一種具備抗菌性和促進成骨細胞生長的鈦金屬改性方法
【專利摘要】本發明公開了一種具備抗菌性和促進成骨細胞生長的鈦金屬改性方法，將鈦金屬預處理，配制可粘附在鈦金屬表面的含有一定交聯空間結構的混合液，其中混合液中含具有抗菌作用的硝酸銀，再加入成骨細胞和預處理鈦金屬，真空干燥，得到涂層中包覆有成骨細胞的鈦金屬，最后浸入胰酶溶液中15-45秒，超聲洗脫，真空干燥，得到本發明所述能夠促進成骨細胞生長的改性醫用鈦金屬。本發明方法簡單，制備條件溫和，在制備過程中無有害物質產生，本發明所得產品能有效識別成骨細胞，促進成骨細胞在鈦金屬表面的快速生長，有效抑制細菌生長；將本發明所得產品作為植入體植入體內后，有利于成骨細胞在鈦金屬表面固定生長。
【專利說明】一種具備抗菌性和促進成骨細胞生長的鈦金屬改性方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫用材料的表面改性領域，具體為一種兼具抗菌性及促進成骨細胞生長的鈦金屬改性方法。
【背景技術】
[0002]隨著醫療技術發展，醫用鈦金屬被作為牙種植體和骨種植體等種植材料廣泛應用在牙列缺損、骨頭損失等疾病治療，在挽救人的生命方面發揮了重要作用。然而該類手術的感染率很高，可能會導致大量抗生素治療、去除種植體甚至死亡等嚴重后果。種植體相關感染高發的主要原因有兩點:菌斑在種植體表面聚集和種植體骨結合界面抵抗能力低下。因此，需要提高鈦金屬的抗菌性能和促進成骨細胞生長功能。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是提供一種具備抗菌性和促進成骨細胞生長的鈦金屬改性方法，經過改性之后的鈦金屬提高涂層的穩定性，增強粘附效果，同時在加入抗菌物質，在提高鈦金屬的促成骨細胞生長能力的同時增強鈦金屬的抗菌能力。
[0004]本發明提供的技術方案是:
[0005]一種具備抗菌性和促進成骨細胞生長的鈦金屬改性方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0006]步驟一、鈦金屬預處理，將鈦金屬在10_20ml l_3mol/L丙酮溶液中超聲處理2-3次，每次15-45分鐘，然后放入體積分數為30-40%硝酸溶液中浸泡5-30分鐘，真空干燥，得到預處理鈦金屬；
[0007]步驟二、涂層制備，取預處理鈦金屬浸泡于多巴胺水溶液中20-30小時，得到粘有涂層的鈦金屬；
[0008]步驟三、成骨細胞的引入，分別配置殼聚糖溶液、環氧氯丙烷溶液及硝酸銀溶液，混合所述三種溶液，得到可與涂層連接的具有一定交聯空間結構的混合液，向所述混合液中加入成骨細胞和預處理鈦金屬，浸泡5-10分鐘后，取出預處理鈦金屬，真空干燥得到涂層中包覆有成骨細胞的鈦金屬；
[0009]步驟四、成骨細胞的移除，將步驟三得到的涂層中包覆有成骨細胞的鈦金屬浸入胰酶溶液中30-50秒，再進入蒸餾水中超聲5-10分鐘，使所述成骨細胞從所述交聯空間結構內移除，并使預處理鈦金屬表面形成具有與成骨細胞相匹配的空間結構的涂層，即得所述兼具抗菌性及促成骨細胞生長的改性鈦金屬。
[0010]優選的是，所述的具備抗菌性和促進成骨細胞生長的鈦金屬改性方法中，步驟二中多巴胺水溶液的用量為10-20ml密度為l-3mg/mL。
[0011]優選的是，所述的具備抗菌性和促進成骨細胞生長的鈦金屬改性方法中，步驟三中所述殼聚糖溶液是取2-4g殼聚糖溶于30-80ml含0.3-0.5mmol乙酸的蒸餾水得到；環氧氯丙烷溶液是取0.2-0.5g環氧氯丙烷溶于5-15ml乙醇得到；硝酸銀溶液是取0.01-0.05g硝酸銀溶于l_5ml蒸餾水制得；
[0012]優選的是，所述的具備抗菌性和促進成骨細胞生長的鈦金屬改性方法中，所述殼聚糖是端基為羧基，分子量為10-100萬的殼聚糖。
[0013]優選的是，所述的具備抗菌性和促進成骨細胞生長的鈦金屬改性方法中，步驟三中所述成骨細胞的用量為l_5ml，所述成骨細胞密度為2-10 X 104/ml。
[0014]優選的是，所述的具備抗菌性和促進成骨細胞生長的鈦金屬改性方法中，步驟四中所述胰酶溶液為用量為2-10ml，所述胰酶溶液濃度為0.25-1% ;所述蒸餾水用量為30_50mlο
[0015]優選的是，所述的具備抗菌性和促進成骨細胞生長的鈦金屬改性方法中，所述真空干燥條件為壓強0.1-0.3MPa，溫度為80-120°C，干燥時間為10-30分鐘。
[0016]本發明帶來的有益效果是:本發明中采用分子印跡的方法，先使多巴胺緊密粘附在鈦金屬表面，再與涂層連接的具有一定交聯空間結構形成一個交聯的空間結構，引入成骨細胞，在加熱條件下將成骨細胞包覆在交聯空間結構中，同時殼聚糖的羧基可以跟多巴胺的胺基結合，穩定的與鈦金屬連接，粘附在鈦金屬表面，增加了涂層在鈦金屬表面的穩定性；在胰酶的作用下將成骨細胞移除，鈦金屬表面留下成骨細胞的“印跡”，即為與成骨細胞相匹配的空穴，具有對成骨細胞分子有效識別的功能，當鈦金屬表面的空穴與成骨細胞接觸時，成骨細胞在鈦金屬表面固定生長。并且在對鈦金屬進行改性前，先通過丙酮溶液進行除油處理，除去鈦金屬表面的氧化膜，有效防止涂層脫落，促進涂層的穩定性，通過在鈦金屬表面引入殼聚糖具有抗菌效果，提高了鈦金屬的抗菌性能。殼聚糖的生物相容性良好，在生物醫學及制藥等方面有較多應用，鈦金屬制成的植入體與人體具有很好的生物相容性，減少排斥反應造成的不良影響，本發明的制備方法簡單，條件溫和，無有害副產物生成。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1為本發明所述具備抗菌性和促進成骨細胞生長的鈦金屬改性方法流程示意圖圖；
[0018]圖2為本發明所得產品進行抗菌能力試驗的結果示意圖；
[0019]圖3為本發明所得產品與普通鈦片進行細胞活性檢測的結果示意圖；
[0020]圖4為本發明所得產品與普通鈦片進行細胞毒性分析的結果示意圖。
【具體實施方式】
[0021]下面結合說明書附圖對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。
[0022]如圖1所示，一種具備抗菌性和促進成骨細胞生長的鈦金屬改性方法備方法，其中，包括以下步驟:
[0023]步驟一、鈦金屬預處理，將鈦金屬在10_20ml l_3mol/L的丙酮溶液中超聲處理2-3次，每次15-45分鐘，然后放入20-30ml體積分數為40-50%的硝酸溶液中浸泡5_30分鐘，在壓強0.1-0.3MPa，溫度為80-120°C，干燥10-30分鐘，得到預處理鈦金屬；
[0024]步驟二、涂層制備，取預處理鈦金屬浸泡于30_50ml l_3mg/mL多巴胺水溶液中20-30小時，得到粘附有涂層的鈦金屬；
[0025]步驟三、成骨細胞的引入，取2-4g殼聚糖溶于30-80ml含0.3-0.5mmol乙酸的蒸餾水得到殼聚糖溶液；取0.2-0.5g環氧氯丙烷溶于5-15ml乙醇得到環氧氯丙烷溶液；取0.01-0.05g硝酸銀溶于l_5ml蒸餾水得到硝酸銀溶液，混合所述三種溶液，得到可與涂層連接的具有一定交聯空間結構的混合液，向所述混合液中加入l_5ml密度為2-10X 104/ml成骨細胞，攪拌均勻后，再加入面積為IXlcm2的預處理鈦金屬，浸泡5-10分鐘后，取出預處理鈦金屬，在壓強0.1-0.3MPa，溫度為80-120°C，干燥10-30分鐘，得到涂層中包覆有成骨細胞的鈦金屬；
[0026]步驟四、成骨細胞的移除，將步驟三得到的涂層中包覆有成骨細胞的鈦金屬浸入2-10ml濃度為0.25-1 %胰酶溶液中30-50秒，再浸入30_50ml蒸餾水超聲5_10分鐘，在壓強0.1-0.3MPa，溫度為80-120°C，干燥10-30分鐘，使所述成骨細胞從所述交聯空間結構內移除，并使預處理鈦金屬表面形成具有與成骨細胞相匹配的空間結構的涂層，即得所述能夠具備抗菌性和促進成骨細胞生長的鈦金屬
[0027]所述的具備抗菌性和促進成骨細胞生長的鈦金屬改性方法中，所述殼聚糖是端基為羧基分子量為10-100萬的殼聚糖。
[0028]實施例1
[0029]步驟一、鈦金屬預處理,將鈦金屬在20ml lmol/L的丙酮溶液中超聲處理3次,每次45分鐘，然后放入30ml體積分數為40%的硝酸溶液中浸泡25分鐘，在壓強0.3MPa，溫度為80°C，干燥10分鐘，得到預處理鈦金屬；
[0030]步驟二、涂層制備，取預處理鈦金屬浸泡于50ml lmg/mL多巴胺水溶液中24小時，得到粘附有涂層的鈦金屬；
[0031]步驟三、成骨細胞的引入，取2.5g端基為羧基分子量為10-100萬的殼聚糖溶于50ml含0.5mmol乙酸的蒸懼水得到殼聚糖溶液；取0.2g環氧氯丙燒溶于1ml乙醇得到環氧氯丙烷溶液；取0.0lg硝酸銀溶于Iml蒸餾水得到硝酸銀溶液，混合所述三種溶液，得到可與涂層連接的具有一定交聯空間結構的混合液，向所述混合液中加入3ml密度為2X 14/ml成骨細胞，攪拌均勻后，再加入面積為IXlcm2的預處理鈦金屬，浸泡10分鐘后,取出預處理鈦金屬，在壓強0.1MPa，溫度為100°C，干燥30分鐘，得到涂層中包覆有成骨細胞的鈦金屬；
[0032]步驟四、成骨細胞的移除，將步驟三得到的涂層中包覆有成骨細胞的鈦金屬浸入5ml濃度為0.25%胰酶溶液中50秒，再浸入蒸餾水中超聲5_10分鐘，在壓強0.3MPa，溫度為100°C，干燥30分鐘，使所述成骨細胞從所述交聯空間結構內移除，并使預處理鈦金屬表面形成具有與成骨細胞相匹配的空間結構的涂層，即得所述能夠具備抗菌性和促進成骨細胞生長的鈦金屬。
[0033]1、抗菌能力實驗
[0034]將本發明所得產物依據GB15979-2002進行對金黃色葡萄菌、大腸埃希氏菌、白假絲酵母、枯草芽孢桿菌黑色變種進行抑菌試驗。分別在本發明所得產物表面接種Iml濃度為15的菌液在37°C培養Id后，培養液用來檢測試樣表面粘附細菌中的活菌數。用倍比稀釋和涂布培養法檢測活菌數，實驗結果列于如圖2所示。結果表明，由本發明制得的產品對金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)、大腸埃希氏菌(ATCC 25922)、白假絲酵母(ATCC 10231)、枯草芽孢桿菌黑色變種(ATCC 9372)都具有很強的抗粘附性能，其抗細菌粘附率達99%以上。
[0035]2、細胞活性檢測
[0036]將普通鈦片和本發明產物分別置于24孔板中(每組設三個平行孔)。Iml密度為2 XlOVml的細胞懸液接種于試樣表面，然后培養1、4和7d。到預定時間點后，試樣用pH =7.4的磷酸鹽緩沖液輕柔漂洗三次后轉移到新的24孔板內。每孔加入200 μ I濃度為5mg/ml的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽和800 μ I無血清無酚紅DMEM培養基。37°C孵育4h后吸棄上清，加入Iml 二甲基亞砜溶解生成的結晶物，每孔取200 μ I溶解液轉到96孔培養板，用分光光度計于490nm處測其OD值。試驗結果如圖3所示。
[0037]3、細胞毒性分析
[0038](I)試驗原理:以乳酸脫氫酶(LDH)的活性作為細胞毒性指標來評估本發明產物的細胞毒性大小，其原理為乳酸脫氫酶(LDH)是一種穩定的蛋白質，存在于正常細胞的胞質中，一旦細胞膜受損，LDH即被釋放到細胞外；LDH催化乳酸形成丙酮酸鹽，和四唑鹽類(INT)反應形成紫色的結晶物質，可通過500nm酶標儀進行檢測。
[0039](2)試驗步驟:分別普通鈦片和本發明產物分別放入24孔板中，然后將IX 14個細胞的成骨細胞接種到24孔板中，并培育I天。分別收集培養液，離心后取上清用于LDH活性檢測。試驗結果如圖4所示。
[0040]4、試驗結果
[0041]從圖2中可以看出，由本發明所得產品對金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)、大腸埃希氏菌(ATCC 25922)、白假絲酵母(ATCC 10231)、枯草芽孢桿菌黑色變種(ATCC 9372)都具有很強的殺菌性，其殺菌率達99%以上。
[0042]從圖3中可以看出普通鈦片和本發明產物的OD值隨著培養時間的增加而增大，但是可以看出，普通鈦片隨著培養時間的增加OD值的增長緩慢，相比之下，本發明產物的OD值在隨著培養時間的增加快速增長，在培養7天時，本發明產品相較于普通鈦片的OD值成倍增長。由此可以得出，本發明產品具有明顯的細胞增殖活性效果。
[0043]從圖4中可以知道本發明產品與普通鈦片相比，普通鈦片的LDH活性(U/L)值為236，而本發明產品的LDH活性(U/L)值為225，低于普通鈦片的LDH值，表明本發明產物無細胞毒性。
[0044]盡管本發明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發明的領域，對于熟悉本領域的人員而言，可容易地實現另外的修改，因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發明并不限于特定的細節和這里示出與描述的圖例。
【權利要求】
1.一種具備抗菌性和促進成骨細胞生長的鈦金屬改性方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟一、鈦金屬預處理，將鈦金屬在10-20mll-3mol/L丙酮溶液中超聲處理2_3次，每次15-45分鐘，然后放入體積分數為30-40%硝酸溶液中浸泡5-30分鐘，真空干燥，得到預處理鈦金屬； 步驟二、涂層制備，取預處理鈦金屬浸泡于多巴胺水溶液中20-30小時，得到粘附有涂層的鈦金屬； 步驟三、成骨細胞的引入，分別配置一定濃度的殼聚糖溶液、環氧氯丙烷溶液及硝酸銀溶液，混合所述三種溶液，得到可與涂層連接的具有一定交聯空間結構的混合液，向所述混合液中加入成骨細胞和預處理鈦金屬，浸泡5-10分鐘后，取出預處理鈦金屬，真空干燥得到涂層中包覆有成骨細胞的鈦金屬； 步驟四、成骨細胞的移除，將步驟三得到的涂層中包覆有成骨細胞的鈦金屬浸入胰酶溶液中30-50秒，再放入蒸餾水中超聲5-10分鐘，使所述成骨細胞從所述交聯空間結構內移除，并使預處理鈦金屬表面形成具有與成骨細胞相匹配的空間結構的涂層，即得兼具抗菌性及促成骨細胞生長的改性鈦金屬。
2.如權利要求1所述的具備抗菌性和促進成骨細胞生長的鈦金屬改性方法，其特征在于，步驟二中多巴胺水溶液的用量為10-20ml，濃度為l-3mg/mL。
3.如權利要求1所述的具備抗菌性和促進成骨細胞生長的鈦金屬改性方法，其特征在于，步驟三中所述殼聚糖溶液是取2-4g殼聚糖溶于30-80ml含0.3-0.5mmol乙酸的蒸餾水得到；環氧氯丙烷溶液是取0.2-0.5g環氧氯丙烷溶于5-15ml乙醇得到；硝酸銀溶液是取0.01-0.05g硝酸銀溶于l_5ml蒸餾水制得。
4.如權利要求3所述的具備抗菌性和促進成骨細胞生長的鈦金屬改性方法，其特征在于，所述殼聚糖是端基為羧基，分子量為10-100萬的殼聚糖。
5.如權利要求1所述的具備抗菌性和促進成骨細胞生長的鈦金屬改性方法，其特征在于，步驟三中所述成骨細胞的用量為l_5ml，所述成骨細胞密度為2-10X104/ml。
6.如權利要求1所述的具備抗菌性和促進成骨細胞生長的鈦金屬改性方法，其特征在于，步驟四中所述胰酶溶液為用量為2-10ml，所述胰酶溶液濃度為0.25-1 %;所述蒸餾水為30_50mlο
7.如權利要求1所述的具備抗菌性和促進成骨細胞生長的鈦金屬改性方法，其特征在于，所述真空干燥條件為壓強0.1-0.3MPa，溫度為80-120°C，干燥時間為10-30分鐘。
【文檔編號】A61L27/06GK104258468SQ201410521036
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月30日 優先權日:2014年9月30日
【發明者】李培源, 蘇煒, 霍麗妮, 陳睿 申請人:廣西中醫藥大學