具有免疫增強作用的多磷腈分子及其在制備疫苗組合物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于免疫佐劑【技術領域】，公開了一種免疫佐劑，其為多磷腈高分子聚合物，該高分子聚合物的側鏈為對丙酸鈉苯氧基，分子量為70-100萬單位之間。本發明還公開了制備該免疫佐劑的方法，含有該免疫佐劑的疫苗組合物及其制備方法，以及該免疫佐劑在制備疫苗組合物中的應用。本發明通過對多磷腈高分子聚合物的側鏈以及分子量進行選擇和篩選，不僅有效調節了多磷腈高分子聚合物的水解速率，還有效提高了多磷腈高分子聚合物作為免疫佐劑的免疫刺激活性。此外，本發明還以四氫呋喃代替二甘醇二甲醚作為溶劑，進行多聚[二(對丙酸鈉苯氧基)]磷腈的合成，具有材料廉價易得、合成工藝簡單易行、產業化程度高、且成本較低等優勢。
【專利說明】具有免疫增強作用的多磷腈分子及其在制備疫苗組合物中 的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及免疫佐劑【技術領域】，具體涉及具有免疫增強作用的多磷腈分子及其在 制備疫苗組合物中的應用。
【背景技術】
[0002] 口蹄疫（FMD)是由口蹄疫病毒（FMDV)引起的偶蹄動物急性、熱性、高度接觸性傳 染病，是危害畜牧業最嚴重的傳染病之一，被國際獸醫局（OIE)和聯合國糧農組織（FAO)在 國際動物衛生法典中列為18種A類傳染病之首，近年又被列為重大跨國動物疫病的全球消 滅計劃及生物武器安全公約組織重點檢查對象。目前針對口蹄疫的防治還是以免疫預防為 主，雖然各種新型疫苗的研制為口蹄疫的預防帶來新的契機。但是由于各種新型疫苗在免 疫保護效力上的不足，導致其還不能完全取代傳統滅活疫苗。在國際上，南美的一些國家已 通過口蹄疫滅活疫苗接種免疫獲得了"無口蹄疫國家地位"。在我國的口蹄疫防控中，其滅 活疫苗仍是主流免疫疫苗，其市場份額依然很大，在我國及周邊國家和地區的口蹄疫控制 中發揮了重要作用。
[0003] 在口蹄疫滅活疫苗研發之初，一般都是使用水佐劑來配伍口蹄疫滅活抗原，但在 1997年英國動物衛生研究所的Pirbright實驗室用兩種新的油佐劑Mnotnadie ISA25和 206制備口蹄疫苗免疫豬和牛羊。后續的研究發現，油佐劑相比于水佐劑配伍滅活抗原所制 備的疫苗，在豬和牛羊上都能產生更強的抗體反應，致使后來的滅活疫苗都采用油佐劑配 制。但是油佐劑的使用卻大大地提高了疫苗的成本，而且其副作用較大，通常會造成注射部 位的紅腫、疼痛、發燒甚至過敏死亡等問題。因此，如果能夠找到一種與油佐劑效力相當的 水佐劑來配制滅活抗原疫苗，那么這種安全高效疫苗的市場前景將會更為廣闊。
[0004] 多磷腈成分是一種新型的潛在具有免疫佐劑效應的高分子化合物，目前的研究已 證明其具有免疫增強作用，其與呼吸系統疫病病原抗原相配伍免疫小鼠后，證明多磷腈不 僅提高代表天然免疫的IgA抗體的水平，而且在獲得性免疫方面不僅能夠增強代表Thl型 的IFN γ水平，還能增強代表Th2型的IL-4的分泌水平。
[0005] 多磷腈分子是由一個有機主鏈和擁有多個不同有機取代基的側鏈組成的高分子 聚合物，使其兼有有機和無機聚合物的性能，引入不同的側鏈，可以制備具有不同功能的聚 磷腈高分子。因此它可以是親水的或是親油的，可以是導體、半導體或是絕緣體，還可以是 耐腐蝕材料、耐溶劑和化學藥品，也可以是生物活性物質。
[0006] 最初作為免疫佐劑成分的多磷腈分子，是一種被稱為PCPP的多磷腈高聚物，但是 后來發現另外一種側鏈取代基與PCPP不同的被稱為PCEP的多磷腈成分，在細胞免疫和體 液方面具有更強的免疫增強優勢。這說明不同取代基的多磷腈分子的免疫活性也各不相 同。由此可知，雖然多磷腈成分可以作為一種較好的免疫佐劑，但是并不是所有的多磷腈都 具備可以成為良好的生物佐劑成分的可能。此外，即便是取代基相同的多磷腈分子，由于 其合成工藝的不同，導致其分子量大小有所差異，而這些不同分子量的多磷腈分子免疫活 性也各不相同。并且在實際應用中還要考慮到分子量過大的多磷腈成分其溶解度也相應變 小。因此，如何建立一種成熟的合成工藝，篩選免疫增強作用強并且溶解度高的多磷腈分 子，是目前多磷腈作為免疫佐劑應用中亟待解決的問題。
【發明內容】
[0007] 針對現有技術中存在的上述缺陷，本發明一方面提供了一種免疫佐劑，其為多磷 腈高分子聚合物，該多磷腈高分子聚合物的側鏈為對丙酸鈉苯氧基，分子量為70-100萬單 位之間。
[0008] 在本發明優選的實施方案中，該免疫佐劑是通過以下步驟制備而來的：
[0009] 1、聚二氯磷腈的合成
[0010] 將氯化銨和氯化磷混合以氨基磺酸、二水合硫酸鈣以及三氯苯作為溶劑，合成聚 二氯磷腈；
[0011] 2、對丙酸甲酯苯丙酸鈉的合成
[0012] 將對羥基苯丙酸甲酯與氫化鈉混合以四氫呋喃作為溶劑，合成對丙酸甲酯苯丙酸 鈉；
[0013] 3、聚[二（對丙酸甲酯苯氧基）]磷腈的合成
[0014] 將前兩步合成的聚二氯磷腈和對丙酸甲酯苯丙酸鈉混合以四氫呋喃作為溶劑，合 成聚[二（對丙酸甲酯苯氧基）]磷腈；
[0015] 4、聚[二（對丙酸甲苯氧基）]磷腈的合成
[0016] 在合成的聚[二（對丙酸甲酯苯氧基）]磷腈中滴加入氫氧化鉀溶液，合成聚[二 (對丙酸甲苯氧基）]磷腈；
[0017] 5、聚[二（對丙酸苯氧基）]磷腈的合成
[0018] 將沉淀用去離子水溶解,然后再用無水乙醇從去離子水中沉淀,再次將沉淀用去 離子水溶解，加入鹽酸溶液滴定調節最終溶液pH = 6. 3,最后用飽和鹽水沉淀，獲得聚[二 (對丙酸苯氧基）]磷腈；
[0019] 6、聚[二（對丙酸鈉苯氧基）]磷腈的合成
[0020] 將得到的聚[二（對丙酸苯氧基）]磷腈溶于去離子水中，用氫氧化鈉調節溶液pH =7. 4,用無水乙醇沉淀，獲得聚[二（對丙酸鈉苯氧基）]磷腈；
[0021] 7、對多聚[二（對丙酸鈉苯氧基）]磷腈的分子量進行篩選，獲得分子量為70-100 萬單位之間的多聚[二（對丙酸鈉苯氧基）]磷腈。
[0022] 本發明另一方面提供了一種制備免疫佐劑的方法，該免疫佐劑為多磷腈高分子聚 合物，該多磷腈高分子聚合物的側鏈為對丙酸鈉苯氧基，分子量為70-100萬單位之間，該 制備方法包括如下步驟：
[0023] 1、聚二氯磷腈的合成
[0024] 將氯化銨和氯化磷混合以氨基磺酸、二水合硫酸鈣以及三氯苯作為溶劑，合成聚 二氯磷腈；
[0025] 2、對丙酸甲酯苯丙酸鈉的合成
[0026] 將對羥基苯丙酸甲酯與氫化鈉混合以四氫呋喃作為溶劑，合成對丙酸甲酯苯丙酸 鈉；
[0027] 3、聚[二（對丙酸甲酯苯氧基）]磷腈的合成
[0028] 將前兩步合成的聚二氯磷腈和對丙酸甲酯苯丙酸鈉混合以四氫呋喃作為溶劑，合 成聚[二（對丙酸甲酯苯氧基）]磷腈；
[0029] 4、聚[二（對丙酸甲苯氧基）]磷腈的合成
[0030] 在合成的聚[二（對丙酸甲酯苯氧基）]磷腈中滴加入氫氧化鉀溶液，合成聚[二 (對丙酸甲苯氧基）]磷腈；
[0031] 5、聚[二（對丙酸苯氧基）]磷腈的合成
[0032] 將沉淀用去離子水溶解，然后再用無水乙醇從去離子水中沉淀，再次將沉淀用去 離子水溶解，加入鹽酸溶液滴定調節最終溶液pH = 6. 3,最后用飽和鹽水沉淀，獲得聚[二 (對丙酸苯氧基）]磷腈；
[0033] 6、聚[二（對丙酸鈉苯氧基）]磷腈的合成
[0034] 將得到的聚[二（對丙酸苯氧基）]磷腈溶于去離子水中，用氫氧化鈉調節溶液pH =7. 4,用無水乙醇沉淀，獲得聚[二（對丙酸鈉苯氧基）]磷腈；
[0035] 7、對多聚[二（對丙酸鈉苯氧基）]磷腈的分子量進行篩選，獲得分子量為70-100 萬單位之間的多聚[二（對丙酸鈉苯氧基）]磷腈。
[0036] 本發明另一方面提供了一種疫苗組合物，其含有有效量的本發明所述的免疫佐劑 以及免疫原。
[0037] 在本發明優選的實施方案中，該疫苗組合物中免疫原為口蹄疫滅活抗原，更加優 選為亞洲I型口蹄疫滅活疫苗抗原。
[0038] 本發明另一方面提供了制備本發明所述的疫苗組合物的方法，其包括混合本發明 所述的免疫佐劑與免疫原的步驟。
[0039] 本發明再一方面還提供了本發明所述的免疫佐劑在制備疫苗組合物中的應用。
[0040] 在本發明的上述應用中，免疫原優選為口蹄疫滅活抗原，更加優選為亞洲I型口 蹄疫滅活疫苗抗原。
[0041] 與現有技術相比，本發明具有如下的特點和優勢：
[0042] 首先，本發明不僅首次提出了并非所有的多磷腈高分子聚合物都具有良好的免疫 佐劑效應，還進一步通過對多磷腈高分子聚合物的側鏈以及分子量進行選擇和篩選，不僅 有效調節了多磷腈高分子聚合物的水解速率，同時還有效提高了多磷腈高分子聚合物作為 免疫佐劑的免疫刺激活性，具有如下現有技術中其它多磷腈高分子聚合物作為免疫佐劑所 無法比擬的特性。
[0043] 1、多磷腈高分子聚合物多聚[二（對丙酸鈉苯氧基）]磷腈的磷氮碳結構骨架能 夠被生物完全降解，以保證免疫佐劑和抗原的同步釋放。
[0044] 2、多磷腈高分子聚合物多聚[二（對丙酸鈉苯氧基）]磷腈的骨架結構具有很好 的柔順性，與抗原蛋白結合能夠促進對蛋白抗原的有效呈遞。
[0045] 3、多磷腈高分子聚合物多聚[二（對丙酸鈉苯氧基）]磷腈與抗原蛋白之間通過 相對溫和的非共價鍵絡合，能夠最大限度地保證抗原的完整性，也不影響其分子的天然結 構。
[0046] 4、多磷腈高分子聚合物多聚[二（對丙酸鈉苯氧基）]磷腈的分子量較大，離子密 度高，裝載抗原量大（抗原載體），與抗原蛋白形成的絡合物穩定性強。
[0047] 其次，在多磷腈高分子聚合物的合成方面，傳統的多聚[二（對丙酸鈉苯氧基）] 磷腈合成方法中，均使用二甘醇二甲醚作溶劑，存在后處理過程損失大、產率較低、且價格 昂貴等缺點。本發明以價格低廉的四氫呋喃代替二甘醇二甲醚作為溶劑，進行多聚[二（對 丙酸鈉苯氧基）]磷腈的合成，具有材料廉價易得、合成工藝簡單易行、產業化程度高、且成 本較低等優勢，為多聚[二（對丙酸鈉苯氧基）]磷腈的工業化生產打下了良好的基礎。 [0048] 最后，本發明不僅確定了多磷腈高分子聚合物多聚[二（對丙酸鈉苯氧基）]磷腈 的最佳分子量范圍，還通過相應的實驗確定了其最佳劑量為IOOug/只。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0049] 圖1為多磷腈佐劑成分合成工藝流程圖。
[0050] 圖2為不同分子量多磷腈疫苗的免疫效果評價圖。
[0051 ] 1(相對分子量<30萬） 2 (相對分子量30萬-70萬）
[0052] 3 (相對分子量> 70萬） 一抗原對照
[0053] +空白對照
[0054] 圖3為不同劑量多磷腈疫苗的免疫效果評價圖。
[0055] -*-： 500ug IOOug 50ug -?#-； 20ug 抗原對照 空白對照
【具體實施方式】
[0056] 以下結合附圖對本發明作進一步詳細說明，但不作為對本發明的限定。
[0057] 實施例1 :多磷腈佐劑成分的合成工藝
[0058] 1、聚二氯磷腈的合成
[0059] 將氯化銨和氯化磷混合以氨基磺酸、二水合硫酸鈣以及三氯苯作為溶劑，在 190-195?條件下反應4h。合成聚二氯磷腈。
[0060] 2、對丙酸甲酯苯丙酸鈉的合成
[0061] 將對羥基苯丙酸甲酯與氫化鈉混合以四氫呋喃作為溶劑室溫反應4h，合成對丙酸 甲酯苯丙酸鈉。
[0062] 3、聚[二（對丙酸甲酯苯氧基）]磷腈的合成
[0063] 將前兩步合成的聚二氯磷腈和對丙酸甲酯苯丙酸鈉混合以四氫呋喃作為溶劑 65°C反應58h，生成聚[二（對丙酸甲酯苯氧基）]磷腈。
[0064] 4、聚[二（對丙酸甲苯氧基）]磷腈的合成
[0065] 在生成的聚[二（對丙酸甲酯苯氧基）]磷腈中滴加入氫氧化鉀溶液，60°C下反應 2h，生成聚[二（對丙酸甲苯氧基）]磷腈。
[0066] 5、聚[二（對丙酸苯氧基）]磷腈的合成
[0067] 傾倒出液體，將沉淀用去離子水溶解，然后再用無水乙醇從去離子水中沉淀，再次 將沉淀用去離子水溶解，加入鹽酸溶液滴定調節最終溶液pH = 6. 3,最后用飽和鹽水沉淀， 得到聚[二（對丙酸苯氧基）]磷腈。
[0068] 6、多磷腈分子：聚[二（對丙酸鈉苯氧基）]磷腈的合成
[0069] 將得到的聚[二（對丙酸苯氧基）]磷腈溶于去離子水中，用氫氧化鈉調節溶液pH =7. 4,用無水乙醇沉淀，最終得到多磷腈分子：聚[二（對丙酸鈉苯氧基）]磷腈。
[0070] 實施例2 :根據分子量大小對多磷腈分段
[0071] 對多磷腈分子聚[二（對丙酸鈉苯氧基）]磷腈進行分子量分段，即采用不同截留 分子量的透析袋，對聚磷腈分子聚[二（對丙酸鈉苯氧基）]磷腈進行透析，以精確控制聚 磷腈的分子量。
[0072] 分別使用30萬和70萬的透析袋對聚磷腈分子聚[二（對丙酸鈉苯氧基）]磷腈 進行透析，得到分子量分別為30萬以下、30萬-70萬以及70萬以上的聚磷腈分子。
[0073] 實施例3 :不同分子量的多磷腈分子與亞洲I型口蹄疫抗原配伍免疫小鼠的免疫 佐劑效應評價實驗
[0074] 將制備好的不同分子量的多磷腈分子（劑量為IOOug/只）與亞洲I型口蹄疫滅 活抗原按照規定劑量配伍（亞洲I型口蹄疫滅活抗原由中農威特公司生產，劑量為標準劑 量）制備試驗疫苗。
[0075] 將本發明配伍的不同分子量的多磷腈疫苗、單獨抗原疫苗（抗原對照，即亞洲I型 口蹄疫滅活抗原）、PBS (空白對照）分別免疫接種試驗鼠，用液相阻斷ELISA試劑盒（由中 國農業科學院蘭州獸醫研究所生產）檢測各組抗體滴度，評價不同分子量多磷腈的免疫佐 劑作用。
[0076] 抗體滴度結果表明，相對分子量大于70萬的多磷腈疫苗，其抗體滴度明顯高于其 他分子量大小的多磷腈疫苗，具體實驗結果參見圖2。同時考慮到實際應用中，分子量過大 的多磷腈成分其溶解度相應變小，因此本發明最終選定分子量為70-100萬單位之間的多 磷腈分子聚[二（對丙酸鈉苯氧基）]磷腈作為免疫佐劑。
[0077] 實施例4 :不同劑量的多磷腈分子與亞洲I型口蹄疫抗原配伍免疫小鼠的免疫佐 劑效應評價實驗
[0078] 將分子量為70-100萬單位之間的多磷腈分子聚[二（對丙酸鈉苯氧基）]磷腈按 照不同劑量（20ug/只、50ug/只、IOOug/只和500ug/只）分別與亞洲I型口蹄疫滅活抗原 配伍（亞洲I型口蹄疫滅活抗原由中農威特公司生產，劑量為標準劑量）制備試驗疫苗。
[0079] 將上述不同劑量的多磷腈疫苗、單獨抗原疫苗（抗原對照，即亞洲I型口蹄疫滅活 抗原）、PBS (空白對照）分別免疫接種試驗鼠，用液相阻斷ELISA試劑盒（由中國農業科學 院蘭州獸醫研究所生產）檢測各組抗體滴度，評價不同劑量的多磷腈的免疫佐劑作用，并 觀察毒副作用。
[0080] 抗體滴度結果表明，劑量分別為IOOug/只和500ug/只的多磷腈疫苗，其抗體滴度 明顯高于其他劑量的多磷腈疫苗，具體結果參見圖3。同時，考慮到實際生產過程中的成本 問題，本發明最終選定劑量為IOOug/只的多磷腈分子聚[二（對丙酸鈉苯氧基）]磷腈作 為免疫佐劑的最佳劑量。
[0081] 由本發明的【具體實施方式】部分可知，本發明中最優選的作為免疫佐劑的多磷腈成 分，其側鏈為對丙酸鈉苯氧基，且其最佳分子量范圍為70-100萬單位之間。
【權利要求】
1. 一種免疫佐劑，其為多磷腈高分子聚合物，所述多磷腈高分子聚合物的側鏈為對丙 酸鈉苯氧基，分子量為70-100萬單位之間。
2. 根據權利要求1所述的免疫佐劑，其通過以下步驟制備而來： (1) 聚二氯磷腈的合成 將氯化銨和氯化磷混合以氨基磺酸、二水合硫酸鈣以及三氯苯作為溶劑，合成聚二氯 磷腈； (2) 對丙酸甲酯苯丙酸鈉的合成 將對羥基苯丙酸甲酯與氫化鈉混合以四氫呋喃作為溶劑，合成對丙酸甲酯苯丙酸鈉； (3) 聚[二（對丙酸甲酯苯氧基）]磷腈的合成 將前兩步合成的聚二氯磷腈和對丙酸甲酯苯丙酸鈉混合以四氫呋喃作為溶劑，合成聚 [二（對丙酸甲酯苯氧基）]磷腈； (4) 聚[二（對丙酸甲苯氧基）]磷腈的合成 在合成的聚[二（對丙酸甲酯苯氧基）]磷腈中滴加入氫氧化鉀溶液，合成聚[二（對 丙酸甲苯氧基）]磷腈； (5) 聚[二（對丙酸苯氧基）]磷腈的合成 將沉淀用去離子水溶解，然后再用無水乙醇從去離子水中沉淀，再次將沉淀用去離子 水溶解，加入鹽酸溶液滴定調節最終溶液pH = 6. 3,最后用飽和鹽水沉淀，獲得聚[二（對 丙酸苯氧基）]磷腈； (6) 聚[二（對丙酸鈉苯氧基）]磷腈的合成 將得到的聚[二（對丙酸苯氧基）]磷腈溶于去離子水中，用氫氧化鈉調節溶液PH = 7. 4,用無水乙醇沉淀，獲得聚[二（對丙酸鈉苯氧基）]磷腈； (7) 對多聚[二（對丙酸鈉苯氧基）]磷腈的分子量進行篩選，獲得分子量為70-100萬 單位之間的多聚[二（對丙酸鈉苯氧基）]磷腈。
3. -種制備免疫佐劑的方法，所述免疫佐劑為多磷腈高分子聚合物，所述多磷腈高分 子聚合物的側鏈為對丙酸鈉苯氧基，分子量為70-100萬單位之間，所述制備方法包括如下 步驟： (1) 聚二氯磷腈的合成 將氯化銨和氯化磷混合以氨基磺酸、二水合硫酸鈣以及三氯苯作為溶劑，合成聚二氯 磷腈； (2) 對丙酸甲酯苯丙酸鈉的合成 將對羥基苯丙酸甲酯與氫化鈉混合以四氫呋喃作為溶劑，合成對丙酸甲酯苯丙酸鈉； (3) 聚[二（對丙酸甲酯苯氧基）]磷腈的合成 將前兩步合成的聚二氯磷腈和對丙酸甲酯苯丙酸鈉混合以四氫呋喃作為溶劑，合成聚 [二（對丙酸甲酯苯氧基）]磷腈； (4) 聚[二（對丙酸甲苯氧基）]磷腈的合成 在合成的聚[二（對丙酸甲酯苯氧基）]磷腈中滴加入氫氧化鉀溶液，合成聚[二（對 丙酸甲苯氧基）]磷腈； (5) 聚[二（對丙酸苯氧基）]磷腈的合成 將沉淀用去離子水溶解，然后再用無水乙醇從去離子水中沉淀，再次將沉淀用去離子 水溶解，加入鹽酸溶液滴定調節最終溶液pH = 6. 3,最后用飽和鹽水沉淀，獲得聚[二（對 丙酸苯氧基）]磷腈； (6) 聚[二（對丙酸鈉苯氧基）]磷腈的合成 將得到的聚[二（對丙酸苯氧基）]磷腈溶于去離子水中，用氫氧化鈉調節溶液PH = 7. 4,用無水乙醇沉淀，獲得聚[二（對丙酸鈉苯氧基）]磷腈； (7) 對多聚[二（對丙酸鈉苯氧基）]磷腈的分子量進行篩選，獲得分子量為70-100萬 單位之間的多聚[二（對丙酸鈉苯氧基）]磷腈。
4. 一種疫苗組合物，其含有有效量的權利要求1或2所述的免疫佐劑以及免疫原。
5. 根據權利要求4所述的疫苗組合物，其中免疫原為口蹄疫滅活抗原，優選為亞洲I型 口蹄疫滅活疫苗抗原。
6. -種制備權利要求4或5中任一項的疫苗組合物的方法，包括混合權利要求1或2 所述的免疫佐劑與免疫原的步驟。
7. 權利要求1或2所述的免疫佐劑在制備疫苗組合物中的應用。
8. 根據權利要求7所述的應用，其中免疫原為口蹄疫滅活抗原，優選為亞洲I型口蹄疫 滅活疫苗抗原。
【文檔編號】A61K39/135GK104324374SQ201410509654
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年9月28日 優先權日:2014年9月28日
【發明者】景志忠, 曾爽, 陳國華, 房永祥, 宋林華, 賈懷杰, 何小兵 申請人:中國農業科學院蘭州獸醫研究所