一種具有降尿酸功效的柴魚蛋白水解物制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種具有降尿酸功效的柴魚蛋白水解物制備方法。其主要制備步驟包括：原料熱處理、限制性酶解、膜分離-陰離子交換層析-凝膠過濾層析分離、濃縮、噴霧干燥得到具有降尿酸功效的柴魚蛋白水解物。氨基酸分析顯示酶解物肽段一級氨基酸序列中含四種氨基酸：組氨酸、精氨酸、賴氨酸及蘇氨酸，該四種氨基酸質量含量總和約占酶解物總氨基酸含量的70%。經MALDI-TOF-MS質譜確定其主要肽功效組分的分子量均小于700Da。經體外降尿酸實驗證明本發明具有顯著抑制尿酸生成的作用，抑制率達到50%以上；經氧嗪酸鉀造模的高尿酸血癥大鼠動物驗證表明，可顯著降低大鼠血清尿酸以及血清肌酐水平，表現出較好的腎臟保護功效。
【專利說明】一種具有降尿酸功效的柴魚蛋白水解物制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種蛋白水解物的制備方法，具體涉及一種具有降尿酸功效的柴魚蛋 白水解物制備方法。
【背景技術】
[0002] 高尿酸血癥是人體的一種代謝疾病，隨著現代社會的發展，高血尿酸已經成為繼 高血壓、高血脂和高血糖之后的第四個重要危險因素。高血尿酸值是引發痛風癥的直接原 因，其過程是體內嘌呤代謝紊亂以及排泄異常導致人體血液中尿酸值升高，最終尿酸在人 體的關節等處形成結晶，從而引起炎癥反應，并最終導致痛風的發生。正常人體血清尿酸水 平，成年男性為208-428 ymol/L，成年女性為155-357 μπιοΙ/L。
[0003] 高尿酸血癥的發病機制主要有： (1)尿酸生成過多。人體中尿酸的來源分為內源性尿酸以及外源性尿酸。內源性尿酸 主要是細胞內蛋白質分解代謝產生的嘌呤類化合物經特定的酶作用產生的。外源性尿酸主 要是食物中的嘌呤類化合物經過人體消化吸收以及特定酶的催化作用后產生的。影響尿酸 生成的酶主要有兩類，一類是促進尿酸生成的酶，包括：磷酸核糖焦磷酸合成酶（PRPP)、腺 嘌呤磷酸核糖轉移酶(APRT)以及黃嘌呤氧化酶（XOD);另一類是抑制尿酸合成的酶：次黃 嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（HGPRT)。原發性痛風和繼發性痛風的發生部分原因是某些 因素使以上這些酶的活性改變，從而使尿酸生成增多而形成的。
[0004] (2)尿酸排泄減少。大部分痛風的發生都是因為尿酸排泄減少而導致的。研究發 現，近曲小管對尿酸鹽的主動分泌和重吸收需要尿酸鹽轉運蛋白的參與，當編碼該蛋白的 基因發生變異，導致排泄的尿酸減少，就會發生原發性痛風。繼發性痛風主要由于腎臟相關 疾病導致腎小球濾出的尿酸減少或者重吸收增加，從而產生高尿酸血癥。
[0005] 目前我國用于治療高尿酸血癥的藥物主要有： (1)抑制尿酸生成的藥物。主要是指黃嘌呤氧化酶抑制劑，如：別嘌呤醇 (Allopurinol )、奧西噪呤（Oxypurinol )、非布索坦（Fexbuxostat)、Y-700 以及 KT-651 等。
[0006] (2)促進尿酸排泄的藥物。主要包括丙磺舒、苯磺唑酮和苯溴馬隆。
[0007] (3)促進尿酸分解的藥物。主要包括拉布立酶（ELITEK, Rasburicase)以及 PEG-uricase〇
[0008] 但是以上藥物都有較強的副作用和過敏反應，對人體臟器有一定的毒害損傷作 用，且價格比較昂貴，因此亟需尋找高效低毒的功效成分，對于高尿酸血癥的預防和治療具 有重要的社會和經濟意義。
[0009] 有研究表明從某些植物提取的天然產物有一定降尿酸功效。徐娜研究芹菜籽中黃 酮物質，發現木樨草素能有效抑制黃嘌呤氧化酶的活性，具有顯著的降尿酸功效。王海東采 用氧嗪酸鉀灌胃誘導小鼠高尿酸血癥模型研究金錢草水提物對其降尿酸效果，發現金錢草 水提物高中低劑量具有降低小鼠血清尿酸的效果。夏道宗等人通過給高尿酸血癥小鼠喂食 青梅醇提物研究其降尿酸效果，結果表明青梅醇提物在中、高劑量能降低高尿酸血癥小鼠 的血清尿酸水平，抑制其肝臟黃嘌呤氧化酶的活性，具有較好的降尿酸功效。但是目前市場 上以天然植物提取物為功效成分的保健食品或藥品并不多見，且安全性有待研究。
[0010] 富含生物活性的蛋白水解物近些年成為世界范圍的研究熱點，其具有易吸收、活 性好、制備簡單等特點。生物活性肽分為內源性活性肽以及外源性活性肽，內源性活性肽是 指生物體內存在的活性肽，外源性活性肽是指從動植物體蛋白經化學或酶法水解生產的具 有活性的肽段。研究發現，一些肽類物質對于降低尿酸值、預防和輔助治療痛風具有重要貢 獻，例如臨床上，還原型谷胱甘肽（GSH)可用于輔助治療痛風性腎病。近年來，研究發現一 些食源性生物活性肽也具有降低尿酸的作用。張銳等報道酪蛋白磷酸肽結合鈣粉對高尿酸 血癥大鼠血清尿酸水平有顯著干預效果，其機制可能是降低了肝臟黃嘌呤氧化酶、血清和 肝臟中腺苷脫氨酶活性。盡管如此，目前對于生物活性肽改善痛風癥候群的作用機制尚不 清楚。
[0011] 柴魚，屬鱸形總目、金槍魚亞目，因其魚體形態像炮彈又俗稱為炸彈魚，是重要的 海洋洄游魚類，主要產于太平洋、印度洋和大西洋，我國東海、南海的捕撈量大。柴魚肉可鮮 食，但我國主要把其加工成柴魚罐頭出口，其附加值不高。相比其他海洋魚類，柴魚蛋白質 含量高、脂肪含量低，目前尚未深度開發利用。本發明利用柴魚為原料，利用限制性酶解作 為技術手段，集成不同分離技術，篩選出具有顯著降尿酸功效的蛋白酶解物，對于開發以天 然降尿酸功效因子為核心成分的保健食品甚至藥品具有重要的參考價值。
[0012]
【發明內容】
[0013] 本發明的首要目的是利用柴魚鮮肉制備具有降尿酸活性的柴魚蛋白水解物的方 法。
[0014] 本發明技術方案如下。
[0015] 一種具有降尿酸功效的柴魚蛋白水解物制備方法，包括以下步驟： (1) 原料熱處理：新鮮柴魚，去頭、內臟、尾以及脊骨后，獲取純肌肉組織，于絞肉機絞 碎至糜狀，得到柴魚肉糜，加水蒸煮，后冷卻室溫，得到蒸煮后的柴魚肉糜； (2) 限制性酶解：將蒸煮后的柴魚肉糜調節pH值至6. 5-8. 5,按柴魚肉糜蛋白質量 0. 5%-2. 0%加入蛋白酶，于50-55°C水浴振蕩反應，反應結束后將水解液置于沸水中保溫 10-20 min滅酶，離心分離，取上清液，得柴魚蛋白水解上清液； (3) 采用膜分離-陰離子交換層析-凝膠過濾層析，三步法分離柴魚蛋白水解物： 第一步：將柴魚蛋白水解上清液過超濾膜，取透過液，將透過液于60-65°C蒸發濃縮20-45 min ;第二步：利用DEAE-52纖維素陰離子交換柱進行分離，收集洗脫液，洗脫液于60-65°C 蒸發濃縮20-45 min后；第三步：利用Sephadex G-15凝膠色譜柱進一步分離，收集洗脫 液，得到柴魚蛋白水解分離液； (4) 濃縮、噴霧干燥：將柴魚蛋白水解分離液真空濃縮后，噴霧干燥，得到具有降尿酸 功效的柴魚蛋白水解物。
[0016] 上述方法中，步驟（1)中，柴魚肉糜1:5-1:8 (w/w)加水于80-KKTC下蒸煮 10-30 min〇
[0017] 上述方法中，步驟（1)中，所述柴魚肉糜蛋白質質量百分比含量為249Γ28% (w/ w)o
[0018] 上述方法中，步驟（2)中，所用蛋白酶為木瓜蛋白酶，酶活力8. OXlO5 U/g，酶解時 間為 6. 0-12. 0 h。
[0019] 上述方法中，步驟（3)中，第一步分離所用超濾膜的膜通量為0-10 kDa;第二 步DEAE-52纖維素陰離子交換柱分離時以0-0. 3 mo 1/L的NaCl溶液為洗脫劑；第三步 S印hadex G-15凝膠色譜柱分離時以超純水為洗脫劑。
[0020] 上述方法中，步驟（4)中，所述具有降尿酸功效的柴魚蛋白水解物的肽段一級氨基 酸序列中主要含四種氨基酸：組氨酸為41. 84% (w/w)、精氨酸為10. 67% (w/w)、賴氨酸為 8. 45% (w/w)及蘇氨酸為8. 53% (w/w)，該四種氨基酸質量含量總和約占酶解物總氨基酸含 量的70% (w/w);經MALDI-T0F-MS質譜確定其主要肽功效組分的分子量均小于700 Da。
[0021] 與現有技術相比，本發明的優勢在于： (1)本發明利用酶法限制性水解與膜分離、色譜分離方法結合，制備的柴魚蛋白水解物 具有功效顯著、純度高、魚腥味淡等優點。
[0022] (2)本發明所得酶解物具有特殊的肽鏈氨基酸組成比例及獨特的分子量分布。具 體而言，該酶解物肽段一級氨基酸序列中主要含四種氨基酸：組氨酸（41. 84%，w/w)、精氨 酸（10. 67%，w/w)、賴氨酸（8. 45%，w/w)及蘇氨酸（8. 53%，w/w)，該四種氨基酸質量含量總和 約占酶解物總氨基酸含量的70% (w/w)。經MALDI-T0F-MS質譜確定其主要肽功效組分的分 子量均小于700 Da。
[0023] (3)經體外黃嘌呤氧化酶抑制實驗以及大鼠動物實驗證明，本發明抑制尿酸生成 作用顯著，黃嘌呤氧化酶活性抑制率達到50%以上，并且能明顯降低大鼠血清尿酸值以及 肌酐水平，具有顯著的降尿酸功效以及保護腎臟功能。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024] 圖1實施例對黃嘌呤氧化酶抑制作用效果。
[0025] 圖2為實施例對高尿酸血癥大鼠血清尿酸的影響。
[0026] 圖3為實施例對高尿酸血癥大鼠血清肌酐的影響。
[0027] 圖4為實施例3MALDI-T0F-MS -級質譜圖。
【具體實施方式】
[0028] 下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細描述，但本發明的實施方式不限于 此。
[0029] 實施例1 (1)原料熱處理：新鮮柴魚，去頭、內臟、尾以及脊骨后，獲取純肌肉組織，于絞肉機絞 碎至糜狀，取柴魚肉糜100 g，按比例l:5(w/w)加水于80°C下蒸煮10 min，后冷卻室溫。
[0030] (2) 限制性酶解：將蒸煮后的柴魚肉糜調節pH值至6. 5,按柴魚肉糜蛋白質量 (柴魚蛋白質含量26%，w/w)加入木瓜蛋白酶(酶活力8. OX IO5 U/g，加酶量為占柴魚蛋白 質量0. 5%)，于50°C水浴振蕩反應6. 0 h。反應結束后將水解液置于沸水中保溫10 min滅 酶，離心分離，取上清液，得柴魚蛋白水解上清液。
[0031] (3) "膜分離-陰離子交換層析-凝膠過濾層析"三步法分離柴魚蛋白水解物： 第一步：將柴魚蛋白水解上清液過膜通量為10 kDa的超濾膜，取透過液，將透過液于60°C 蒸發濃縮20 min;第二步：利用DEAE-52纖維素陰離子交換柱進行分離，以0.3 mol/L的 NaCl溶液為洗脫劑，收集洗脫液，洗脫液于60°C蒸發濃縮20 min后；第三步：利用S印hadex G-15凝膠色譜柱進一步分離，以超純水為洗脫劑，收集洗脫液，得到柴魚蛋白水解分離液。
[0032] (4)濃縮、噴霧干燥：將柴魚蛋白水解分離液真空濃縮后，噴霧干燥，得到具有降 尿酸功效的柴魚蛋白水解物1。
[0033] 實施例2 (1)原料熱處理：新鮮柴魚，去頭、內臟、尾以及脊骨后，獲取純肌肉組織，于絞肉機絞 碎至糜狀，取柴魚肉糜100 g，按比例1:8 (w/w)加水于KKTC下蒸煮30 min，后冷卻室溫。
[0034] (2) 限制性酶解：將蒸煮后的柴魚肉糜調節pH值至8. 5,按柴魚肉糜蛋白質量 (柴魚蛋白質含量為24%，w/w)加入木瓜蛋白酶(酶活力8. OX IO5 U/g，加酶量為占柴魚蛋白 質量2. 0%)，于50-55°C水浴振蕩反應12. 0 h。反應結束后將水解液置于沸水中保溫15 min 滅酶，離心分離，取上清液，得柴魚蛋白水解上清液。
[0035] (3) "膜分離-陰離子交換層析-凝膠過濾層析"三步法分離柴魚蛋白水解物：第 一步：將柴魚蛋白水解上清液過膜通量為5 kDa的超濾膜，取透過液，將透過液于63°C蒸發 濃縮30 min ;第二步：利用DEAE-52纖維素陰離子交換柱進行分離，以0. 2 mol/L的NaCl溶 液為洗脫劑，收集洗脫液，洗脫液于63°C蒸發濃縮30 min后；第三步：利用S印hadex G-15 凝膠色譜柱進一步分離，以超純水為洗脫劑，收集洗脫液，得到柴魚蛋白水解分離液。
[0036] (4)濃縮、噴霧干燥：將柴魚蛋白水解分離液真空濃縮后，噴霧干燥，得到具有降 尿酸功效的柴魚蛋白水解物2。
[0037] 實施例3 (1)原料熱處理：新鮮柴魚，去頭、內臟、尾以及脊骨后，獲取純肌肉組織，于絞肉機絞 碎至糜狀，取柴魚肉糜100 g，按比例1:6 (w/w)加水于90°C下蒸煮15 min,后冷卻室溫。
[0038] (2) 限制性酶解：將蒸煮后的柴魚肉糜調節pH值至6.8,按柴魚肉糜蛋白質量 (柴魚蛋白質含量為28%，w/w)加入木瓜蛋白酶(酶活力8. OX IO5 U/g，加酶量為占柴魚蛋白 質量1.0%),于50°C水浴振蕩反應8.0 h。反應結束后將水解液置于沸水中保溫20 min滅 酶，離心分離，取上清液，得柴魚蛋白水解上清液。
[0039] (3) "膜分離-陰離子交換層析-凝膠過濾層析"三步法分離柴魚蛋白水解物：第 一步：將柴魚蛋白水解上清液過膜通量為3 kDa的超濾膜，取透過液，將透過液于65°C蒸發 濃縮35 min ;第二步：利用DEAE-52纖維素陰離子交換柱進行分離，以0. I mol/L的NaCl溶 液為洗脫劑，收集洗脫液，洗脫液于65°C蒸發濃縮35 min后；第三步：利用S印hadex G-15 凝膠色譜柱進一步分離，以超純水為洗脫劑，收集洗脫液，得到柴魚蛋白水解分離液。
[0040] (4)濃縮、噴霧干燥：將柴魚蛋白水解分離液真空濃縮后，噴霧干燥，得到具有降 尿酸功效的柴魚蛋白水解物3。
[0041] 以下通過實驗來證明實施例的降尿酸功效。
[0042] 一、體外黃嘌呤氧化酶抑制活性實驗。通過黃嘌呤氧化酶抑制活性實驗說明柴魚 蛋白水解物抑制尿酸生成作用。
[0043] 實驗方法：配制0. I mol/1 pH 7. 5磷酸鹽緩沖液（PBS);配制0. 43 μ mol/mL的黃 嘌呤溶液；配制〇. 4U/mL黃嘌呤氧化酶溶液。將待測樣品稀釋或者配制成10 mg/mL，向96 孔酶標板中，每孔加入50 μ L待測樣品以及50 μ L黃嘌呤氧化酶溶液，以10 μ g/mL的別 嘌呤醇為陽性對照。371：保溫15 1^11，加入200 1^黃嘌呤溶液，在29211111波長下每308 讀數一次，共讀數80次反應40 min。得出吸光值后，計算樣品抑制率。
[0044] 實驗結果：黃嘌呤氧化酶是促進黃嘌呤轉化成為尿酸的關鍵酶，抑制黃嘌呤氧化 酶的活性可以抑制尿酸生成，降低血清尿酸含量。如果樣品對黃嘌呤氧化酶活性有抑制作 用，則說明樣品具有抑制尿酸生成的功效。
[0045] 三種柴魚蛋白水解物均表現出良好的黃嘌呤氧化酶抑制活性，雖然與藥物別嘌呤 醇相比，有效劑量不在一個數量級上，但是柴魚蛋白水解物是從食源性蛋白獲得，具有安全 無毒、無副作用等優點，且對黃嘌呤氧化酶抑制活性良好，可用于保健食品的生產。其中柴 魚蛋白水解物3表現出最優的抑制率，柴魚蛋白水解物3與其它兩個水解物相比，主要差別 體現在其水解時間長，并通過通量為3000 Da超濾膜，分子量相比其它實施例小，說明水解 程度高，分子量小的柴魚蛋白水解物具有更優的抑制尿酸生成活性（見圖1)。
[0046] 二、動物試驗。本發明實施例降尿酸功效動物實驗方法如下： (1)實驗材料 動物：SPF級SD大鼠108只，雄性，體重200±20(g)，廣州中醫藥大學實驗動物中心提 供(許可證號：SCXK (粵）2013-0020)。試劑：別嘌醇片(廣東彼迪藥業有限公司，批準文號： 國藥準字H44021368);氧嗪酸鉀（山東中科泰斗化學有限公司，批號：Batch No. 120901); 羧甲基纖維素鈉(上海賽璐珞廠，產品標準號：GB2760);尿酸、尿素氮（BUN)檢測試劑盒(南 京建成生物工程研究所，生產批號=20140306)。
[0047] (2)實驗方法 動物分組與造模：1〇8只大鼠隨機分為正常對照組（12只）和造模組（96只)，造模組大 鼠胃灌胃氧嗪酸鉀一周（每天一次)，利用3%戊巴比妥鈉（30 mg ^kg4)腹腔注射麻醉，眼 眶后靜脈叢采血（〇. 5 ml)，以4°C、3000rpm、離心15min，取上層血清測定尿酸含量；正常對 照組大鼠灌胃給予等容積的溶媒。將尿酸含量高于110 ymol 的大鼠確定為造模成 功。將造模成功的大鼠按尿酸含量隨機分為模型對照組(等容積溶媒)、柴魚蛋白水解物1 (150mg · kg_〇、柴魚蛋白水解物2 (150mg · kg_〇、柴魚蛋白水解物（150mg · kg_〇和別嘌醇 組（25mg · kf1)，每組大鼠12只，灌胃給藥(給藥容積10ml/kg)，模型大鼠給予等容積的蒸 餾水。上述樣品處理7d、14d時，于末次給藥50min，3%戊巴比妥鈉（30mg · kg_〇腹腔注射 麻醉后，眼眶后靜脈叢取血（0. 5ml)，測定血清尿酸含量；樣品處理第21d時，3%戊巴比妥鈉 麻醉后腹主動脈取血5ml，除測定血清尿酸含量外，同時測定血清肌酐含量。
[0048] 血清尿酸測定：采用鎢酸法并嚴格按照試劑盒說明進行操作和測定。
[0049] 血清肌酐測定：采用苦味酸法測定血清肌酐含量，具體操作嚴格按試劑盒說明進 行測定。
[0050] 統計學處理：所有數據均以（土s )表示，采用spssie. 0統計軟件處理。
[0051] 實驗結果：氧嗪酸鉀是一種尿酸酶抑制劑，可抑制尿酸分解，提高大鼠體內的尿酸 水平，誘導大鼠造成高尿酸血癥。從圖2得知，模型組大鼠的血清尿酸水平約為正常組的3 倍，證實造模成功。由大鼠血清尿酸測定結果得知，服食柴魚蛋白水解物1、柴魚蛋白水解 物2以及柴魚蛋白水解物3大鼠的血清尿酸值在第7以及21天對比于模型組大鼠以及給 藥前大鼠的血清尿酸值具有明顯下降，盡管效果不如藥物別嘌呤醇，但柴魚蛋白水解物確 實起到了降低血清尿酸的作用。其中柴魚蛋白水解物3效果最佳，且給藥21天里沒有出現 明顯的反彈，能有效控制大鼠血清尿酸水平。
[0052] 由圖3可知，柴魚蛋白水解物均有一定降低血清肌酐的效果，但沒有明顯的差異。 血清肌酐值是反應腎功能的指標之一，該值升高意味著腎功能的損害。本發明實驗結果說 明柴魚蛋白水解物具有一定保護腎臟的作用。
[0053] 三、結構鑒定。
[0054] 對降尿酸功效最優的實施例3采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜 (MALDI-T0F-MS)測定其分子量，并結合氨基酸分析推測其結構。結果如圖4以及表1所示。
[0055] 由圖4可以看出柴魚蛋白水解物3在分子量為378. 83處有很高的吸收峰，說明柴 魚蛋白水解物3主要含有分子量為378. 83的物質。
[0056] 氨基酸分析結果表明，實施例3中酶解物肽段一級氨基酸序列中主要含四種氨基 酸：組氨酸（41. 84%，w/w)、精氨酸（10. 67%，w/w)、賴氨酸（8. 45%，w/w)及蘇氨酸（8. 53%，w/ w)，該四種氨基酸質量含量總和約占酶解物總氨基酸含量的70% (w/w)。經MALDI-T0F-MS 質譜確定其主要肽功效組分的分子量均小于700 Da。
[0057] 表1各氨基酸在柴魚蛋白水解物3中含量
【權利要求】
1. 一種具有降尿酸功效的柴魚蛋白水解物制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 原料熱處理：新鮮柴魚，去頭、內臟、尾以及脊骨后，獲取純肌肉組織，于絞肉機絞碎 至糜狀，得到柴魚肉糜，加水蒸煮，后冷卻室溫，得到蒸煮后的柴魚肉糜； (2) 限制性酶解：將蒸煮后的柴魚肉糜調節pH值至6. 5-8. 5,按柴魚肉糜蛋白質量 0. 5%-2. 0%加入蛋白酶，于50-55°C水浴振蕩反應，反應結束后將水解液置于沸水中保溫 10-20 min滅酶，離心分離，取上清液，得柴魚蛋白水解上清液； (3) 采用膜分離-陰離子交換層析-凝膠過濾層析，三步法分離柴魚蛋白水解物：第一 步：將柴魚蛋白水解上清液過超濾膜，取透過液，將透過液于60-65°C蒸發濃縮20-45 min ; 第二步：利用DEAE-52纖維素陰離子交換柱進行分離，收集洗脫液，洗脫液于60-65°C蒸發 濃縮20-45 min后；第三步：利用Sephadex G-15凝膠色譜柱進一步分離，收集洗脫液，得 到柴魚蛋白水解分離液； (4) 濃縮、噴霧干燥：將柴魚蛋白水解分離液真空濃縮后，噴霧干燥，得到具有降尿酸功 效的柴魚蛋白水解物。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1)中，柴魚肉糜1:5-1:8 (w/w)加 水于 80-KKTC 下蒸煮 10-30 min。
3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（1)中，所述柴魚肉糜蛋白質質量百分 比含量為24%?28%。
4. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（2)中，所用蛋白酶為木瓜蛋白酶，酶 活力8.0父105。/^，酶解時間為6.0-12.0 11。
5. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（3)中，第一步分離所用超濾膜的膜通 量為0-10 kDa;第二步DEAE-52纖維素陰離子交換柱分離時以0-0. 3 mol/L的NaCl溶液 為洗脫劑；第三步Sephadex G-15凝膠色譜柱分離時以超純水為洗脫劑。
6. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（4)中，所述具有降尿酸功效的柴魚蛋 白水解物的肽段一級氨基酸序列中主要含四種氨基酸：組氨酸為41. 84% (w/w)、精氨酸為 10.67% (w/w)、賴氨酸為8.45% (w/w)及蘇氨酸為8.53% (w/w)，該四種氨基酸質量含量總 和約占酶解物總氨基酸含量的70% (w/w);經MALDI-TOF-MS質譜確定其主要肽功效組分的 分子量均小于700 Da。
【文檔編號】A61P19/06GK104337836SQ201410520344
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2014年9月30日 優先權日:2014年9月30日
【發明者】任嬌艷, 盧韻君, 賴婷, 劉鵬, 林澤華, 趙謀明 申請人:華南理工大學