一種阿里紅咳喘片的制備方法及其在抑制小鼠畸胎瘤細胞f9細胞增殖藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于中藥【技術領域】，具體涉及一種阿里紅咳喘片的制備方法及應用。本發明的阿里紅咳喘片的制備方法，由阿里紅20g、洋李100g、蘆根80g、甘草60g、麻黃50g、木香30g、洋茴香120g、香附30g、豆蔻20g作為原料藥制成，采用超臨界萃取和微波萃取制備而成，使得甘草酸含量有很大提高。本發明還提供了阿里紅咳喘片在制備抑制小鼠畸胎瘤細胞F9細胞增殖藥物中的應用。
【專利說明】一種阿里紅咳喘片的制備方法及其在抑制小鼠畸胎瘤細胞 F9細胞增殖藥物中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于中藥【技術領域】，具體涉及一種阿里紅咳喘片的制備方法及其在抑制小 鼠畸胎瘤細胞F9細胞增殖藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 阿里紅咳喘口服液標準號WS-10245 (ZD-0245) -2002,記載于國家中成藥標準匯編 內科肺系分冊。由阿里紅20g、洋李100g、蘆根80g、甘草60g、麻黃50g、木香30g、洋茴香 120g、香附30g、豆蘧20g作為原料藥制成，具有止咳，平喘，祛痰的功效。用于寒性咳嗽，咯 痰不爽，急慢性支氣管炎、哮喘。
[0003] 現有技術中，尚未有阿里紅咳喘口服液在提取制備方面采用超臨界萃取和微波提 取技術的報道，而揮發油提取，水加熱提取的方法，工藝粗糙、落后，雜質多，導致患者用量 很大，不方便服用，嚴重影響了本品在臨床上應用。
【發明內容】
[0004] 為了解決上述的技術問題，本發明提供了一種阿里紅咳喘片的制備方法。
[0005] 本發明的另一個目的在于提供一種阿里紅咳喘片在制備抑制小鼠畸胎瘤細胞F9 細胞增殖藥物中的應用。
[0006] 本發明的目的是通過如下的方案實現的： 一種阿里紅咳喘片的制備方法，由阿里紅20g、洋李100g、蘆根80g、甘草60g、麻黃50g、 木香30g、洋茴香120g、香附30g、豆蘧20g作為原料藥制成，所述的制備方法由下列步驟組 成：取洋茴香、麻黃、木香、香附、豆蘧，加入到〇) 2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑 占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30-50°C，CO 2流量l-3ml/ g生藥· min，萃取時間150-200min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入3L的 70%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分 鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫 液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混 合，加入淀粉，70 %乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成200片，每片重0. 3g。
[0007] 優選的，上述的阿里紅咳喘片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中夾帶劑占總萃 取溶劑的體積百分比為5%。
[0008] 優選的，上述的阿里紅咳喘片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取壓力為 25MPa〇
[0009] 優選的，上述的阿里紅咳喘片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取溫度為 40。。。
[0010] 優選的，上述的阿里紅咳喘片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中CO2流量2!111/ g生藥· min。
[0011] 優選的，上述的阿里紅咳喘片的制備方法中，所述CO2超臨界萃取中萃取時間為 180min〇
[0012] 優選的，上述的阿里紅咳喘片的制備方法中，所述微波萃取功率為700W。
[0013] 優選的，上述的阿里紅咳喘片的制備方法中，所述微波萃取每次萃取時間為8分 鐘。
[0014] 上述的阿里紅咳喘片在制備抑制小鼠畸胎瘤細胞F9細胞增殖藥物中的應用。
[0015] 現有技術中，阿里紅咳喘口服液每次10ml，一日3次。阿里紅咳喘口服液因其是 口服液，味道較苦，不適宜小兒服用，另外，如果調味需要加糖比較多，不適糖尿病人服用， 患者依從性差。采用本發明方法制備成的阿里紅咳喘片每片重0. 3g，每次僅需2片，一日 服用3次。在具有更多活性成分的條件下大大減少了服用量。此結論可以通過下述試驗證 明。且制備成片劑，患者隨水吞下即可，服藥量小且無苦味，患者易于接受。
[0016] 試驗一、不同方法制備的阿里紅咳喘片中甘草酸含量的比較 1、儀器及試藥本發明阿里紅咳喘片：按實施例1方法制備，使用560g原料藥，經提取制 成200片，每片重0. 3g。原阿里紅咳喘口服液，按照WS-10245 (ZD-0245) -2002標準方法制 備。Agilentl200高效液相色譜儀；METTLER AE240電子分析天平；甘草酸對照品（中國藥 品生物制品檢定所）。
[0017] 2、方法 照高效液相色譜法（中國藥典2010年版一部附錄VI D)測定。
[0018] 色譜條件與系統適用性試驗用十八烷基鍵合硅膠為填充劑；甲醇-0. 2mol/L醋酸 銨溶液-冰醋酸（67 : 33 : 1)為流動相；檢測波長為250nm。理論板數按甘草酸單銨鹽 峰計算應不低于2000。
[0019] 對照品溶液的制備精密稱取甘草酸單銨鹽對照品l〇mg，置50ml量瓶中，用流動 相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（每Iml含甘草酸單銨鹽對照品0. 2mg，折合甘草酸為 0· 1959mg)。
[0020] 本發明阿里紅咳喘片供試品溶液的制備取本發明的阿里紅咳喘片，研細，取0. 6g， 精密稱定，置具塞錐形瓶中，加水IOml使溶解，溶液濾過，精密量取2ml濾液，移至蒸發皿 中，蒸干，殘渣加流動相使溶解，移至IOml量瓶中，加流動相至刻度，即得。
[0021] 對照產品供試品溶液的制備取對照的阿里紅咳喘口服液，精密量取2ml，移至蒸發 皿中，蒸干，殘渣加流動相使溶解，移至IOml量瓶中，加流動相至刻度，即得。
[0022] 測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μ 1，注入液相色譜儀，測定， 搖勻，即得。
[0023] 3、結果 結果表明，本發明阿里紅咳喘片中甘草酸的含量為3. 6-7. 2mg/片；而原阿里紅咳喘口 服液中甘草酸的含量為〇. 36mg/ml，每次服用量2片的甘草酸含量為原口服液劑含量的2-4 倍，在服用量減少的情況下，甘草酸含量有很大提高。
[0024] 上述研究表明，采用本發明制備方法制備的阿里紅咳喘片，有效成分含量遠遠高 于WS-10245 (ZD-0245)-2002標準記載的方法制備的阿里紅咳喘口服液。
【具體實施方式】
[0025] 下面結合具體實施例對本發明作更進一步的說明，以便本領域的技術人員更了解 本發明，但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例，凡基于本發明上述 內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。
[0026] 實施例1 取阿里紅20g、洋李100g、蘆根80g、甘草60g、麻黃50g、木香30g、洋茴香120g、香附 30g、豆蘧20g，將透骨草、五氣朝陽草、姜黃加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑， 夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力25MPa，溫度40°C，CCV流量2ml/g生 藥·π?η，萃取時間180min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入3L的70%乙醇， 投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次8分鐘，合并萃取液，濃 縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇， 濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70 % 乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成200片，每片重0. 3g。
[0027] 經檢測，成品中甘草酸的含量為7. 25mg/片。
[0028] 實施例2 取阿里紅20g、洋李100g、蘆根80g、甘草60g、麻黃50g、木香30g、洋茴香120g、香附 30g、豆蘧20g，將透骨草、五氣朝陽草、姜黃加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑， 夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4%，萃取壓力30MPa，溫度50°C，CO 2流量31111/^生 藥·π?η，萃取時間150min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入3L的70%乙醇， 投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次5分鐘，合并萃取液，濃 縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇， 濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70 % 乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成200片，每片重0. 3g。
[0029] 經檢測，成品中甘草酸的含量為4. 52mg/片。
[0030] 實施例3 取阿里紅20g、洋李100g、蘆根80g、甘草60g、麻黃50g、木香30g、洋茴香120g、香附 30g、豆蘧20g，將透骨草、五氣朝陽草、姜黃加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑， 夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為6%，萃取壓力15MPa，溫度30°C，CO 2流量11111/^生 藥·π?η，萃取時間200min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入3L的70%乙醇， 投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率800W，萃取2次，每次10分鐘，合并萃取液，濃 縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇， 濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70 % 乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成200片，每片重0. 3g。
[0031] 經檢測，成品中甘草酸的含量為3. 68mg/片。
[0032] 實施例4 :阿里紅咳喘片抑制小鼠畸胎瘤細胞F9細胞增殖的實驗研究資料 1.實驗材料 1. 1實驗用細胞株 小鼠畸胎瘤細胞F9細胞，山東大學實驗室細胞庫，DMEM+10% FBS常規培養。
[0033] 1. 2實驗藥物 研究藥物：本發明阿里紅咳喘片：按實施例1方法制備。
[0034] 藥液儲液：稱取IOOmg阿里紅咳喘片，溶于5ml無水乙醇中，0. 2 μ m濾器過濾， 500 μ Idoff管分裝，-20°c存儲，同時0. 2 μ m濾器過濾無水乙醇以備對照組之用。
[0035] 1. 3實驗試劑 DMEM(GIBC0 公司 Cat. No. 12100-061 Lot. No. 758137);胎牛血清（浙江天杭生物科 技有限公司Lot. No. 100419) ;NaHC03(上海久億化學試劑有限公司Cat. No. 11810-033 Lot. No. 1088387) ;Trypsin(AMRESC0 公司）；EDTA(AMRESC0 公司）！Penicillin G Sodium Salt (AMRESC0公司I) !Streptomycin Sulfate(AMRESCO);無水乙醇（溜博亞杜蘭經貿有限 公司）；MTT(Biosharp批號：0793) :PBS(實驗室自配）； 1. 4實驗器材 萊卡倒置顯微鏡（德國Leica型號：DMIL);可見-紫外光微孔板檢測儀（美國MD公 司型號：SPECTRAMAX 190) ;C02培養箱（FORMA型號：3111);超凈臺（蘇凈集團安泰公司制 造型號=SW-CJ-ZFD);純水儀（美國Spring公司型號：S/N 020579);精密移液器（法國吉 爾森公司型號：P2);電子天平（德國賽多利斯有限公司型號：BT323S);全自動高壓滅菌鍋 (日本SANK)公司型號：MLS-3020);臺式電熱鼓風干燥箱（上海精密實驗設備公司型號： DHG9123A);冰箱（西門子公司型號：KG18V21TI);液氮罐（CBS型號：2001);低速離心機 (上海安亭科學儀器廠型號：KA-1000) ;0· 2 μ m濾器（MILLIP0RE型號：SLGP033RB) ;lcm培 養皿（NEST公司）、96孔培養板（NEST公司）；細胞計數板；離心管、移液管、Tips若干。
[0036] 2.實驗方法 1)F9細胞用DMEM+10% FBS于37°C、5% CO2進行常規培養（10cm培養皿），當細胞生 長至對數期時，收集細胞，棄去培養液，PBS輕洗3遍，加入3ml 0. 25 %胰蛋白酶-0. 04% EDTA，37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培養基中和反應，吹打細胞后將其轉入離心管 中，IOOOrpm離心5min，調整細胞懸液濃度3 X IO4個/ml。
[0037] 2)將細胞種入96孔培養板中，每孔加入細胞懸液180 μ 1，培養板放入細胞培養箱 中（37°C，5% CO2)常規培養。
[0038] 3)根據細胞生長情況，一般長至50% -70%，加入阿里紅咳喘片溶液，繼續培養 24h。
[0039] 4) 24h 后加入 20 μ I MTT 溶液（5mg/ml，即 0· 5% MTT)，繼續培養 4h。
[0040] 5)4h后扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍干，每孔如入200 μ 1二甲基亞砜，置搖 床上低速振蕩l〇min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光值。
[0041] 6)同時設置本底（不加細胞，只加培養液），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解 介質、培養液、MTT、二甲基亞砜），每組設定6個復孔。
[0042] 7)結果以藥物對細胞的抑制率表示：細胞增值抑制率（％) = (對照孔OD值-給 藥孔OD值）、對照孔OD值X 100%。實驗重復3次。
[0043] 3.統計處理 采用Microsoft Excel 2007軟件中的相關分析和Student t檢驗，數據以mean土S. D.表不。
[0044] 4.實驗結果 MTT法實驗后統計結果顯示，與對照組比較，當劑量達到5mg/ml時，對F9細胞增殖抑制 有差異（P〈〇. 05)，劑量在10mg/ml時該差異具有顯著性（P〈0. 01)，當劑量達到15-20mg/ml 時有極顯著性差異（P〈〇. 001)。
[0045] 表1阿里紅咳喘片對F9細胞增殖抑制影響研究（X土 SD)
【權利要求】
1. 一種阿里紅咳喘片的制備方法，由阿里紅20g、洋李100g、蘆根80g、甘草60g、麻黃 50g、木香30g、洋茴香120g、香附30g、豆蘧20g作為原料藥制成，其特征在于，所述的制備方 法由下列步驟組成：取洋茴香、麻黃、木香、香附、豆蘧，加入到〇) 2超臨界萃取器中，乙醇作 為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30-50°C， C02流量l_3ml/g生藥·π?η，萃取時間150-200min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉 碎，加入3L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次， 每次5-10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到D101大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量 柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微 波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成200片，每片重0. 3g。
2. 根據權利要求1所述的阿里紅咳喘片的制備方法，其特征在于，所述C02超臨界萃取 中夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
3. 根據權利要求1所述的阿里紅咳喘片的制備方法，其特征在于，所述C02超臨界萃取 中萃取壓力為25 MPa。
4. 根據權利要求1所述的阿里紅咳喘片的制備方法，其特征在于，所述C02超臨界萃取 中萃取溫度為40 °C。
5. 根據權利要求1所述的阿里紅咳喘片的制備方法，其特征在于，所述C02超臨界萃取 中C02流量2ml/g生藥· min。
6. 根據權利要求1所述的阿里紅咳喘片的制備方法，其特征在于，所述C02超臨界萃取 中萃取時間為180min。
7. 根據權利要求1所述的阿里紅咳喘片的制備方法，其特征在于，所述微波萃取功率 為 7001
8. 根據權利要求1所述的阿里紅咳喘片的制備方法，其特征在于，所述微波萃取每次 萃取時間為8分鐘。
9. 權利要求1所述的阿里紅咳喘片在制備抑制小鼠畸胎瘤細胞F9細胞增殖藥物中的 應用。
【文檔編號】A61K9/20GK104288655SQ201410549220
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月16日 優先權日:2014年10月16日
【發明者】孫波 申請人:濟南新起點醫藥科技有限公司