針對h3n2犬流感病毒ha2蛋白的單克隆抗體的制作方法

針對h3n2犬流感病毒ha2蛋白的單克隆抗體的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種針對H3N2犬流感病毒HA2蛋白的單克隆抗體，屬于生物【技術領域】。利用2010年分離的H3N2犬流感病毒江蘇分離株JS/10，接種10日齡SPF雞胚，收集血凝效價大于等于6的尿囊液，純化病毒接種MDCK細胞，皮內多點注射接種小鼠，細胞融合后，經三次ELISA檢測已生成細胞集落的細胞上清，篩選出抗H3亞型雜交瘤細胞株mAbD7，中和抗體效價達1:12800，識別抗原鑒定證實其針對保守的HA2蛋白，抗體亞類為IgG2b。本發明制備針對H3N2犬流感病毒株JS/10的保守的HA2蛋白單克隆抗體，為H3N2犬流感病毒感染的治療提供了重要的免疫制劑，具有潛在的應用前景。
CCTCC No:C2014176
2014.09.18
【專利說明】針對H3N2犬流感病毒HA2蛋白的單克隆抗體

【技術領域】
[0001] 本發明涉及針對H3N2犬流感病毒HA2蛋白的單克隆抗體，屬于生物【技術領域】。標 準的雜交瘤技術，以一株H3N2犬流感病毒株JS/10為試驗毒株，最終通過血凝抑制、中和試 驗以及Westernblotting篩選得到針對保守蛋白HA2的單克隆抗體D7,為H3N2犬流感病毒 感染的治療提供重要的免疫制劑。

【背景技術】
[0002] 雜交瘤技術的原理是利用聚乙二醇（PEG)為細胞融合劑，使免疫小鼠的脾細胞與 具有體外長期繁殖能力的小鼠骨髓瘤細胞融為一體，在HAT選擇性培養基的作用下，只讓 融合成功的雜交瘤細胞生長，經過反復的免疫學檢測、篩選和單個細胞培養（克隆化），最 終獲得既能產生所需單克隆抗體，又能長期繁殖的雜交瘤細胞系。將這種雜交瘤細胞擴 大培養，接種于小鼠腹腔，在小鼠腹腔積液中即可得到高效價的單克隆抗體。而具有中和 活性的單克隆抗體，可通過阻止病毒吸附或病毒與宿主細胞間的融合，發揮抗病毒感染作 用。有研究表明，具有中和活性的單克隆抗體能有效預防流感病毒感染[SkehelILWiley DC.Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annu Rev Biochem2000, 69:531-569. ]〇
[0003] 流感病毒屬于正黏病毒科的一種單鏈負股RNA病毒，分為A、B、C三個型，其中A型 流感病毒是一種具有高度傳染性的病原體，可感染禽類和多種哺乳動物宿主。犬流感病毒 (canine influenza virus, CIV)是一種新發現的能在犬中引起流行的高度接觸性呼吸道 傳染病。犬流感病毒不僅對犬類的生存和健康帶來嚴重的危害，同時也給人類健康帶來巨 大的風險。一方面，流感病毒通過在犬等哺乳動物體內的適應，可能會更容易獲得感染人的 能力，犬是人類最親密的伴侶動物，與人密切接觸機會較多，犬有可能會作為中間宿主將流 感病毒傳播給人類；另一方面，研究表明多種亞型的流感病毒能夠感染犬類，當犬類感染兩 種以上的流感病毒時，流感病毒可能會在犬體內經過基因重配形成能夠感染人的重組流感 病毒。有學者推測，犬可能成為下一個引起大流行的新型流感病毒"混合器"。因此控制犬 流感病毒的傳播和流行非常必要，在公共衛生上具有重要意義。
[0004] 自從2004年馬源H3N8亞型犬流感在美國爆發，引起人們極大的關注，改變了 此前人們認為犬對流感病毒具有抵抗力的觀點。2007年，H3N2亞型犬流感病毒在韓國 首次報道，隨后，在中國陸續分離到此亞型的犬流感病毒。目前H3N2亞型犬流感病毒 已經成為中國犬群中流行的主要亞型[Zeng XJ，Lin Y，Zhao YB et al, Experimental infection of dogs with H3N2canine influenza virus from China. Epidemiol Infect2013, 141:2595-2603.]。
[0005] 疫苗接種是預防和控制流感病毒感染的主要措施，目前對CIV疫苗研究已取得一 些進展。2009年，美國農業部門（USDA)批準的H3N8亞型CIV疫苗上市，有效減少了病毒 的傳播[Deshpande MS, Jirjis FFj Tubbs AL, et al. Evaluation of the efficacy of a canine influenza virus (H3N8)vaccine in dogs following experimental challenge. Vet Ther2009, 10:103-112.]。2012 年，韓國針對 H3N2CIV 的疫苗也已授權[Cho YS, Ha GW, Oh JS, et al. Canine influenza virus and vaccine therefore. United States Patent2012, Patent No:US8, 246, 962B2.]。盡管如此，疫苗接種仍有一定的局限性，在幼 年、老年及免疫力低下的犬群中疫苗接種有相當大的風險。而有中和活性的單克隆抗體，通 過抑制病毒對宿主細胞的吸附或復制過程而中和病毒；還可能參與體內其他的抗病毒保護 機制如免疫調理作用、抗體依賴性細胞介導的細胞毒（ADCC)作用等，從而激活患犬體內的 細胞免疫，達到清除病毒的作用。目前為止，還沒有針對犬流感病毒制備單克隆抗體進行治 療的報道。
[0006] 血凝素（HA)是流感病毒的主要抗原蛋白，參與病毒受體結合以及病毒入侵靶細 胞。HA分為兩個亞單位HAl和HA2,流感病毒只有當HA裂解為HAl和HA2時才能發揮病毒 感染作用，因此制備針對HA抗原位點的具有中和活性的單克隆抗體一直被作為評價流感 病毒保護性的標準。然而，由于HAl氨基酸序列的高度變異性，針對HAl的單抗中和活性有 限[de Jong JC, Palache AM, Beyer ff, et al. Haemagglutination-inhibiting antibody to influenza virus. Dev Biol (Basel) 2003, 115:63-73.];而 HA2 位于 HA 的莖部，是所有 亞型流感病毒HA的保守區域，對病毒的黏附以及病毒入侵宿主細胞膜起到關鍵作用。本發 明制備針對H3N2犬流感病毒株JS/10的保守的HA2蛋白單克隆抗體，為H3N2犬流感病毒 感染的治療提供了重要的免疫制劑，具有潛在的應用前景。


【發明內容】

[0007] 技術問題
[0008] 本發明的目的在于制備針對H3N2犬流感病毒JS/10株的HA2蛋白單克隆抗體，為 H3N2犬流感病毒感染的治療提供重要的免疫制劑。
[0009] 技術方案
[0010] 本發明將H3N2犬流感病毒江蘇分離株JS/10擴增純化后，用標準的雜交瘤技術獲 得針對該毒株的mAbs，通過血凝抑制試驗、細胞中和試驗以及分段表達HA蛋白后Western blotting分析，最終鑒定獲得針對HA2保守蛋白的mAb。步驟包括：
[0011] 1.通過雞胚接種擴增H3N2犬流感病毒JS/10株，并采用差速離心和蔗糖密度梯度 超速離心純化病毒；
[0012] 2.純化病毒接種犬腎細胞（MDCK)，培養后測定半數組織細胞感染量（TCID5tl);
[0013] 3.采用雜交瘤技術制備H3N2犬流感病毒單克隆抗體以及制備腹水；
[0014] 4.單克隆抗體特性分析，包括血凝抑制抗體效價、中和抗體效價測定，以及抗原特 性鑒定等；
[0015] 5.單抗對3株流感病毒株的動物交叉保護試驗。
[0016] 本發明提供了一種分泌針對H3N2犬流感病毒HA2蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細 胞，該雜交瘤細胞株mAb D7于2014年9月18日保藏于中國典型培養物保藏中心，地址：中 國武漢武漢大學，保藏編號為CCTCC No :C2014176,分類命名：雜交瘤細胞株mAb D7。
[0017] 用所述雜交瘤細胞株mAb D7制備的單克隆抗體，可以在制備預防或控制流感病毒 的藥物或免疫制劑中應用，或者在制備預防或控制流感病毒的藥物或免疫制劑組合物中得 到應用。
[0018] 有益效果
[0019] 本發明針對H3N2犬流感病毒HA2蛋白的單克隆抗體制備方法，為防控該病毒引起 的犬群感染，以及應對其對人類健康和公共衛生構成的潛在威脅奠定基礎。在本發明中，術 語"半數組織細胞感染量（TCID 5tl) "是指能夠引起半數組織細胞感染的病毒量，用來判定病 毒的毒力。
[0020] 在本發明中，術語"雜交瘤技術"是指骨髓瘤細胞與免疫動物脾細胞融合，形成能 分泌針對免疫抗原的特異性抗體即單克隆抗體的技術。該技術生產的單克隆抗體具有高特 異性、高純度、重復性好、敏感性強、生產成本低等優點。
[0021] 本發明有以下創新點：
[0022] 1.采用注射單克隆抗體的方法預防和控制流感病毒的感染，具有特異性強、效價 高等優點。與傳統的疫苗接種手段相比，取代了后者的不易大范圍推廣以及對犬群接種對 象的局限性的缺點，降低了風險性，提高了安全性；
[0023] 2.所獲單抗具有中和活性，中和效價高達1 :12800,可阻止病毒吸附或病毒與宿 主細胞間的融合，從而有效預防流感病毒的感染；
[0024] 3.本發明所獲單抗針對HA2蛋白，而針對HA抗原位點的具有中和活性的單克隆抗 體一直被作為評價流感病毒保護性的標準。
[0025] 由于HAl氨基酸序列的高度變異性，針對HAl的單抗中和活性有限，而HA2位于HA 的莖部，是所有亞型流感病毒HA的保守區域，并且對病毒的吸附以及病毒入侵宿主細胞膜 起到關鍵作用，因此本發明制備的針對H3N2犬流感病毒HA2蛋白的單克隆抗體可對H3N2 亞型不同犬流感病毒株，甚至其他流感病毒株均具有良好的保護效果，具有潛在的應用前 旦 -5^ 〇

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1 :利用差速離心及蔗糖密度梯度離心法純化的病毒電鏡學觀察，圖片放大倍 數為 130000。
[0027] 圖2 :H3N2犬流感病毒株感染MDCK后的細胞病變情況
[0028] A圖為病毒感染組，可見細胞出現明顯的空泡、拉絲結網現象；B圖為對照組，即未 接毒的MDCK細胞，細胞菱形且排列較整齊。
[0029] 圖3 :mAbD7的抗原鑒定，即D7對重組蛋白HA、HA1和HA2的Western Blotting結 果，1-4泳道分別為蛋白Marker、D7針對HA蛋白、D7針對HAl蛋白和D7針對HA2蛋白。
[0030] 圖4 :mAb D7預處理小鼠感染H3N2犬流感病毒株JS/10 (A)和⑶/12 (B)以及豬流 感病毒株SD/05(C)后的體重變化。結果用體重百分比表示，*，P〈0.05和**，P〈0.01，分別 指mAbD7處理組的小鼠體重相比病毒感染組差異顯著和極顯著；#，P〈0.05,指mAb D7處理 組的小鼠體重相比PBS對照組差異顯著。
[0031] 圖5 :mAb D7預處理小鼠感染H3N2犬流感病毒株JS/10 (A)和⑶/12 (B)以及豬流 感病毒株SD/05 (C)后的肺臟病毒載量檢測。結果以IoglO為底數的每克肺臟組織中RNA 病毒拷貝數表示。*，P〈〇. 05和**，P〈0. 01，分別指單抗D7組相比于其他兩組差異顯著和極 顯著。
[0032] 圖6 :mAb D7預處理小鼠感染H3N2犬流感病毒株JS/10和⑶/12以及豬流感病 毒株SD/05后的肺臟病變計分。基于肺臟病理組織學變化給予0-3分的計分。*，P〈0. 05 和**，P〈0.01，分別指mAb D7處理組的小鼠肺臟病變計分相比病毒感染組差異顯著和極顯 著。
[0033] 生物保藏
[0034] 雜交瘤細胞株mAb D7于2014年9月18日保藏于中國典型培養物保藏中心，地址： 中國武漢武漢大學，保藏編號為CCTCC N〇:C2014176,分類命名：雜交瘤細胞株mAb D7。

【具體實施方式】
[0035] 下面結合具體實施例。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常采用常規條件， 例如《分子克隆實驗室手冊》（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) (Sambrook等人）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的方法。而標準的雜交瘤技術，則 參照[Vareckova E, Betakova T, Mucha V，et al. Preparation of monoclonal antibodies for the diagnosis of influenza A infection using different immunization protocols. J Immunol Methodsl995, 180:107-116] 〇
[0036] (一）H3N2犬流感病毒HA2蛋白的單克隆抗體的制備
[0037] 1 ?標準毒株的選擇
[0038] 本發明中所使用的標準毒株為犬流感病毒病毒株A/Canine/ Jiangsu/06/2010 (H3N2)(簡稱 JS/10)，其 GenBank 序列號從 JN247615 到 JN247623。毒株 及其序列參照網址：http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore。
[0039] 2. H3N2犬流感病毒JS/10株的擴增與純化
[0040] 將病毒株JS/10的懸液接種10日齡SPF雞胚尿囊腔，每個雞胚接種0. 2mL。無菌 收取接種病毒后48-96h雞胚尿囊液，選擇血凝效價大于等于26的尿囊液；分別采用3000， 5000和8000rpm的轉速進行差速離心，使流感病毒充分釋放出來，再用20 %，40 %及60 %的 蔗糖密度梯度離心，使病毒沉降后，PBS重懸洗滌一次后，沉降的病毒顆粒用PBS重懸。純 化的病毒電鏡結果見圖1。
[0041] 3. JS/10細胞毒的獲得以及TCID5tl的測定
[0042] JS/10株雞胚尿囊液接種MDCK細胞，感染48_96h后，當細胞出現明顯的空泡、拉絲 結網細胞病變現象時，收集細胞毒，細胞病變（CPE)見圖2。
[0043] TCID5tl試驗：感染前ld，96孔細胞板鋪上單層MDCK細胞。第二天，JS/10株尿囊 液100 y L接種MDCK細胞，橫向依次倍比稀釋，倒數第二列為陽性對照，最后一列為空白對 照，每個稀釋度3個重復。每日觀察CPE，記錄各稀釋度出現細胞病變的孔數。病毒滴度表 示為 TCID5Q/mL，測得 JS/10 毒株毒價為 10713TCID5Q/mL。
[0044] 4. H3N2犬流感病毒單抗的制備
[0045] 1)動物免疫
[0046] 純化的病毒JS/10用PBS稀釋后接種6周齡BALB/c小鼠，一免加弗氏完全佐劑 (Sigma)皮內多點注射200 iiL，其中含有IOOiig的病毒。二免和三免采用弗氏不完全佐劑 (Sigma)皮內多點注射，免疫劑量與一免相同。三免兩周后眶下叢毛細管采血。ELISA檢測 血清抗體效價達到1 :25600。血清抗體效價達到峰值后進行最后一次加強免疫，即腹腔注 射PBS稀釋的100 ii g純化病毒200 ii L，3d取小鼠脾臟，進行細胞融合。
[0047] 2)飼養細胞的制備與細胞融合
[0048] 飼養細胞的制備：將1只BALB/c小鼠處死，體表酒精消毒。無菌剪開腹部皮膚，露 出腹膜，用無菌注射器吸取SmLHAT完全培養基（Sigma)注入腹腔，用酒精棉球輕輕按壓腹 腔數次，吸出培養基，置于細胞培養瓶中，計數后補加HAT完全培養基，使細胞密度為2 X IO5 個/mL，在融合前12h，每孔100 ii L加入96孔細胞培養板。
[0049] 細胞融合：無菌取脾，制備免疫脾細胞，與對數生長期的sp2/0細胞按1:6的比例 混合，IOOOrpm離心lOmin，棄上清。用手掌輕擊離心瓶底，使沉淀的細胞打散。將離心瓶底 部放入40°C水浴中，邊旋轉邊加入融合用的PEG50001mL，在Imin內加完，繼續旋轉同時加 入無血清1640培養基15mL，在90s內加完，由慢到快，前5s加lmL。室溫靜置IOmin后， IOOOrpm離心5min，棄上清，將HAT選擇培養液加入到細胞融合物中，懸浮細胞，分配到已有 飼養細胞的96孔細胞培養板，置于37°C、5% CO2的溫箱中培養。細胞融合后5d，用HAT培 養基半換液，IOd后用HT培養基（Sigma)全換液，篩選獲得生長良好的雜交瘤細胞。
[0050] 3)亞克隆與腹水的制備
[0051] 亞克隆：有限稀釋法進行。每次亞克隆均通過ELISA方法檢測上清效價，三次亞 克隆均陽性的單個克隆擴大培養并及時凍存。通過血凝抑制試驗篩選得到7株可分泌針對 JS/10病毒株的特異性單抗的雜交瘤細胞株。
[0052] 腹水制備：10周齡的經產母鼠預先腹腔注射液體石蠟，一周后腹腔注射擴大培養 的PBS稀釋的雜交瘤細胞，一周后觀察母鼠腹部及其精神狀態，待其腹部隆起明顯時，收集 腹水，離心后取上清56°C水浴30min滅活，-20°C冷凍保存。
[0053] (二）針對H3N2犬流感病毒JS/10株的單克隆抗體的鑒定
[0054] 1 ?血凝抑制（HI)效價測定
[0055] 將腹水用PBS稀釋5倍后做血凝抑制試驗。
[0056] 首先進行血凝試驗，以確定H3N2犬流感病毒JS/10株尿囊液的血凝效價。首先在 一次性血凝板的第一排的1-12孔加入50 ii L PBS，其次在第一孔加入50 ii L病毒尿囊液，混 勻后吸50 ii L到第3孔，依次倍比稀釋直到第10孔，混勻后棄去50 iiL。最后兩孔（11、12) 為紅細胞對照。接著每孔加入50iiLl%紅細胞輕輕搖動混勻。手動震蕩，37°C靜置30min 后觀察結果。以50%的紅細胞發生凝集的病毒懸液的最高稀釋度作為該病毒液的紅細胞凝 集效價。JS/10株尿囊液的血凝效價為2 6。
[0057] 做血凝抑制試驗前，首先用PBS稀釋病毒尿囊液以獲得4個血凝單位的犬流感病 毒。血凝抑制試驗的步驟如下：
[0058] (1)在血凝版的1-12孔加入25 ii L PBS，最后兩孔加入50 ii L分別作為陽性與陰 性對照。
[0059] (2)第一孔加入待撿已稀釋的腹水25 L，混勻后吸25 L至第2孔，倍比稀釋至 第10孔，混勻后棄25 iiL。
[0060] (3)在1-10孔，每孔加稀釋好的25 ii L4個血凝單位的病毒懸液，37°C靜置20min， 讓病毒與腹水，即抗原抗體充分反應。
[0061] (4)將1 %紅細胞輕輕搖動混勻，在1-12孔中每孔加入50 ii L。
[0062] (5)手動震蕩Imin后，37°C靜置30min后觀察結果。
[0063] 能將病毒凝集紅細胞的作用完全抑制的血清的最高稀釋倍數即為該稀釋腹水的 紅細胞凝集抑制效價。7株單抗的HI效價見表1。
[0064] 2?細胞中和效價測定
[0065] 將5倍稀釋的腹水作倍比稀釋（具體方法是在96孔板中先加入50 y L營養 液DMEM，再加50 L已稀釋的腹水，混勻后吸50 L至下一孔直至倒數第三孔），每支單 抗的腹水做3個重復。然后各孔內加入50iiL稀釋至200TCID5(I的JS/10細胞毒（毒價 為10 713TCID5(l/mL)37°C孵育Ih后，吸出每孔液體，加至長滿單層的MDCK細胞孔中。倒 數第二列為陽性對照，即細胞僅與病毒作用；最后一列為空白對照，即正常的MDCK細胞。 Reed-Muench法計算細胞中和效價。同時，將7株獲得的H3N2犬流感病毒單抗用小鼠單克 隆抗體Ig類/亞類鑒定ELISA試劑盒（Tiangen公司）對7株單抗亞類進行鑒定。HI效價 和中和效價及其抗體亞類見表1。單抗株D7中和效價高達I :12800。
[0066] 表17株針對H3N2犬流感病毒JS/10株的單抗特性
[0067]

【權利要求】
1. 一種分泌針對H3N2犬流感病毒HA2蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細胞，該雜交瘤細胞 株mAb D7于2014年9月18日保藏于中國典型培養物保藏中心，地址：中國武漢武漢大 學，保藏編號為CCTCC No :C2014176,分類命名：雜交瘤細胞株mAb D7。
2. 用權利要求1所述雜交瘤細胞株mAb D7制備的單克隆抗體。
3. 權利要求2所述單克隆抗體的應用。
4. 權利要求2所述單克隆抗體在制備預防或控制流感病毒的藥物或免疫制劑中的應 用。
5. 權利要求2所述單克隆抗體在制備預防或控制流感病毒的藥物或免疫制劑組合物 中的應用。
【文檔編號】A61P31/16GK104293739SQ201410535918
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月11日 優先權日:2014年10月11日
【發明者】劉永杰, 謝星, 龐茂達, 林焱, 趙艷兵, 梁珊, 陸承平 申請人:南京農業大學