一種快速愈合犬創傷組織的犬干細胞分泌因子修復液的制作方法
【專利摘要】一種快速愈合犬創傷組織的犬干細胞分泌因子修復液，涉及生物【技術領域】，尤其是犬干細胞技術。本發明修復液中包含犬類干細胞活性成份提取液，該提取液是從犬骨髓基質干細胞中提取得到的，包括多種活性生長因子、膠原蛋白、活性多肽、微量元素、透明質酸等物質，可以快速促進細胞和組織生長、活化和再生，在治療犬難愈性創面方面能發揮網絡式的調節作用。本發明修復液可以快速有效地促進皮膚和手術創面的愈合，以及修復皮膚和眼部的潰瘍，具有良好的科研和臨床價值。
【專利說明】一種快速愈合犬創傷組織的犬干細胞分泌因子修復液
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】的犬干細胞技術，尤其是快速促進犬創傷組織愈合的 犬干細胞分泌因子修復液的制備方法及其臨床應用。
【背景技術】
[0002] 犬骨髓基質干細胞（Bone marrow stem cells, BMSCs)是骨髓中具有自我更新和 多向分化潛能的細胞群。具有來源廣泛、采集方便、體外易于擴增、低免疫原性等特性，是目 前再生醫學、組織工程、基因治療等方面比較理想的種子源細胞。犬BMSCs在特定的環境中 可以定向分化，從而達到修復細胞和組織損傷的作用。有研究表明，除了干細胞本身的分化 作用外，其旁分泌作用在修復過程中發揮了更大的作用。犬BMSCs能夠分泌大量的細胞因 子，其分泌因子在功能上主要可分為免疫調節、抗細胞凋亡、血管發生、支持干/祖細胞的 增殖與分化、化學趨化、抗瘢痕六大類。它們通過自分泌或旁分泌的方式，改善機體局部微 環境，促進內源性干細胞向傷口部位的遷移和分化，挽救瀕臨凋亡的細胞，從而達到修復創 傷組織的目的。犬干細胞分泌因子包括干細胞因子（SCF)、成纖維細胞生長因子（FGF)、內 皮細胞生長因子（VEGF)、表皮細胞生長因子（EGF)、肝細胞生長因子（HGF)、胰島素樣生長 因子（IGF)、粒細胞集落刺激因子（G-CSF)、白介素（IL)、抗炎因子、轉化生長因子、I、II、 III、IV型膠原蛋白、各種溶菌酶等20余種活性物質。
[0003] 犬活潑好動，由于運動所導致的外傷屢見不鮮，同時手術創面、皮膚和眼部潰瘍的 修復也是臨床中常見的問題，創傷和創面的愈合是一個錯綜復雜的生物學過程，該過程通 過細胞因子的高度協調介導細胞與細胞間或細胞與基質間的相互作用來修復受損組織。細 胞因子的協調不良或功能障礙均可導致創面愈合"失控"，在臨床上表現為創面難愈。
[0004] 目前犬創傷和潰瘍的治療原則首先是局部治療服從全身治療，其次創面的外科處 理是局部治療的前提和基礎，如局部清創和抗感染等，最后采用某些措施和方法來促進難 愈性創面愈合。傳統的方法主要包括傳統醫藥類、新型敷料類、基因工程藥物（生長因子） 類以及組織工程類。存在的主要問題是抗感染差、血管化延遲、制備技術復雜、生產周期長， 價格昂貴以及組織工程皮膚存在生理缺陷等。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種犬創傷、手術創面和皮膚潰瘍能夠快速愈合的修復 液，該修復液可以快速有效地促進皮膚和手術創面的愈合，以及修復皮膚和眼部的潰瘍。
[0006] 本發明快速愈合犬創傷組織的修復液，其特征在于該修復液中包含犬類干細胞活 性成份提取液，所述提取液是從犬骨髓基質干細胞中提取得到的。
[0007] 所述的修復液中還含有0. 5%-1%提取液質量的透明質酸。
[0008] 所述的修復液中還含有0. 3%-0. 5%提取液質量的防腐劑丙酸鈣。
[0009] 所述的犬類干細胞活性成份提取液包括干細胞因子（SCF)、成纖維細胞生長因子 (FGF)、內皮細胞生長因子（VEGF)、表皮細胞生長因子（EGF)、肝細胞生長因子（HGF)、胰島 素樣生長因子（IGF)、粒細胞集落刺激因子（G-CSF)、白介素（IL)、抗炎因子、轉化生長因 子、I、II、III、IV型膠原蛋白和溶菌酶。
[0010] 所述的犬類干細胞活性成份提取液是通過以下的步驟制備而得的： 步驟1 :從健康幼齡犬骨髓中體外分離培養大量的BMSCs ; 步驟2 :收集BMSCs培養上清液，超聲破碎BMSCs并離心取上清； 步驟3 :微孔徑濾膜過濾，濃縮。
[0011] 本發明利用犬干細胞增殖過程中能分泌諸如抗炎、血管發生、胞外基質重塑、纖維 組織形成和表皮細胞再生等愈合相關因子，可大規模生產、活性高、使用安全相比于單一因 子更適合體內環境，且不涉及干細胞使用中存在的爭議，因此具有良好的科研和臨床價值。
【具體實施方式】
[0012] 實施例1 :快速愈合犬創傷組織的修復液，該修復液中包含犬類干細胞活性成份 提取液，透明質酸以及防腐劑丙酸鈣。
[0013] 所述的修復液具體提取步驟如下： 步驟1，犬BMSCs的體外分離：常規麻醉幼犬，髂后上棘備皮、消毒、鋪巾，用含Iml肝素 鈉的骨髓穿刺針分2-3點共抽取骨髓約10ml，混勻防凝，迅速轉入50ml消毒離心管，用等 量DMEM/F12稀釋混勻；取10支底部加入5ml淋巴細胞分離液的離心管，加入的淋巴細胞 分離液濃度為1. 077 g/ml，上層分別貼壁流入等量骨髓稀釋液，封口，控制溫度4°C，離心機 轉速為2000 r/min，離心20 min去除上層脂肪細胞，吸取中間交界處白膜層細胞，然后用 4°C的10 ml DMEM/F12混勻洗滌界層細胞，再次離心20 min，轉速2000 r/min，去除上清 液，重復上述洗滌界層細胞步驟1次；用含15% FBSUOO U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的 DMEM/F12培養基5ml重懸沉積物。
[0014] 步驟2,臺盼藍染色測定細胞活力：取0.4g臺盼藍，加入100 ml的0.1 M PBS 溶液中，配制成0. 4%臺盼藍溶液，0. IM PBS溶液配方：NaCl 8g，KCl 0. 2g，Na2HPO4. 12H20 3. 488g，KH2PO4 0.2g，加三蒸去離子水至1000 ml，調整PH值為7. 4,0.22 Mm濾膜過濾除 菌。取0. 4%臺盼藍溶液0. 5 ml、DMEM/F12培養基0. 3 ml和細胞懸液0. 2 ml充分混勻， 用血球計數板計數活細胞（未著色細胞）和死細胞（著色細胞），共計數500個細胞，計算 細胞活力，細胞活力（％) =(細胞總數一著色細胞數）/細胞總數X 100%。如臺盼藍染 色細胞活力彡95%，則可進行下一步操作，否則重復步驟1 (重復步驟1、犬BMSCs的體外分 離)。
[0015] 步驟3,大量培養BMSCs :首次培養時用含15% FBSUOO U/ml青霉素、100 U/ml 鏈霉素（雙抗）的DMEM/F12培養液調整細胞密度，以I X IO6Ail細胞密度5 ml的培養液 接種于25 cm2的一次性細胞培養瓶內，置于溫度37°C，5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱中培 養，培養3天后首次換液，去除紅細胞、懸浮生長的骨髓造血干細胞及其它未貼壁的骨髓干 細胞，以后每隔3天換液1次，即換新鮮的含有15% FBSUOO U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉 素的DMEM/F12培養液，待細胞生長至70%?80%融合時，用0. 25%胰蛋白酶消化2?3min， 用含10%的FBS及雙抗的DMEM/F12終止消化，反復吹打瓶壁細胞，制成單細胞懸液按1:3 傳代，倒置顯微鏡逐日觀察，直至貼壁細胞彼此融合鋪滿瓶底時，重復上述操作，反復傳代 擴增，收集。
[0016] 步驟4,干細胞活性成份的提取：犬BMSCs用胰蛋白酶消化計數IO7個，PBS洗滌3 次，溶于30 ml滅菌生理鹽水中；超聲破碎細胞，條件：超聲10 s，間隔時間5 s，超聲強度4， 超聲次數5次，使細胞內的蛋白及營養成分充分溶出；控制溫度4°C，轉速為10000 r/min， 離心10 min，取上清液，去掉細胞碎片；用孔徑為0.22 Mm的濾膜過濾，使其無菌，測定蛋白 濃度，調整濃度為200 Pg/ml，4°C保存，標記為A液。待細胞長到最旺盛時，測培養基pH值 為5. 5-6. 0,取上層培養液30 ml ;因上層培養液含有大量酚紅和其他成分，用50 k超濾膜 過濾，使其體積濃縮至5 ml左右取出，加入5 ml滅菌生理鹽水，定容至10 ml;用孔徑為 0.22 Mm的濾膜過濾，使其無菌，測定蛋白濃度，定濃度為200 Pg/ml，4°C保存，標記為B液。 將上述30 ml的A液和10 ml的B液混合，得到干細胞活性提取液。
[0017] 步驟5,干細胞分泌因子修復液的制備：以步驟4所得干細胞活性成份提取液40 ml為原料，按質量比為0. 5%-1%的比例加入透明質酸，達到皮膚保濕和快速愈合傷口的目 的；同時按質量比〇. 3%-0. 5%的比例加入防腐劑丙酸鈣，以延長保存時間和增加治愈效果。
[0018] 將本發明制備的修復液進行應用，對創傷組織進行治療，并與其他的常規治療方 法做相關的對比試驗。
[0019] 對比試驗如下： 不同品種犬9只，年齡為3-5歲，隨機分為三組，每組3只，第一組為治療組，使用本發 明的犬干細胞分泌因子修復液；第二組為常規治療組，使用碘酒；第三組為對照組，使用 生理鹽水。
[0020] 將9只犬用3%戊巴比妥鈉靜脈麻醉，背部皮膚去毛，消毒，用手術刀片制備直徑為 I cm的圓形創面，深度為達皮膚全層，但不觸及肌肉，每天分3次分別在創面上涂抹不同的 藥物，進行相應的治療。在給予治療的第3,6,9,12,15,18, 21天測量創面大小，進行愈合 指標觀察：在創后各時間點用消毒的透明薄膜貼于創口上，沿創緣劃線，記錄后用圖像分析 儀測定創面面積；動物致傷后立即測的面積為傷口原始面積。殘留面積百分率=殘留面積 /原始面積X 1〇〇%。
[0021] 創面殘留面積/原始面積的百分比代表創面愈合速度，治療結果顯示，犬干細胞 分泌因子修復液可加快創面的愈合速度：在第6天與對照組比較差異顯著，對照組創面在 傷后18-21天基本愈合，而犬干細胞分泌因子修復液治療組創面在傷后12-15天已全部愈 合，提前了 6-7天，并且愈合速度明顯優于碘酒治療組，結果列于表1中。
[0022] 結果表明，利用本發明的犬干細胞分泌因子修復液可明顯抑制創面的炎癥反應， 快速愈合犬創傷部位的皮膚組織，減少瘢痕組織的形成，具有良好的臨床應用前景。
[0023] 表1 傷后不同時間創面殘留面積百分比（％， x± s)
【權利要求】
1. 一種快速愈合犬創傷組織的犬干細胞分泌因子修復液，其特征在于該修復液中包含 犬類干細胞活性成份提取液，所述提取液是從犬骨髓基質干細胞中提取得到的。
2. 如權利要求1所述的一種快速愈合犬創傷組織的犬干細胞分泌因子修復液，其特征 在于所述的修復液中還含有〇. 5%-1%提取液質量的透明質酸。
3. 如權利要求1所述的一種快速愈合犬創傷組織的犬干細胞分泌因子修復液，其特征 在于所述的修復液中還含有〇. 3%-0. 5%提取液質量的防腐劑丙酸鈣。
4. 如權利要求1所述的一種快速愈合犬創傷組織的犬干細胞分泌因子修復液，其特 征在于所述的犬類干細胞活性成份提取液包括干細胞因子（SCF)、成纖維細胞生長因子 (FGF)、內皮細胞生長因子（VEGF)、表皮細胞生長因子（EGF)、肝細胞生長因子（HGF)、胰島 素樣生長因子（IGF)、粒細胞集落刺激因子（G-CSF)、白介素（IL)、抗炎因子、轉化生長因 子、I、II、III、IV型膠原蛋白和溶菌酶。
5. 如權利要求1所述的一種快速愈合犬創傷組織的犬干細胞分泌因子修復液，其特征 在于所述的犬類干細胞活性成份提取液是通過以下的步驟制備而得的： 步驟1 :從健康幼齡犬骨髓中體外分離培養大量的BMSCs ; 步驟2 :收集BMSCs培養上清液，超聲破碎BMSCs并離心取上清； 步驟3 :微孔徑濾膜過濾，濃縮。
【文檔編號】A61P17/02GK104324053SQ201410506749
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年9月28日 優先權日:2014年9月28日
【發明者】嚴玉霖, 汪登如, 曹景鋒, 陳玲, 汪逸 申請人:嚴玉霖, 汪登如