有技術，克隆小尾寒羊CSRP2基因及其蛋白的獲得，為進一步研究其在 綿羊以及其他哺乳動物平滑肌細胞生長、發育中的作用奠定了基礎。為研究綿羊以及其他 哺乳動物血管類疾病的分子藥物提供科學依據，在治療綿羊動脈損傷和檢測心血管疾病方 面應用意義深遠。
[0028] 綜上所述，本發明提供了一種可以調控動脈平滑肌發育的CSRP2基因，該基因具 有調控動脈平滑肌發育的功能，應用該基因可以通過對該基因的表達調控進行操作，為研 究綿羊以及其他哺乳動物血管類疾病的分子藥物提供科學依據，在治療綿羊動脈損傷和檢 測心血管疾病方面應用前景廣闊。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0029] 圖1為本發明中小尾寒羊CSRP2基因 cDNA保守區片段一擴增圖，
[0030] 圖中M為DL2000分子量標準；1為CSRP2基因保守區片段一序列；
[0031] 圖2為本發明中小尾寒羊CSRP2基因 cDNA保守區片段二擴增圖，
[0032] 圖中M為DL2000分子量標準；1為CSRP2基因保守區片段二序列；
[0033] 圖3為本發明中小尾寒羊CSRP2基因:V端擴增圖，
[0034] 圖中M為DL2000分子量標準；1為CSRP2基因:V端序列；
[0035] 圖4為本發明中小尾寒羊CSRP2基因 Y RACE擴增圖，
[0036] 圖中M為DL2000分子量標準；1為CSRP2基因 5'端序列；
[0037] 圖5為本發明中小尾寒羊CSRP2基因 cDNA全長序列擴增圖，
[0038] 圖中M為DL2000分子量標準；1為CSRP2的全長cDNA序列；
[0039] 圖6為本發明中CSRP2基因 mRNA在小尾寒羊不同組織中表達水平柱狀圖，
[0040] 圖中a、b表示小尾寒羊各組織間的差異極顯著性（p〈0. 01);由圖可見CSRP2主要 在王動脈中表達。
【具體實施方式】
[0041] 以下結合附圖對本發明的上述
【發明內容】
作進一步的詳細描述。應理解，這些實施 例僅為了說明本發明而不是為了限制本發明的保護范圍。
[0042] 下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照制造廠商所建議的實驗條 件或常規方法，如Sambrook等編著的分子克隆實驗手冊（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件。
[0043] 實施例I :主動脈總RNA的提取及反轉錄
[0044] 取小尾寒羊主動脈2g，使用TIANGEN公司的RNAsimple Total RNA Kit總RNA提 取試劑盒（Cat. #DP419)提取主動脈組織的總RNA，具體操作參照試劑盒說明進行；將提取 的 RNA 米用 TaKaRa 公司的 RrimeScript? RT reagent Kit (Cat. #RR037A)反轉錄合成 cDNA 第一鏈，-20°C保存備用。
[0045] 實施例2 :cDNA保守區序列的克隆與測序
[0046] (1)引物的設計：從NCBI上下載人、豬、牛、鼠等各物種CSRP2基因的cDNA序列， 以DNAMN 6. 0軟件進行比對獲得保守區序列，設計該基因 cDNA的保守區兩對引物為：
[0047] 上游引物 Fl :GCCGACAACAAATCCAAAC，如 SEQ ID NO. 3 所示；
[0048] 上游引物 F2 :TTGAGATGCCTGTCTGGG，如 SEQ ID NO. 4 所示；
[0049] 下游引物 Rl :TCAGCCAGCCTATCCAAGT，如 SEQ ID NO. 5 所示；
[0050] 下游引物 R2 :CTTTCTCGGTTCTGGGTTT，如 SEQ ID NO. 6 所示。
[0051] (2)PCR擴增：以實施例1獲得的cDNA第一鏈為模板，應用TIANGEN的PCR Master Mix (KT201)體系進行PCR擴增，具體如下：
[0052]
【權利要求】
1. 一種調控小尾寒羊動脈平滑肌發育的CSRP2基因，其特征在于：其cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2. 根據權利要求1所述的CSRP2基因，其特征在于：其來源于綿羊的富含半胱氨酸蛋 白2基因。
3. 權利要求1所述的調控動脈平滑肌發育的CSRP2基因在制備治療綿羊血管類疾病的 分子藥物中的應用。
【文檔編號】A61P9/00GK104313029SQ201410563043
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月21日 優先權日:2014年10月21日
【發明者】王建民, 劉冠卿, 張春蘭, 王桂芝, 紀志賓, 侯磊 申請人:山東農業大學