七鰓鰻crbgp在制備抗血管新生藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開一種七鰓鰻CRBGP在制備抗血管新生藥物中的應用。本發明發現了七鰓鰻天然及重組CRBGP能夠抑制由bFGF誘導的人臍靜脈血管內皮細胞（HumanUmbilicalVeinEndothelialCells，HUVEC）的增殖，并呈劑量依賴性，其IC50為4.8μmol/L；同時發現七鰓鰻天然及重組CRBGP對由bFGF誘導的六日齡雞胚絨毛尿囊膜（chickenchorioallantoicmembrane，CAM）血管新生具有抑制作用，可應用于制備低毒、高效的抗血管新生藥物。
【專利說明】七鰓鰻CRBGP在制備抗血管新生藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種七鰓鰻CRBGP的用途，尤其是一種七鰓鰻CRBGP在制備抗血管新生藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]血管新生指從已存在的血管中發展出新的微血管，在一些正常的生理過程中(諸如胚胎發育、傷口愈合、黃體形成)扮演重要角色。然而，非預期的血管新生也會導致多種疾病發生，如慢性炎癥、糖尿病引起的視網膜病、脈絡膜新生血管、銀屑病、骨髓增生異常綜合癥、類風濕性關節炎以及腫瘤等，嚴重危害人類的生命健康和生活質量。因此，開發低毒、高效的抗血管新生藥物是目前治療與炎癥相關血管新生異常疾病的熱點。
[0003]富含半胱氨酸分泌蛋白(Cysteinerich secretory proteins, CRISP)是一類在進化上高度保守的蛋白質，含有16個高度保守的半胱氨酸殘基，可形成8對二硫鍵。空間結構主要由 N 端的 PR-1 結構域(pathogenesis-related group I domain)、C 端的 CRD 結構域(cysteine-rich domain)以及連接這兩個結構域的鉸鏈區域三部分組成。近年來研究發現，哺乳動物中的CRISP家族各成員主要分布于生殖道中，在精子的成熟、精卵融合以及免疫系統中發揮著非常重要的作用；而非哺乳動物中的CRISP家族成員則主要分布于腺體的分泌液中，能夠阻斷K+、Ca2+及環核苷酸門控通道等，并與炎癥反應密切相關。
[0004]七觸鰻CRBGP是從日本七觸鰻(ZaffijDeira japonica) 口腔腺中分離純化出的一種新型富含半胱氨酸分泌蛋白，因與CRISP家族成員具有高度同源性，同樣具有16個高度保守的半胱氨酸殘基，因此將其命名為富含半胱氨酸的口腔腺分泌蛋白(cysteine-richbuccal gland protein, CRBGP)。
[0005]七鰓鰻CRBGP的cDNA序列(開放閱讀框)含有774bp，其蛋白質有257個氨基酸組成，質譜測定分子量為25.6 kDa，其cDNA序列及由其推導的蛋白質氨基酸序列如下:
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目前，已經發現七鰓鰻天然CRBGP是Na+通道阻斷劑，能夠阻斷海馬神經元和背根神經元的Na+電流，降低海馬神經元和背根神經元的動作單位從而抑制神經元的興奮性；此外還發現七鰓鰻CRBGP對海馬神經元的K+通道也具有阻斷作用。迄今為止，尚未見有關富含半胱氨酸分泌蛋白抑制血管新生功能的報道。
【發明內容】
[0006]本發明發現了七鰓鰻CRBGP的抗血管新生功能，從而發明了七鰓鰻CRBGP在制備抗血管新生藥物中的應用。
[0007]本發明的技術解決方案是一種七鰓鰻CRBGP在制備抗血管新生藥物中的應用。
[0008]本發明發現了七鰓鰻天然及重組CRBGP能夠抑制由bFGF誘導的人臍靜脈血管內皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC)的增殖,并呈劑量依賴性,其IC50為4.8 μ mol/L ;同時發現七鰓鰻天然及重組CRBGP對由bFGF誘導的六日齡雞胚絨毛尿囊膜(chicken chor1allantoic membrane,CAM)血管新生具有抑制作用，可應用于制備低毒、高效的抗血管新生藥物。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0009]圖1七鰓鰻CRBGP對由bFGF誘導的HUVEC細胞增殖的抑制作用效果圖。
[0010]圖2七鰓鰻CRBGP對由bFGF誘導的六日齡雞胚絨毛尿囊膜血管新生的抑制作用效果圖。
【具體實施方式】
[0011]本發明通過分子篩層析技術(S^hadex G75)從日本七鰓鰻口腔腺中分離得到電泳純度的七鰓鰻天然CRBGP。
[0012]利用基因克隆手段將七鰓鰻CRBGP基因連接至pEGX-4T-l表達載體(或其他形式載體)于疋coli Rosetta中進行誘導表達，并采用GST親和層析方法純化重組七鰓鰻CRBGP, 12%聚丙烯酰胺凝膠電泳和質譜檢測目的蛋白質，其純度及準確性與目標蛋白相一致。
[0013]實驗:
1.MTT法測定七鰓鰻CRBGP對HUVEC細胞增殖的抑制作用。
[0014](I)將狀態良好的HUVEC細胞接種于96孔板中，并在含有bFGF (終濃度為3ng/mL)的RPMI 1640培養液中培養24小時；
(2)實驗組依次加入不同濃度梯度(5μ L、10 μ L、15 μ L、20 μ L)的七鰓鰻天然CRBGP，對照組加入等體積的PBS，繼續培養24小時；
(3)加入終濃度為0.5 mg/mL的MTT溶液10 μ L，于37°C，CO2培養箱中繼續培養4小時；
(4)輕輕吸去培養液，并向96孔板中加入DMSO(100 μ L)，在37°C的搖床中振蕩培養10分鐘； (5)利用酶標儀測定對照組和實驗組細胞在492nm處的吸收值；
(6)每組實驗均為3次實驗取平均值；
(7)細胞的殺傷率=(對照組吸光度的平均值-實驗組吸光度的平均值)/對照組吸光度的平均值X 100%。
[0015]實驗結果如圖1所示:表明七鰓鰻CRBGP能夠抑制由bFGF誘導的人臍靜脈血管內皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC)的增殖,并呈劑量依賴性,其IC50 為 4.8 μ mol/Lo
[0016]2.利用雞絨毛尿囊膜系統進行體內抗血管新生功能測定。
[0017]選用雞絨毛尿囊膜(chicken chor1allantoic membrane, CAM)模型觀察七觸鰻CRBGP對雞胚血管新生的抑制作用。CAM模型是目前篩選研究抗血管新生藥物和作用機制的最佳模型之一，具有實驗周期短、結果快等特性，被廣大學者認可。通常情況下，正常雞胚的血管從第6日開始便迅速形成和擴張，此時血管發育旺盛，主要以芽生、套疊方式生成。首先采用bFGF (200 ng/embryo)誘導雞胚血管新生，24小時后采用不同濃度的七鰓鰻CRBGP或等量的PBS作用于雞胚。具體步驟如下:
(1)采用75%的酒精棉球將剛購入的六日齡雞胚表面擦拭干凈；
(2)使用銼刀在距離胚頭的1/3處挫出Icm2的小窗；
(3)將無菌的玻璃纖維濾紙片置于CAM內有血管處，并在濾紙片上加入bFGF(200 ng)或等量PBS ；
(4)用透明膠帶將小窗封好，于37°C恒溫箱中孵育24小時；
(5)在濾紙片上加入不同濃度梯度(0.5 μ g>l μ g>5 μ g>10 μ g、20 Ug的七觸鰻天然CRBGP或等量的PBS，并用透明膠帶封好；
(6)繼續放入37°C恒溫箱中孵育24小時；
(7)24小時后，將濾紙片小心揭除，隨即進行拍照。
[0018]結果如圖2所示:與PBS對照組相比，經bFGF處理的CAM血管更加清晰，呈葉脈狀且分枝繁多，血管的數目和直徑都明顯的增加。當于第7日加入0.5 yg的七鰓鰻CRBGP時，雞胚血管的數目減少、在藥物處理周圍無放射狀的密集血管網絡、血管稀疏并細小。隨著七鰓鰻CRBGP濃度的增加(I μ g,5 μ gUO μ g)，雞胚血管的主枝出現明顯地斷裂，血管的數目也明顯地減少，血管色淡且呈淺黃。當于第7日加入20 μ g的七鰓鰻CRBGP時，雞胚的血管完全被破壞，出現了明顯的無血管區域，且血管壁完全溶解。這表明七鰓鰻CRBGP對由bFGF誘導的雞胚血管新生具有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性。
【權利要求】
1.一種七鰓鰻CRBGP在制備抗血管新生藥物中的應用。
【文檔編號】A61K38/17GK104288753SQ201410528552
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月10日 優先權日:2014年10月10日
【發明者】李慶偉, 肖蓉, 劉宇, 姜琪, 王紅艷 申請人:遼寧師范大學