一種納米藥物載體及其制備方法和應用的制作方法

一種納米藥物載體及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種納米藥物載體及其制備方法和應用。本發明的納米藥物載體，是一種介孔二氧化硅復合粒子，包括內核、中層和外層，其中，內核是納米介孔二氧化硅粒子；中層設置在內核的表面，包括至少一層自組裝層，自組裝層包含相互結合的刀豆球蛋白A和糖元；外層為轉鐵蛋白層，設置在中層的表面。本發明采用層層自組裝制膜技術，在納米介孔二氧化硅粒子表面形成至少一層刀豆球蛋白A-糖元自組裝層，最后形成以轉鐵蛋白為外層的超分子層狀膜。本發明的納米藥物載體，生物相容性好，制備工藝簡單，且具有腫瘤靶向和刺激響應雙重特性。
【專利說明】一種納米藥物載體及其制備方法和應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物【技術領域】，涉及藥物遞送系統，具體涉及一種由功能蛋白膜調控 的腫瘤靶向及刺激響應型納米藥物載體及其制備方法和應用。

【背景技術】
[0002] 開發一種藥物能選擇性地破壞患病細胞而不影響健康細胞，這一想法最初由諾貝 爾獎獲得者、化學療法創始人Paul Ehrlich在20世紀初提出，Ehrlich稱其為"魔法子 彈"（magic bullets)。在過去的幾十年里，研究人員在開發這種具有特定祀向性的理想 藥物上取得了一定的進展。在藥物制劑領域，人們探索并實踐著注射、口服、經皮以及眼 部、肺部黏膜給藥等各種靶向方法，靶向途徑不斷拓寬。此外，新型靶向給藥載體脂質體 (Doxil·? )等祀向制劑已上市使患者受益。納米藥物載體的出現以及其在細胞和分子生 物學上的深入研究為人們開拓了新的視野。基于納米尺度的藥物載體能夠通過EPR效應 (Enhanced Permeability and Retention)從腫瘤血管中滲出，裝載的藥物相對于自由的 藥物分子而言利用度更高。但要要實現智能的藥物輸送，必須賦予納米載體其靶向性和響 應性，從而避免藥物在傳輸過程是發生降解或提早泄露，使藥物特異性地被輸送至腫瘤部 位，并對其特殊生理環境做出響應，對藥物釋放的時間和地點進行調控。
[0003] 但隨著研究的逐漸深入，鑒于體內生理環境的復雜性，人們越來越認識到靶向納 米給藥系統仍面臨著諸多挑戰。以往藥物載體的設計往往較為簡單，難以應對體內復雜的 生理環境。只針對體內某一環節，機制較為簡單。目前人們已經開始設計更為復雜的自適 應型給藥系統或智能型給藥系統，即通過對給藥載體進行多重復合設計，使其能夠隨時間 或體內環境的變化而發生自我調節，或者對外部刺激產生響應，從而順利通過體內各種生 理屏障，實現更好的靶向效果。
[0004] 正常組織的pH值為7. 4,腫瘤細胞由于增殖異常，長期處于缺氧狀態，無氧酵解產 生乳酸，其組織周邊pH值在6. 8左右。除此之外，腫瘤細胞中的內涵體和溶酶體中酸性更 強，用電子及化學探針等方法測量腫瘤細胞中早期內涵體的PH值在6. 0左右，有的甚至低 于5. 4,而晚期內涵體的pH值一般在5. 0左右，有的甚至低于4. 0。腫瘤中的這些酸性環境 可以作為信號用于觸發快速藥物釋放及細胞器靶向。
[0005] 納米介孔二氧化硅由于其生物相容性好、粒徑孔徑均在納米尺度可調、高比表面 積、良好的溶酶體逃逸能力等特點成為理想的胞內藥物運輸載體。已有大量研究通過在納 米介孔二氧化硅（MSN)表面引入功能化"納米蓋"，賦予其更好的藥物控釋和靶向性功能。 以納米介孔二氧化硅為藥物載體根據其控釋機理可分為兩大類，一是通過化學改性對MSN 介孔孔道進行羧基、氨基等化學修飾，通過該基團與藥物進行共軛連接，利用連接單元對酸 性或還原性的微環境的敏感性，從而控制藥物釋放；二是先將藥物裝載至介孔孔道中，利用 量子點、納米四氧化三鐵、聚電解質、牛血清白蛋白等顆粒或大分子對介孔孔道進行封堵， 通過調控該封端劑的開關來調控藥物的釋放或保留。其中后者由于對藥物分子的化學結 構、溶解性、電負性等均沒有要求，單純通過物理負載將藥物儲存在介孔孔道中，能夠更好 地保留藥物的化學結構和活性，因此具有廣闊的應用前景。
[0006] 但是，目前大部分納米介孔二氧化硅載藥體系仍存在不足，限制了其臨床應用： 1).響應條件不符合腫瘤細胞內生理環境；2).藥物在到達腫瘤部位之前的正常生理環境 下提前逸散；3).制備過程繁瑣，通常需要對納米蓋進行復雜的化學修飾，進而將靶向分子 絡合至MSN載體表面。
[0007] 因此，需要構思一種制備更為簡便、靶向作用強、響應釋放條件符合腫瘤細胞實際 生理環境的新型納米介孔二氧化硅藥物控釋載體。


【發明內容】

[0008] 本發明的目的是針對現有的腫瘤靶向給藥系統存在的不足，提供一種新型功能蛋 白膜調控的腫瘤靶向及刺激響應型納米藥物載體。
[0009] 本發明的第一方面，提供一種介孔二氧化硅復合粒子，包括內核、中層和外層，其 中，
[0010] 所述內核是納米介孔二氧化硅粒子；
[0011] 所述中層設置在所述內核的表面，包括至少一層自組裝層，所述自組裝層包含相 互結合的刀豆球蛋白A和糖元；
[0012] 所述外層為轉鐵蛋白層，設置在所述中層的表面。
[0013] 在另一優選例中，所述中層和所述外層之間還具有一層刀豆球蛋白A層。
[0014] 在另一優選例中，所述轉鐵蛋白為人體來源的鐵飽和轉鐵蛋白。
[0015] 在另一優選例中，所述中層具有1-15層自組裝層，較佳地為2-10層自組裝層。
[0016] 在另一優選例中，所述介孔二氧化硅復合粒子在pH 4.0-6. 0下所述中層和所述 外層發生解離。
[0017] 在另一優選例中，所述介孔二氧化硅復合粒子在溫度高于200°C至550°C時所述 中層和所述外層發生熱解，失重率達到20-30%。
[0018] 在另一優選例中，所述介孔二氧化硅復合粒子具有以下一個或多個特征：
[0019] (1)所述納米介孔二氧化硅粒子的孔徑為L 5-30nm ;
[0020] (2)所述納米介孔二氧化硅粒子的粒徑為50-300nm ;
[0021] (3)所述介孔二氧化硅復合粒子的平均粒徑為60-350nm ;
[0022] (4)所述介孔二氧化硅復合粒子在溫度高于200°C至550°C時所述中層和所述外 層發生熱解，失重率達到20-30%。
[0023] 在另一優選例中，所述介孔二氧化硅復合粒子，相對于納米介孔二氧化硅粒子，在 約1532CHT 1和約1468CHT1處具有典型的酰胺基團振動峰。
[0024] 本發明的第二方面，提供第一方面所述的介孔二氧化硅復合粒子的制備方法，包 括以下步驟：
[0025] (a)提供納米介孔二氧化硅粒子作為內核；
[0026] (b)所述納米介孔二氧化硅粒子帶正電后分散到含有刀豆球蛋白A溶液后，再分 散到含有糖元的溶液，在納米介孔二氧化硅粒子表面形成一層自組裝層，任選地重復上述 步驟形成數層自組裝層；
[0027] (C)將步驟（b)獲得的粒子分散到含有刀豆球蛋白A溶液后，再分散到轉鐵蛋白溶 液中獲得所述的介孔二氧化硅復合粒子。
[0028] 本發明中采用的納米介孔二氧化硅粒子，可以采用本領域已知的各種方法制備， 沒有特別的限制。在另一優選例中，采用以下步驟制備納米介孔二氧化硅粒子：配制十六烷 基三甲基溴化銨水溶液。加入適量氨水，調節溶液pH至12以上；通過分液漏斗將正硅酸乙 酯逐滴加入，反應完畢后，抽濾分離得到白色固體產物；將干燥后的該固體產物經高溫煅燒 去除模板劑，即可獲得納米介孔二氧化硅粒子。
[0029] 在另一優選例中，將介孔納米二氧化硅分散在聚乙烯亞胺溶液（0. l_5mg/mL，較佳 地為0. 5-4. 5mg/mL)中使所述納米介孔二氧化娃粒子帶正電。
[0030] 在另一優選例中，所述制備方法包括以下一個或多個特征：
[0031] (1)所述步驟（b)或所述步驟（c)的含有刀豆球蛋白A溶液中所述刀豆蛋白A的 濃度（或含量）為〇· 2-5mg/mL，較佳地為0· 5-3mg/mL，更佳地為0· 8-2. 5mg/mL ;
[0032] (2)所述步驟（b)的含有糖元的溶液中所述糖元的濃度（或含量）為0· 2_5mg/mL, 較佳地為0. 5-3mg/mL ;
[0033] (3)所述步驟（b)中所述納米介孔二氧化硅粒子的質量與所述含有刀豆球蛋白A 溶液的體積比為l_60mg:lml，較佳地為10-50mg:lml，更佳地為30_45mg:lml ;
[0034] (4)所述步驟（b)中所述納米介孔二氧化硅粒子的質量與所述含有糖元的溶液的 體積比為l-60mg:lml，較佳地為10_50mg:lml，更佳地為30_45mg:lml ;
[0035] (5)所述轉鐵蛋白溶液中轉鐵蛋白的濃度（或含量）為0· 2-5mg/mL，較佳地為 0. 5-3mg/mL ；
[0036] (6)所述步驟（b)獲得的粒子的質量與所述含有刀豆球蛋白A溶液的體積比為 l_60mg:lml，較佳地為 10_50mg:lml，更佳地為 30_45mg:lml ;
[0037] (7)所述步驟（b)獲得的粒子的質量與所述轉鐵蛋白溶液的體積比為 l_60mg:lml，較佳地為 10_50mg:lml，更佳地為 30_45mg:lml。
[0038] 本發明的第三方面，提供第一方面所述的介孔二氧化硅復合粒子的用途，用于制 備藥物載體。
[0039] 在另一優選例中,所述藥物載體是刺激響應型藥物載體。
[0040] 在另一優選例中，所述藥物載體是腫瘤靶向型藥物載體
[0041] 在另一優選例中，所述藥物載體是腫瘤靶向及刺激響應型藥物載體。
[0042] 在另一優選例中，所述藥物載體在模擬胞外的pH條件下（pH 6.8-7.4)能夠抑制 藥物泄漏，在模擬胞內內涵體的pH條件下（pH 4.5-6. 0)中層及外層發生解離，從而誘導藥 物釋放。
[0043] 本發明的第四方面，提供一種復合物，包含：
[0044] 第一方面所述的介孔二氧化硅復合粒子；和
[0045] 抗癌藥物。
[0046] 在另一優選例中，所述抗癌藥物選自：阿霉素、5-氟尿嘧啶、白消安、博萊霉素、長 春花堿、多西紫杉醇、環磷酰胺、吉西他濱、甲胺嘌呤、卡鉬、卡培他濱、洛莫司汀、羥基脲、順 鉬、絲裂霉素、依托泊苷、紫杉醇、吉非替尼。
[0047] 在另一優選例中，將介孔二氧化硅復合粒子分散在抗癌藥物溶液中獲得所述復合 物。
[0048] 本發明的第五方面，提供一種藥物組合物，包含第四方面所述的復合物和藥學上 可接受的載體。
[0049] 本發明的第六方面，提供第四方面所述的復合物或第五方面所述的藥物組合物的 用途，用于制備預防和/或治療腫瘤的藥物。
[0050] 在另一優選例中，所述腫瘤包括（但不限于）：肝癌、肺癌（包括縱隔癌）、口腔上 皮癌、鼻咽癌、甲狀腺癌、食道癌、淋巴癌、胸腔癌、消化道癌、胰腺癌、腸癌、乳腺癌、卵巢癌、 子宮癌、腎癌、膽囊癌、膽管癌、中樞神經癌、睪丸癌、膀胱癌、前列腺癌、皮膚癌、黑色素瘤、 肉癌、腦癌、血癌（白血病）、宮頸癌、膠質瘤、胃癌、或腹水瘤。
[0051] 本發明的介孔二氧化硅復合粒子，是由功能蛋白膜調控的腫瘤靶向及刺激響應型 納米藥物載體。本發明以納米介孔二氧化硅作為藥物載體，利用刀豆球蛋白Con A和糖單 元間的生物可逆鍵和為驅動力，以刀豆球蛋白A和糖元、轉鐵蛋白為組裝單元，以層層自組 裝技術在納米介孔二氧化硅表面構筑了多層蛋白膜結構，進行藥物負載后，獲得具有腫瘤 靶向性和刺激響應性的納米給藥系統。
[0052] 本發明具有制備方法簡單溫和、生物相容性好、響應條件生理化以及腫瘤靶向效 率高等特點，適用于多種腫瘤的靶向治療。
[0053] 應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0054] 圖1是透射電鏡圖。
[0055] 圖2是紅外光譜圖。
[0056] 圖3是熱重表征圖。
[0057] 圖4是不同pH條件下抗腫瘤藥物阿霉素的釋放曲線。
[0058] 圖5是轉鐵蛋白和刀豆球蛋白的生物特異性結合力表征圖。
[0059] 圖6是共聚焦顯微鏡表征人肝癌細胞H印G2對腫瘤靶向及刺激響應型納米藥物載 體的特異性攝取結果圖。
[0060] 圖7是流式細胞分選儀表征腫瘤靶向及刺激響應型納米藥物載體對人肝癌細胞 !fepG2和人正常肝細胞L02的選擇性結果圖。
[0061] 圖8是共聚焦顯微鏡表征腫瘤靶向及刺激響應型功能蛋白膜在人肝癌細胞!fepG2 和人正常肝細胞L02中的解離行為結果圖。
[0062] 圖9是共聚焦顯微鏡表征腫瘤靶向及刺激響應型納米給藥系統在人肝癌細胞 HepG2和人正常肝細胞L02中的藥物釋放行為結果圖。
[0063] 圖10是MTT法測定腫瘤靶向及刺激響應型功能蛋白膜對抗腫瘤藥物阿霉素對人 肝癌細胞H印G2、人乳腺癌細胞MDA-MB-231、人胃癌細胞MGC-803、人正常肝細胞L02、小鼠 成肌細胞C2C12的毒性調控作用結果圖。

【具體實施方式】
[0064] 本申請的發明人經過廣泛而深入地研究，首次研發出一種新型的藥物載體，是一 種介孔二氧化硅復合粒子，核芯是納米介孔二氧化硅粒子，納米介孔二氧化硅粒子表面具 有一層或多層包含相互結合的刀豆球蛋白A和糖元的自組裝層，最外的自組裝層的表面具 有轉鐵蛋白層。本發明的藥物載體，利用外層轉鐵蛋白對腫瘤細胞的靶向功能，內層刀豆球 蛋白A-糖元對腫瘤細胞內低pH環境的響應解離功能，可以實現載體對抗腫瘤藥物的靶向 傳輸、定點釋放。在此基礎上，完成了本發明。
[0065] 術語
[0066] 刀豆球蛋白A是從巨刀豆中提取得到的一種球蛋白型植物凝集素，其在pH6. 8以 上為四聚體，每個亞基對應一個糖結合位點。在酸性條件下，蛋白發生解聚形成二聚體，糖 結合位點由四個變成兩個。糖元是由葡萄糖結合而成的支鏈多糖，能夠與刀豆球蛋白A發 生具有PH依賴特性的特異性結合。
[0067] 轉鐵蛋白受體（transferrin receptor, TfR,又稱⑶71)是細胞膜表面的一種II 型跨膜糖蛋白，TfR在正常細胞中受體表達水平較低，而快速增殖的腫瘤細胞由于對鐵的需 求增加使得其受體表達約為正常細胞的100倍。
[0068] 轉鐵蛋白（transferrin，Tf)是含有兩條N-寡糖鏈的單鏈糖蛋白，其分子量為 7. 7kDa，糖含量約6%，也能夠與刀豆球蛋白A發生基于糖殘基的生物特異性結合。
[0069] 根據國際純粹與應用化學協會（IUPAC)的定義，孔徑小于2納米的稱為微孔；孔 徑大于50納米的稱為大孔；孔徑在2到50納米之間的稱為介孔（或稱中孔）。介孔材料 是一種孔徑介于微孔與大孔之間的具有巨大比表面積和三維孔道結構的新型材料。介孔 二氧化硅具有包裹量大、比表面積大（> 900m2/g)、內外表面易修飾、孔道有序、孔徑可調 (2-10nm)、無毒、生物相容性好及熱力學穩定性高等特點，是理想的納米容器儲存和釋放載 體。
[0070] 介孔二氧化硅復合粒子
[0071] 本發明以刀豆球蛋白A、糖元和轉鐵蛋白為組裝單元，以該生物特異性結合力為驅 動力，利用層層自組裝制膜技術，在納米介孔二氧化硅粒子表面形成一層或多層刀豆球蛋 白A-糖元自組裝層，并形成以轉鐵蛋白為外層的超分子層狀膜，利用外層轉鐵蛋白對腫瘤 細胞的靶向功能，刀豆球蛋白A-糖元對腫瘤細胞內環境的響應解離功能，實現載體對抗腫 瘤藥物的祀向傳輸、定點釋放。
[0072] 具體地，本發明的介孔二氧化硅復合粒子包括內核、中層和外層，其中，
[0073] 所述內核是納米介孔二氧化硅粒子；
[0074] 所述中層設置在所述內核的表面，包括至少一層自組裝層，所述自組裝層包含相 互結合的刀豆球蛋白A和糖元；
[0075] 所述外層為轉鐵蛋白層，設置在所述中層的表面。
[0076] 本發明的目的通過以下技術方案實現：
[0077] 介孔納米二氧化硅的制備：將一定質量的十六烷基三甲基溴化銨溶解于適量去離 子水中，加熱攪拌至完全溶解。加入適量氨水，調節溶液PH至12以上。通過分液漏斗將正 硅酸乙酯逐滴加入，反應完畢后，抽濾分離得到白色固體產物。將干燥后的該固體產物經高 溫煅燒去除模板劑，即可獲得介孔納米二氧化硅。
[0078] 層層自組裝蛋白多層膜的構建：稱取一定質量的介孔納米二氧化硅，分散在帶正 電的聚電解質溶液中，使介孔納米二氧化硅帶上正電荷。離心洗滌后依次將納米粒子分散 在刀豆球蛋白A溶液和糖元溶液中，重復該步驟，直至在介孔納米二氧化硅表面獲得指定 層數的層層自組裝蛋白多層膜。最后將該納米粒子依次重分散在刀豆球蛋白A溶液和轉鐵 蛋白溶液中，對該蛋白膜進行靶向修飾。本發明還以FITC標記的刀豆球蛋白A取代刀豆球 蛋白A，制得具有熒光標記的層層自組裝蛋白多層膜，以研究該多層膜的響應性。
[0079] 腫瘤靶向及刺激響應型給藥系統的構建：將上述包覆了蛋白多層膜的納米粒子 (即介孔二氧化硅復合粒子）分散在較高濃度的阿霉素溶液中，振蕩過夜。離心并洗去未被 負載的游離藥物分子，冷凍干燥后即得腫瘤靶向及刺激響應型給藥系統。
[0080] 藥物組合物
[0081] 本發明還提供了一種藥物組合物，它包含安全有效量范圍內的活性成分，以及藥 學上可接受的載體。
[0082] 本發明所述的"活性成分"是指本發明所述的復合物，包含本發明的介孔二氧化硅 復合粒子；和抗癌藥物。
[0083] 本發明所述的"活性成分"和藥物組合物可以用于制備預防和/或治療腫瘤的藥 物。
[0084] "安全有效量"指的是：活性成分的量足以明顯改善病情，而不至于產生嚴重的副 作用。通常，藥物組合物含有l-2000mg活性成分/劑，更佳地，含有10-200mg活性成分/ 齊LU較佳地，所述的" 一劑"為一個藥片。
[0085] "藥學上可接受的載體"指的是：一種或多種相容性固體或液體填料或凝膠物質， 它們適合于人使用，而且必須有足夠的純度和足夠低的毒性。"相容性"在此指的是組合 物中各組份能和本發明的活性成分以及它們之間相互摻和，而不明顯降低活性成分的藥 效。藥學上可以接受的載體部分例子有纖維素及其衍生物（如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維 素鈉、纖維素乙酸酯等）、明膠、滑石、固體潤滑劑（如硬脂酸、硬脂酸鎂）、硫酸鈣、植物油 (如豆油、芝麻油、花生油、橄欖油等）、多元醇（如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等）、乳化 齊U (如吐溫?)、潤濕劑（如十二烷基硫酸鈉）、著色劑、調味劑、穩定劑、抗氧化劑、防腐劑、 無熱原水等。
[0086] 本發明的活性成分或藥物組合物的施用方式沒有特別限制，代表性的施用方式包 括（但并不限于）：口服、瘤內、直腸、腸胃外（靜脈內、肌肉內或皮下）等。
[0087] 用于口服給藥的固體劑型包括膠囊劑、片劑、丸劑、散劑和顆粒劑。
[0088] 在這些固體劑型中，活性成分與至少一種常規惰性賦形劑（或載體）混合，如檸檬 酸鈉或磷酸二鈣，或與下述成分混合：(a)填料或增容劑，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、 甘露醇和硅酸；(b)粘合劑，例如，羥甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和 阿拉伯膠；（c)保濕劑，例如，甘油；（d)崩解劑，例如，瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯淀粉或木薯淀 粉、藻酸、某些復合硅酸鹽、和碳酸鈉；(e)緩溶劑，例如石蠟；（f)吸收加速劑，例如，季胺化 合物；（g)潤濕劑，例如鯨蠟醇和單硬脂酸甘油酯；(h)吸附劑，例如，高嶺土；和（i)潤滑 齊?，例如，滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉，或其混合物。膠囊劑、 片劑和丸劑中，劑型也可包含緩沖劑。
[0089] 所述的固體劑型還可采用包衣和殼材制備，如腸衣和其它本領域公知的材料。它 們可包含不透明劑，并且，這種組合物中活性成分的釋放可以延遲的方式在消化道內的某 一部分中釋放。可采用的包埋組分的實例是聚合物質和蠟類物質。
[0090] 用于口服給藥的液體劑型包括藥學上可接受的乳液、溶液、懸浮液、糖漿或酊劑。 除了活性成分外，液體劑型可包含本領域中常規采用的惰性稀釋劑，如水或其它溶劑，增溶 劑和乳化劑，例知，乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺 以及油，特別是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油或這些物質的混合物 等。除了這些惰性稀釋劑外，組合物也可包含助劑，如潤濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、矯 味劑和香料。
[0091] 除了活性成分外，懸浮液可包含懸浮劑，例如，乙氧基化異十八烷醇、聚氧乙烯山 梨醇和脫水山梨醇酯、微晶纖維素、甲醇鋁和瓊脂或這些物質的混合物等。
[0092] 用于腸胃外注射的組合物可包含生理上可接受的無菌含水或無水溶液、分散液、 懸浮液或乳液，和用于重新溶解成無菌的可注射溶液或分散液的無菌粉末。適宜的含水和 非水載體、稀釋劑、溶劑或賦形劑包括水、乙醇、多元醇及其適宜的混合物。
[0093] 本發明復合物或藥物組合物可以單獨給藥，或者與其他治療藥物（如化療藥）聯 合給藥。
[0094] 使用藥物組合物時，是將安全有效量的本發明復合物適用于需要治療的哺乳動物 (如人），其中施用時劑量為藥學上認為的有效給藥劑量，對于60kg體重的人而言，日給藥 劑量通常為1?2000mg，優選20?500mg。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀 況等因素，這些都是熟練醫師技能范圍之內的。
[0095] 本發明提到的上述特征，或實施例提到的特征可以任意組合。本案說明書所揭示 的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以被任何提供相同、 均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特 征的一般性例子。
[0096] 本發明的有益之處在于：
[0097] (1)本發明利用刀豆球蛋白與糖基間的生物特異性結合力，在介孔納米二氧化硅 表面通過層層自組裝構建刀豆球蛋白A-糖元為中層、轉鐵蛋白為外層的超分子層狀膜，獲 得具有腫瘤靶向和刺激響應雙重特性的納米藥物載體。
[0098] (2)本發明的納米藥物載體生物相容性好，制備簡單，可靶向選擇多種腫瘤細胞， 響應條件符合細胞微環境。
[0099] (3)本發明制備方法簡單，無須對藥物或載體進行修飾，利用刀豆球蛋白A的糖結 合功能制得了具有腫瘤靶向和刺激響應雙重特性的蛋白超分子膜。
[0100] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件如 Sambrook 等人，分子克隆：實驗室手冊（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數按重量計算。
[0101] 除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明方法中。文 中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0102] 以下實施例中，Con A代表刀豆球蛋白A，Gly代表糖元，Tf代表轉鐵蛋白，MSN代表 介孔納米二氧化硅，下標η代表刀豆球蛋白A-糖元自組裝多層膜的層數，上標D代表負載 了抗腫瘤藥物阿霉素，納米粒子的結構通過將組成單元按從外到內的順序依次排列表示， 例如靶向納米載藥顆粒Tf/Con A(Gly/Con A)4-MSND是指外層為轉鐵蛋白、中層為4個雙層 的刀豆球蛋白A-糖元自組裝多層膜、內核為負載有抗腫瘤藥物阿霉素的納米顆粒。
[0103] 實施例1
[0104] 腫瘤靶向及刺激響應型藥物載體（介孔二氧化硅復合粒子及復合物）的制備
[0105] 將I. 116g的十六烷基三甲基溴化銨溶解于480mL去離子水中，50°C下攪拌至完全 溶解。加入52. 8mL氨水，調節溶液pH至12以上。通過分液漏斗逐滴加入5. 6mL正硅酸乙 酯，反應完畢后，抽濾分離得到白色固體產物。將干燥后的該固體產物經高溫煅燒去除模板 齊U，即可獲得介孔納米二氧化硅MSN，其透射電鏡照片如圖1所示，粒徑約為50-100nm。
[0106] 稱取200mg介孔納米二氧化娃，分散在5mL聚乙烯亞胺溶液中（4mg/mL, 0. 5M NaCl 溶液），使介孔納米二氧化硅帶上正電荷。離心洗滌后將納米粒子分散于5mL刀豆球蛋白A 溶液中（2mg/mL，IOmM Tris-HCl緩沖液，含ImMCa2+，ImM Mn2+)，緩慢攪拌30min后離心、洗 漆。加入5mL糖元溶液（2mg/mL，Tris-HCl緩沖液），同樣緩慢攪拌30min后離心、洗漆。重 復一次上述刀豆球蛋白A和糖元的組裝步驟，即可在介孔納米二氧化硅表面構建兩個雙層 的蛋白超分子膜。最后將該納米粒子依次重分散在刀豆球蛋白A(2mg/mL，IOmM Tris-HCl 緩沖液，含lmM Ca2+, ImM Mn2+)和轉鐵蛋白溶液中（2mg/mL，IOmM Tris-HCl緩沖液，含ImM Ca2+，ImM Mn2+)，緩慢攪拌30min后離心、洗滌。
[0107] 將上述包覆了蛋白多層膜的納米粒子分散在4mg/mL阿霉素溶液中，振蕩過夜。離 心并洗去未被負載的游離藥物分子，冷凍干燥后即得腫瘤靶向及刺激響應型載藥介孔二氧 化娃復合粒子。
[0108] 實施例2
[0109] 將I. 116g的十六烷基三甲基溴化銨溶解于480mL去離子水中，50°C下攪拌至完全 溶解。加入52. 8mL氨水，調節溶液pH至12以上。通過分液漏斗逐滴加入5. 6mL正硅酸乙 酯，反應完畢后，抽濾分離得到白色固體產物。將干燥后的該固體產物經高溫煅燒去除模板 齊U，即可獲得介孔納米二氧化硅。
[0110] 稱取150mg介孔納米二氧化娃，分散在5mL聚乙烯亞胺溶液中（4mg/mL, 0. 5M NaCl 溶液），使介孔納米二氧化硅帶上正電荷。離心洗滌后將納米粒子分散于5mL刀豆球蛋白A 溶液中（I. 5mg/mL，IOmM Tris-HCl 緩沖液，含 ImM Ca2+, ImM Mn2+)，緩慢攬拌 30min 后離心、 洗漆；加入5mL糖元溶液（2. 5mg/mL, Tris-HCl緩沖液），同樣緩慢攪拌30min后離心、洗 滌。重復六次上述刀豆球蛋白A和糖元的組裝步驟，即可在介孔納米二氧化硅表面構建七 個雙層的蛋白超分子膜。該樣品記為（Gly/Con A)7-MSN，其透射電鏡照片如圖1所示，粒徑 約60-100nm。最后將該納米粒子依次重分散在刀豆球蛋白A(2. 5mg/mL，IOmM Tris-HCl緩 沖液，含ImM Ca2+，ImM Mn2+)和轉鐵蛋白溶液中（2. 5mg/mL，IOmM Tris-HCl緩沖液，含ImM Ca2+，ImM Mn2+)，緩慢攪拌35min后離心、洗滌。
[0111] 將上述包覆了蛋白多層膜的納米粒子分散在4mg/mL 5-氟尿嘧啶溶液中，振蕩過 夜。離心并洗去未被負載的游離藥物分子，冷凍干燥后即得腫瘤靶向及刺激響應型載藥介 孔二氧化硅復合粒子。
[0112] 實施例3
[0113] 將I. 116g的十六烷基三甲基溴化銨溶解于480mL去離子水中，50°C下攪拌至完全 溶解。加入52. 8mL氨水，調節溶液pH至12以上。通過分液漏斗逐滴加入5. 6mL正硅酸乙 酯，反應完畢后，抽濾分離得到白色固體產物。將干燥后的該固體產物經高溫煅燒去除模板 齊U，即可獲得介孔納米二氧化硅。
[0114] 稱取180mg介孔納米二氧化娃，分散在5mL聚乙烯亞胺溶液中（4mg/mL, 0. 5M NaCl 溶液），使介孔納米二氧化硅帶上正電荷。離心洗滌后將納米粒子分散于5mL刀豆球蛋白 A 溶液中（2mg/mL，IOmM Tris-HCl 緩沖液，含 ImMCa2+，ImM Mn2+)，緩慢攪拌 30min 后離心、 洗漆；加入5mL糖元溶液（2mg/mL，Tris-HCl緩沖液），同樣緩慢攪拌30min后離心、洗漆。 重復九次上述刀豆球蛋白A和糖元的組裝步驟，即可在介孔納米二氧化硅表面構建十個 雙層的蛋白超分子膜。最后將該納米粒子重分散在刀豆球蛋白A溶液中（2. 5mg/mL，IOmM Tris-HCl緩沖液，含ImM Ca2+，ImM Mn2+)，緩慢攪拌35min后離心、洗滌。該樣品記為Con A(Gly/Con A)1(I-MSN，其透射電鏡照片如圖1所示，粒徑約60-100nm。
[0115] 綜合分析 MSN、（Gly/Con A)4-MSN、（Gly/Con A)7-MSN 及 Con A(Gly/Con A)1(I-MSN 的透射電鏡照片（如圖I所示），可見包覆了多層膜后，納米介孔二氧化硅的介孔孔道被蛋 白膜所覆蓋，并且隨著多層膜層數的增加，納米粒子表面顆粒狀的結構愈發明顯，而從Con A (Gly/Con A) 1(I-MSN的透射電鏡照片則能夠直接觀察到粒徑與刀豆球蛋白A尺寸相符合的 顆粒狀結構，較為直接地證明了多層膜的成功組建。
[0116] 實施例4
[0117] 將I. 116g的十六烷基三甲基溴化銨溶解于480mL去離子水中，50°C下攪拌至完全 溶解。加入52. 8mL氨水，調節溶液pH至12以上。通過分液漏斗逐滴加入5. 6mL正硅酸乙 酯，反應完畢后，抽濾分離得到白色固體產物。將干燥后的該固體產物經高溫煅燒去除模板 齊U，即可獲得介孔二氧化硅MSN，其透射電鏡照片如圖1所示。
[0118] 稱取200mg介孔納米二氧化娃，分散在5mL聚乙烯亞胺溶液中（4mg/mL, 0. 5M NaCl 溶液），使介孔納米二氧化硅帶上正電荷。離心洗滌后將納米粒子分散于5mL刀豆球蛋白 A 溶液中（2mg/mL，IOmM Tris-HCl 緩沖液，含 ImM Ca2+，ImM Mn2+)，緩慢攪拌 30min 后離心、 洗漆。加入5mL糖元溶液（2mg/mL，Tris-HCl緩沖液），同樣緩慢攪拌30min后離心、洗漆。 重復三次上述刀豆球蛋白A和糖元的組裝步驟，即可在介孔納米二氧化硅表面構建四個雙 層的蛋白超分子膜，該樣品記為（Gly/Con A)4-MSN。
[0119] 為了直接研究多層膜的解離行為，將刀豆球蛋白A進行FITC熒光標記，其余操 作均同上，制得表面包覆四個雙層蛋白超分子膜的納米粒子，該樣品記為（Gly/Con Α@ fitc)4-msn。
[0120] 將（Gly/Con A) 4-MSN 分散在刀豆球蛋白 A 溶液（2mg/mL，IOmM Tris-HCl 緩沖液， 含ImM Ca2+，lmM Mn2+),緩慢攪拌30min后離心、洗漆,該樣品記為Con A(Gly/Con A)4_MSN。
[0121] 將 Con A (Gly/Con A) 4-MSN 分散到轉鐵蛋白溶液中（2mg/mL，IOmM Tris-HCl 緩 沖液，含ImM Ca2+，lmM Mn2+)，緩慢攪拌30min后離心、洗滌，該樣品記為Tf/Con A(Gly/Con a)4-msn。
[0122] 將Tf/Con A (Gly/Con A) 4-MSN分散在4mg/mL阿霉素溶液中，振蕩過夜。離心并 洗去未被負載的游離藥物分子，冷凍干燥后即得靶向納米載藥顆粒（載藥復合物），該樣品 記為 Tf/Con A (Gly/Con A)4-MSNd。
[0123] 實施例5
[0124] 稱取200mg實施例1制備的介孔納米二氧化硅，分散在5mL聚乙烯亞胺溶液中 (lmg/mL，0. 5M NaCl溶液），使介孔納米二氧化硅帶上正電荷。離心洗滌后將納米粒子分散 于5mL刀豆球蛋白A溶液中（lmg/mL，IOmM Tris-HCl緩沖液,含ImM Ca2+, ImM Mn2+),緩慢 攪拌30min后離心、洗漆。加入5mL糖元溶液（lmg/mL, Tris-HCl緩沖液），同樣緩慢攪拌 30min后離心、洗滌。重復四次上述刀豆球蛋白A和糖元的組裝步驟，即可在介孔納米二氧 化硅表面構建五個雙層的蛋白超分子膜，該樣品記為（Gly/Con A)5-MSN。
[0125] 將（Gly/Con A) 5-MSN 分散在刀豆球蛋白 A 溶液（lmg/mL, IOmM Tris-HCl 緩沖液， 含ImM Ca2+，ImM Mn2+)，緩慢攪拌40min后離心、洗滌，該樣品記為Con A (Gly/Con A) 5-MSN。
[0126] 將 Con A (Gly/Con A) 5-MSN 分散到轉鐵蛋白溶液中（lmg/mL，IOmM Tris-HCl 緩 沖液，含ImM Ca2+，lmM Mn2+)，緩慢攪拌40min后離心、洗滌，該樣品記為Tf/Con A(Gly/Con a)5-msn。
[0127] 將Tf/Con A(Gly/Con A)4-MSN分散在5mg/mL多西紫杉醇溶液中，振蕩過夜。離 心并洗去未被負載的游離藥物分子，冷凍干燥后即得載藥的復合物。
[0128] 實施例6
[0129] 以實施例4制備的各種粒子為例，進行性能表征。
[0130] MSN和（Gly/Con A)4_MSN的透射電鏡照片如圖1所示，表明通過層層自組裝這一 制膜技術，在介孔二氧化硅表面構建了膜狀結構。
[0131] MSN、（Gly/Con A)4_MSN的紅外分析譜圖如圖2所示，相對于納米介孔二氧化硅粒 子，包覆了蛋白膜后的納米材料在1532CHT 1和1468CHT1處具有典型的酰胺基團振動峰，進一 步證明了蛋白膜的成功構建。
[0132] 對MSN、（Gly/Con A)4_MSN進行熱重分析（如圖3所示）可知，在溫度高于200°C至 550°C時所述中層和所述外層發生熱解，失重率達到20-30% (蛋白膜的比重在20% -30% 左右）。
[0133] 實施例7
[0134] 藥物載體吸附和多層膜調控藥物釋放的能力
[0135] 稱取IOmg熒光標記的介孔二氧化硅復合粒子，即（Gly/Con A@FITC)4-MSN，分別分 散至ImL不同pH值的釋放介質（pH 7. 4PBS、pH 5. 5醋酸/醋酸鈉緩沖液，pH 5. 0醋酸/ 醋酸鈉緩沖液）中，樣品避光放置于37°C恒溫振蕩箱中，每隔Ih離心后取出500 μ L釋放介 質測量其熒光強度，同時補充500 μ L相同的新鮮釋放介質，以上清中熒光強度為縱坐標作 圖，研究多層膜的解離行為。
[0136] 如圖4中（A)所示，在中性條件下，多層膜能夠始終保持穩定；在pH 5.5下，多層 膜能夠發生一定程度的解離；在PH 5. 0條件下，多層膜迅速發生響應，其在前2h的解離程 度達到了前12h的一半左右。該層層自組裝多層膜具備在中性環境中保持結構穩定，弱酸 性條件下發生不同程度解離的特性。
[0137] 稱取IOmg實施例4制備的納米載藥顆粒（Gly/Con A)4-MSND，分散于ImL DMSO中， 以破壞表面蛋白超分子膜并溶解負載于介孔孔道中的藥物分子。離心，測上清中特征吸收 峰處吸光度，直至沒有藥物再被釋放出來，累積計算藥物釋放量即可得材料中的藥物含量。
[0138] 稱取IOmg的上述納米載藥顆粒（Gly/Con A)4_MSND,分別分散至ImL不同pH值的 釋放介質（pH 7. 4PBS、pH 6. 8PBS、pH 6. 0PBS、pH 5. 5醋酸/醋酸鈉緩沖液，pH 5. 0醋酸/ 醋酸鈉緩沖液，pH 4.0醋酸/醋酸鈉緩沖液）中，樣品避光放置于37°C恒溫振蕩箱中，每隔 Ih離心后取出500 μ L釋放介質測量其特征吸收峰處吸光度，同時補充500 μ L相同的新鮮 釋放介質，做累積釋放曲線。
[0139] 如圖4中（B)和（C)所示，在模擬人體正常體液的pH 7. 4環境下，12h內藥物幾乎 沒有釋放，這與多層膜在PH 7. 4條件下保持結構穩定的實驗結果一致，表明自組裝層牢固 地固定在MSN表面，從而保證該納米載藥粒子在體內循環的過程中保持穩定，避免藥物提 前逃逸產生副作用。
[0140] 該納米載藥顆粒模擬胞內弱酸性條件的釋放行為與其多層膜的解離行為基本一 致。在模擬內涵體內弱酸性環境的PH 5.5下，多層膜解離程度不高，但交聯度下降，因此 "打開"介孔孔道并誘導藥物釋放，12h后釋放率約45%;在pH 5.0下（模擬溶酶體內pH環 境），多層膜迅速發生解離，7h后釋放率即達到50 %，12h釋放率約70%。
[0141] 綜上，在蛋白膜的調控作用下，本發明的刺激響應型介孔二氧化硅復合粒子實現 了對藥物的可控釋放，并且響應條件符合生理環境，是理想的胞內藥物運輸載體。
[0142] 實施例8
[0143] 刀豆球蛋白A與轉鐵蛋白間生物特異性結合力
[0144] 當配體A和配體B都能與受體R鍵和，且分子A的親和力更高時，首先將高親和力 配體A與受體預混合，然后加入低親和力的配體B時，受體將優先與配體A相互作用，只有 極少部分的配體A被配體B從結合位點上被置換，因此只會有很少的表觀熱量變化。
[0145] 基于以上理論，本發明首次采用等溫滴定量熱儀（ITC 200, Micarcal，Inc.)研究 了轉鐵蛋白和刀豆球蛋白A的熱力學結合并在刀豆球蛋白A的糖結合位點已被高親和力配 體甲基-a-D-批喃甘露糖苷占據時，對轉鐵蛋白與其的競爭性熱力學結合進行了研究，證 明了轉鐵蛋白與Con A間的相互作用是基于轉鐵蛋白Tf的糖鏈與Con A間的生物特異性 結合。
[0146] 具體操作如下：
[0147] 首先將轉鐵蛋白（記為Tf)和刀豆球蛋白A配成溶液，過220nm濾膜后高速離心 (8000rpm，3min)脫氣。設定實驗溫度25°C，參比功率5μ cal/sec，攪拌速度1500rpm ;加樣 200 μ L刀豆球蛋白A溶液于樣品池中，40 μ L轉鐵蛋白溶液于注射器中，每隔120s滴一滴， 每滴1. 5 μ L，采用Microcal，Inc提供的Origin插件進行數據處理，采用單結合模型計算 得到結合常數、結合位點數、摩爾結合焓等熱力學參數。為了進一步研究兩者間的生物特異 性結合力，將刀豆球蛋白A和甲基-α-D-吡喃甘露糖苷預混合（摩爾比=I :100)，4°C下 保存2h使其充分鍵和后，裝載200 μ L于樣品池中，將轉鐵蛋白溶液裝載于注射器中，刀豆 球蛋白A濃度及轉鐵蛋白濃度均與上一實驗保持一致，進行滴定。
[0148] 圖5中A的照片顯示，轉鐵蛋白與刀豆球蛋白A在pH 7.4條件下發生交聯生成沉 淀，并且該過程被刀豆球蛋白A的高親和力配體甲基-a -D-批喃甘露糖苷（Me- a -man)所 抑制，初步證明轉鐵蛋白與刀豆球蛋白A間存在基于生物特異性結合的相互作用。圖5中 C表明甲基-a -D-吡喃甘露糖苷（Me- a -man)是刀豆球蛋白A的高親和力配體。
[0149] 采用等溫滴定量熱儀對二者間的親和力（圖5中B、D)進行進一步研究表明，刀豆 球蛋白A與轉鐵蛋白之間的結合常數為5. 71 X IO6M'是單糖Me- a -man的近800倍；兩者 間的結合位點數約為0. 188,即平均每個轉鐵蛋白上有5. 3個可與Con A單體發生結合的糖 結合位點。
[0150] 圖5中D表明，me-α-man的存在使轉鐵蛋白向刀豆球蛋白A滴定過程放出的熱 量大大減少，證明轉鐵蛋白與刀豆球蛋白A的結合與糖識別過程有關。雖然根據計算結果 轉鐵蛋白-刀豆球蛋白A結合常數要大于me-a -man-刀豆球蛋白A，轉鐵蛋白有競爭性地 取代me- a -man與刀豆球蛋白A結合的可能。由于刀豆球蛋白A溶液中me- a -man大量存 在，實際上將抑制轉鐵蛋白的取代性結合，導致滴定過程中放出的熱量大大減少，有力地證 明了刀豆球蛋白A和轉鐵蛋白間的生物特異性結合。
[0151] 實施例9
[0152] 腫瘤靶向性
[0153] 以人肝癌細胞系H印G2為細胞模型，將介孔二氧化硅用FITC進行熒光標記，以介 孔二氧化硅（MSN)和未修飾轉鐵蛋白的介孔二氧化硅復合粒子（Con A(Gly/Con A)4-MSN) 為對照組，并采用在培養介質中加入游離轉鐵蛋白進行預孵育，以占據細胞表面轉鐵蛋白 受體結合位點的手段，通過共聚焦顯微鏡和流式細胞儀分別進行半定量和定量分析，進一 步研究靶向介孔二氧化硅復合粒子在轉鐵蛋白受體介導下對腫瘤細胞的特異性識別。
[0154] 具體操作如下：將H印G2細胞以2X IO4/孔的密度接種于NEST激光共聚焦專用玻 底培養皿中，使之貼壁生長。為了進行游離轉鐵蛋白競爭實驗，其中一組（命名為Tf/Con A (Gly/Con A) 4-MSN+競爭因子Tf組）在共培養22h后移除細胞培養液，加入含200 μ g/mL 轉鐵蛋白的細胞培養液進行預孵育。2h后移除各孔培養液，并分別加入含50μ g/mL不同功 能化納米藥物載體的細胞培養液。共培養4h后，移除含納米顆粒的細胞培養液，用PBS沖洗 3次，除去未被攝取的納米粒子，加入1 %的戊二醛溶液固定15min，用DAPI標記細胞核，通 過激光共聚焦顯微鏡（Nikon A1R)觀察納米粒子和藥物在胞內的分布情況。波長設置如下： DAPI 通道 404. 3nm 處激發，450. Onm 處接收；FITC 通道（即 MSN) 488. Onm 處激發，525. Onm 處接收，60倍油鏡下觀察，如圖6所示，自左向右分別為MSN組、Con A(Gly/Con A)4-MSN組、 Tf/Con A(Gly/Con A)4-MSN 組、Tf/Con A(Gly/Con A)4-MSN+競爭因子 Tf 組。
[0155] 結果表明，HepG2細胞對未進行轉鐵蛋白修飾的MSN攝取均十分有限，而在蛋白膜 的最外層連接上轉鐵蛋白后，在細胞核周圍出現了大量的MSN粒子，表明通過對MSN進行轉 鐵蛋白修飾，大大提高了 HepG2細胞對納米粒子的攝取效率。而競爭實驗進一步表明，該攝 取是在轉鐵蛋白受體介導下的特異性攝取。
[0156] 實施例10
[0157] 腫瘤靶向性
[0158] 本實施例以人肝癌細胞系H印G2和人正常肝細胞L02為細胞模型。
[0159] 將H印G2細胞和L02細胞以40X IO4/孔的密度接種于6孔板使之貼壁生長。為 了進行游離轉鐵蛋白競爭實驗，其中一組H印G2細胞（命名為Tf/Con A(Gly/Con A)4-MSN+ 競爭因子Tf組）在共培養22h后移除細胞培養液，加入含200 μ g/mL轉鐵蛋白的細胞培養 液進行預孵育。2h后移除各孔培養液，并分別加入含50 μ g/mL不同功能化納米藥物載體的 細胞培養液。共培養4h后，移除含納米顆粒的細胞培養液，用PBS沖洗2遍，加入胰酶消化 1-2分鐘，收集細胞至離心管中，1000rpm/5min離心，并以PBS清洗兩遍。為防止黏附在細 胞表面的納米粒子對實驗結果產生干擾，加入ImL 0. 4%臺盼藍溶液淬滅胞外熒光，用PBS 洗掉殘余的臺盼藍送流式細胞儀檢測，結果如圖7所示。
[0160] 結果表明，HepG2細胞和L02細胞對未修飾的MSN的攝取率均在20 %左右；MSN被 (Con A/Gly)4多層膜（自組裝層）修飾后，可能由于Con A和細胞膜表面的某些糖蛋白發 生特異性結合，介導了一部分內吞，HepG2細胞和L02細胞的攝取率均提高到了 30%左右； 多層膜（自組裝層）最外層連接上Tf后，體系被賦予了優良的靶向性能，HepG2細胞表面 由于存在大量的TfRl和TfR2,與納米粒子表面的Tf發生特異性識別而介導了大量的內吞， 攝取率達到了 60 %。同時由于納米粒子表面Con A的糖結合位點大部分已被Tf所占據，粒 子與細胞膜表面糖蛋白的特異性結合不再存在，L02細胞的攝取率降低至25%左右。
[0161] 以上結果表明，本發明的介孔二氧化硅復合粒子具有優異的腫瘤靶向性。
[0162] 實施例11
[0163] 納米藥物載體在腫瘤細胞和正常細胞內的解離行為
[0164] 將介孔二氧化硅用紅色熒光探針Texas Red進行標記，刀豆球蛋白A用綠色熒光 探針FITC進行標記，合成雙重突光標記的納米藥物載體，并將該納米粒子與細胞共培養， 采用共聚焦熒光顯微鏡對納米藥物載體的攝取和多層膜的解離行為進行研究。
[0165] 具體操作如下：分別將H印G2和L02細胞以2X IO4/孔的密度接種于NEST激光共 聚焦專用玻底培養皿中，貼壁生長24h后移除細胞培養液，加入含20 μ g/mL雙重熒光標記 的納米藥物載體的細胞培養液，分別孵育3h、8h、24h后，用PBS沖洗3次，除去未被攝取的 納米粒子，加入1 %的戊二醛溶液固定15min，用DAPI標記細胞核，通過激光共聚焦顯微鏡 (Nikon A1R)觀察納米粒子和藥物在胞內的分布情況。
[0166] 波長設置如下：DAPI通道404. 3nm處激發，450. Onm處接收；FITC通道（即Con A) 488. Onm 處激發，525. Onm 處接收；Texas Red 通道（即 MSN) 561. Onm 處激發，595. Onm 處 接收，60倍油鏡下觀察，結果如圖8所示。
[0167] 結果表明，HepG2細胞對靶向藥物載體的攝取明顯多于L02細胞，并且在H印G2細 胞胞漿中觀察到了分散的綠色熒光，表明靶向納米藥物載體進入細胞后，多層膜在胞內弱 酸性環境的刺激下發生解離，釋放Con A-FITC。
[0168] 實施例12
[0169] 納米載藥系統在腫瘤細胞和正常細胞內的藥物釋放行為
[0170] 利用阿霉素本身自發熒光的特性，將介孔二氧化硅用紅色熒光探針Texas Red進 行標記，并在其表面構建靶向蛋白多層膜（以未包覆靶向蛋白膜的MSN載藥顆粒即MSNd為 對照組），負載藥物后與細胞共培養，在共聚焦熒光顯微鏡下觀察該載藥納米顆粒的攝取和 藥物釋放行為。
[0171] 具體操作如下：
[0172] 分別將!fepG2和L02細胞以2 X IO4/孔的密度接種于NEST激光共聚焦專用玻底培 養皿中，貼壁生長24h后移除細胞培養液，加入阿霉素含量為0. 5 μ g/mL的上述熒光標記的 載藥納米顆粒的細胞培養液，分別孵育3h或8h后，用PBS沖洗3次，除去未被攝取的納米粒 子，加入1 %的戊二醛溶液固定15min，用DAPI標記細胞核，通過激光共聚焦顯微鏡（Nikon AIR)觀察納米粒子和藥物在胞內的分布情況。
[0173] 波長設置如下：DAPI通道404. 3nm處激發，450. Onm處接收；DOX通道488. Onm處 激發，525. Onm處接收；Texas Red通道（即MSN) 561. Onm處激發，595. Onm處接收，60倍油 鏡下觀察，結果如圖9所示。
[0174] 將H印G2細胞與材料共培養3h，可以看到其對靶向納米載藥顆粒攝取量和胞內藥 物水平明顯高于未修飾蛋白膜的MSN載藥粒子。細胞與靶向納米載藥顆粒共培養后，3h時 藥物即均勻分散在胞漿之中，使細胞呈現綠色熒光；并且此時由于MSN顆粒仍與藥物共存， 使其呈現疊加的黃色熒光。
[0175] 8h時由于藥物大部分已經逸出，該納米載藥顆粒呈現紅色熒光；并且觀察到核質 濃縮以及細胞收縮變圓的行為，表明細胞在藥物作用下發生凋亡。
[0176] 而對于L02細胞，細胞對兩種納米粒子的攝取量均很少，且隨著時間的增加攝取 量并未見提高。但仍然有部分納米粒子通過網格蛋白介導的途徑被攝取，在胞內溶酶體的 刺激下發生藥物泄漏。
[0177] 整體來說，藥物在L02細胞內的積累量遠遠低于H印G2,共培養后細胞形態在也維 持在正常狀態。
[0178] 實施例13
[0179] 功能蛋白膜在調控抗阿霉素對不同腫瘤細胞系和正常細胞系細胞毒性中的作用
[0180] 將靶向載藥納米顆粒（Tf/Con A(Gly/Con A)4_MSND)和不同的腫瘤細胞系（人 肝癌細胞H印G2、人乳腺癌細胞MDA-MB-231、人胃癌細胞MGC-803)和正常細胞系（人正 常肝細胞L02、小鼠成肌細胞C2C12)共同培養，以未包覆蛋白膜的介孔二氧化硅載藥顆粒 (MSN d)及無粒子的空白為對照組，利用MTT法評價其對腫瘤細胞的靶向和抑制作用。
[0181] 具體操作如下：
[0182] 將細胞以2X IO4/孔的密度接種于24孔板（每組實驗設6個平行實驗），貼壁生 長 24h 后，其中一組（Tf/Con A(Gly/Con A)4-MSND+競爭因子 Tf)加入 ImL 含 200yg/mL 轉 鐵蛋白的細胞培養液預孵育30min以占據細胞膜表面的TfRl和TfR2結合位點。各孔移除 細胞培養液，加入不同阿霉素含量的介孔二氧化硅載藥納米顆粒（MSN d)和靶向載藥納米顆 粒（Tf/Con A(Gly/Con A)4-MSND)懸浮培養液lmL，共培養4h后移除細胞培養液，用PBS沖 洗3次，以除去未被細胞攝取的納米顆粒，繼續培養44h。用MTT法對細胞活力進行評價，結 果如圖10所示。
[0183] 相對于未包覆多層膜結構的MSN載藥體系MSNd，該靶向載藥納米載體Tf/Con A(Gly/Con A)4-MSND對腫瘤細胞的抑制率均得以提高，對正常細胞的毒性均大幅度下降。這 是由于介孔二氧化硅復合粒子在轉鐵蛋白受體介導下被腫瘤細胞快速內吞，并在腫瘤胞內 微環境的刺激下迅速釋放藥物，因此對腫瘤細胞的抑制性更強；而正常細胞只能通過網格 蛋白介導的非特異性內吞攝取靶向載藥納米顆粒，載藥體系毒性大幅降低。且加入競爭因 子Tf后，靶向載藥納米顆粒對腫瘤細胞的毒性下降，證明材料對腫瘤細胞的抑制率上升是 基于轉鐵蛋白受體介導的主動靶向。
[0184] 在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可 以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范 圍。
【權利要求】
1. 一種介孔二氧化娃復合粒子，其特征在于，包括內核、中層和外層，其中， 所述內核是納米介孔二氧化硅粒子； 所述中層設置在所述內核的表面，包括至少一層自組裝層，所述自組裝層包含相互結 合的刀豆球蛋白A和糖元； 所述外層為轉鐵蛋白層，設置在所述中層的表面。
2. 如權利要求1所述的介孔二氧化硅復合粒子，其特征在于，所述中層具有1-15層自 組裝層，較佳地為2-10層自組裝層。
3. 如權利要求1所述的介孔二氧化硅復合粒子，其特征在于，所述介孔二氧化硅復合 粒子在pH 4. 0-6. 0下所述中層和所述外層發生解離。
4. 如權利要求1所述的介孔二氧化硅復合粒子，其特征在于，所述介孔二氧化硅復合 粒子具有以下一個或多個特征： (1) 所述納米介孔二氧化硅粒子的孔徑為I. 5-30nm ; (2) 所述納米介孔二氧化娃粒子的粒徑為50-300nm ; (3) 所述介孔二氧化娃復合粒子的平均粒徑為60-350nm ; (4) 所述介孔二氧化硅復合粒子在溫度高于200°C至550°C時所述中層和所述外層發 生熱解，失重率達到20-30%。
5. -種如權利要求1所述的介孔二氧化硅復合粒子的制備方法，其特征在于，所述制 備方法包括以下步驟： (a) 提供納米介孔二氧化硅粒子作為內核； (b) 所述納米介孔二氧化硅粒子帶正電后分散到含有刀豆球蛋白A溶液后，再分散到 含有糖元的溶液，在納米介孔二氧化硅粒子表面形成一層自組裝層，任選地重復上述步驟 形成數層自組裝層； (c) 將步驟（b)獲得的粒子分散到含有刀豆球蛋白A溶液后，再分散到轉鐵蛋白溶液中 獲得所述的介孔二氧化硅復合粒子。
6. 如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下一個或多個特 征： (1) 所述步驟（b)或所述步驟（c)的含有刀豆球蛋白A溶液中所述刀豆蛋白A的濃度 為 0? l-5mg/mL，較佳地為 0? 2-3mg/mL ; (2) 所述步驟（b)的含有糖元的溶液中所述糖元的濃度為0.2-5mg/mL，較佳地為 0. 5-3mg/mL ； (3) 所述步驟（b)中所述納米介孔二氧化硅粒子的質量與所述含有刀豆球蛋白A溶液 的體積比為l_60mg:lml，較佳地為10-50mg:lml，更佳地為30_45mg:lml ; (4) 所述步驟（b)中所述納米介孔二氧化硅粒子的質量與所述含有糖元的溶液的體積 比為 l-60mg:lml，較佳地為 10_50mg:lml，更佳地為 30_45mg:lml ; (5) 所述轉鐵蛋白溶液中轉鐵蛋白的濃度為0. 2-5mg/mL，較佳地為0. 5-3mg/mL ; (6) 所述步驟（b)獲得的粒子的質量與所述含有刀豆球蛋白A溶液的體積比為 l_60mg:lml，較佳地為 10_50mg:lml，更佳地為 30_45mg:lml ; (7) 所述步驟（b)獲得的粒子的質量與所述轉鐵蛋白溶液的體積比為l-60mg:lml，較 佳地為 10_50mg:lml，更佳地為 30_45mg:lml。
7. 如權利要求1-3任一項所述的介孔二氧化硅復合粒子的用途，其特征在于，用于制 備藥物載體。
8. -種復合物，其特征在于，所述復合物包含： 權利要求1-3任一項所述的介孔二氧化硅復合粒子；和 抗癌藥物。
9. 一種藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含權利要求8所述的復合物和藥 學上可接受的載體。
10. 如權利要求8所述的復合物或權利要求9所述的藥物組合物的用途，其特征在于， 用于制備預防和/或治療腫瘤的藥物。
【文檔編號】A61K45/00GK104324380SQ201410499726
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年10月17日 優先權日:2014年10月17日
【發明者】劉昌勝, 屈雪, 李金陽 申請人:華東理工大學