雙因子攜載型雜化仿生骨支架的制備方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及雙因子攜載型雜化仿生骨支架的制備方法及其應用。所涉及的制備方法是將纖維內鈣與硅雜化仿生骨支架浸入合適濃度的趨化因子和成骨誘導蛋白混合溶液中，在適宜條件下處理后得雙因子攜載型雜化仿生骨支架。所涉及的應用為上述支架材料作為骨缺損修復材料的應用。本發明中雜化骨膠原內部還有二氧化硅和羥基磷灰石兩種礦物質，其中二氧化硅表面存在的大量帶有負電荷的硅醇基團及活性羥基對堿性蛋白如SDF-1或TGF-β的有效結合，及納米羥基磷灰石對成骨誘導蛋白如BMP-2或BMP-7的特異強吸附性，使得無需添加額外的緩釋系統而實現了雜化骨細胞募集性/成骨誘導性的雙重功能化修飾。
【專利說明】雙因子攜載型雜化仿生骨支架的制備方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于組織工程支架材料領域，涉及一種構建新型具有誘導骨原位再生能力的纖維內鈣/硅雜化仿生骨支架的方法，構建了具有高度仿真性、良好機械性能及誘導骨原位再生作用的新型仿生雜化骨支架材料。
【背景技術】
[0002]自然骨組織主要由膠原有機質和納米羥基磷灰石無機礦物以7級分級、有序排列的方式相互作用而形成，決定了骨組織優異的力學特性和生物學特征。目前的人工合成骨修復材料雖有上百種之多，但尚未見有能夠同時準確模擬自然骨組織成分、納米結構和分級結構的產品，導致其無法兼具自然骨優良機械性能及高生物活性的特性。
[0003]因此，如何采用仿生合成的手段，模擬自然骨組織的分級結構，恢復自然礦化膠原中有機質和無機礦物的有序排列狀態，是構建具有與自然骨結構和功能相近似的新型骨修復材料的關鍵所在。
[0004]傳統的合成方法往往是將膠原與鈣磷礦物質晶體直接混和或者是二者在纖維化自組裝過程中共沉積而形成，這種礦化材料雖然在基本的化學成分上與自然骨組織一致，但是在微觀結構上則表現為礦物質在膠原纖維外的無序沉積，并不能模擬自然骨組織膠原纖維與礦物質有序排列的纖維內礦化形式，而這種纖維內礦化形式是構成自然骨組織7級分級結構的基礎，不僅決定了骨組織在納米尺度上的力學性能，更對其整體機械和生物學特性起著決定性作用。
[0005]近年來，在仿生礦化理念的指導下，使用非膠原蛋白類似物，穩定并引導液相無定形礦物質納米前體在膠原纖維內定向滲透、沉積、晶化，成功實現了膠原纖維的纖維內鈣化，所形成的纖維內仿生鈣化膠原支架生物相容性好，機械強度高，極大地提高了膠原支架的穩定性。但是當該技術應用于具有分級結構的脫礦骨膠原基質時，由于自然膠原基質密度高、膠原交聯度大、分級層次多，而使礦物質前體對膠原的滲透性較差，使得礦化周期長(14天-3月)、礦化不均勻、無法形成脫礦骨膠原基質均勻一致的纖維內鈣化，成為仿生礦化技術進一步應用于骨缺損修復材料構建領域的掣肘。此外這種纖維內鈣化材料具有脆性大、促成骨活性低的問題，那么如何使用仿生合成的方法，在自然骨膠原多級分級結構的基礎上，實現其快速均勻的纖維內礦化，同時提高其韌性及促成骨活性成為該領域下一步研究的熱點和難點。
【發明內容】
[0006]針對現有技術的缺陷或不足，本發明的目的在于提供一種雙因子攜載型雜化仿生骨支架的制備方法。
[0007]為此，本發明提供的雙因子攜載型雜化仿生骨支架的制備方法包括:
[0008]將纖維內鈣與硅雜化仿生骨支架浸入合適濃度的趨化因子和成骨誘導蛋白混合溶液中，在適宜條件下處理后得雙因子攜載型雜化仿生骨支架。
[0009]所述的趨化因子為SDF-1或TGF- β。
[0010]所述的成骨誘導蛋白為ΒΜΡ-2或ΒΜΡ-7。
[0011]所述的適宜條件為-20°C?-50°C。
[0012]所述趨化因子和成骨誘導蛋白混合溶液濃度為:SDF-1 =800-1200 μ g/mL, BMP-7:200-500 μ g/mL, TGF-β:600-1000 μ g/mL, ΒΜΡ-2:400-800 μ g/mL。所述的纖維內鈣與硅雜化仿生骨支架的制備方法包括:
[0013](I)對動物骨進行脫脂、脫蛋白、脫礦、脫抗原處理后得到具有分級結構的骨膠原支架；
[0014](2)將步驟(I)所得的骨膠原支架置于硅酸前體溶液中進行礦化處理，實現二氧化硅礦物質在骨膠原支架膠原分子內的沉積；所述硅酸前體溶液為正硅酸溶液與聚丙烯氯化銨溶液的混合溶液；
[0015](3)將步驟(2)所得的纖維內仿生硅化骨膠原支架材料置于磷酸鈣前體溶液中孵育制得纖維內鈣與硅雜化仿生骨支架；所述磷酸鈣前體溶液為聚陰離子穩定的無定型液相磷酸鈣前體溶液，所述聚陰離子的供體為聚天冬氨酸或聚丙烯酸。
[0016]所述脫脂、脫蛋白、脫礦、脫抗原處理包括先用氫氧化鈉溶液浸泡處理，之后用氯仿和甲醇混合溶液進行脫脂處理，接著用雙氧水進行脫蛋白處理，然后用EDTA溶液進行脫礦處理，最后用鹽酸胍、Tris-HCl和CaCl2的混合溶液進行托抗原處理。
[0017]將步驟(I)所得的骨膠原支架置于硅酸前體溶液中進行礦化處理2-6天。將步驟
(2)所得的纖維內仿生硅化骨膠原支架材料置于磷酸鈣前體溶液中孵育4-7天。
[0018]針對現有技術的缺陷或不足，本發明的另一目的在于提供上述方法制備的雙因子攜載型雜化仿生骨支架作為骨缺損修復材料的應用，誘導骨原位再生。
[0019]與現有技術相比，本發明的優點在于:
[0020](I)本發明中雜化骨膠原內部還有二氧化硅和羥基磷灰石兩種礦物質，其中二氧化硅表面存在的大量帶有負電荷的硅醇基團及活性羥基對堿性蛋白(如SDF-UTGF-β)的有效結合，及納米羥基磷灰石對成骨誘導蛋白(如ΒΜΡ-2、ΒΜΡ-7)的特異強吸附性，使得無需添加額外的緩釋系統而實現了雜化骨細胞募集性/成骨誘導性的雙重功能化修飾。細胞募集因子及成骨誘導因子將隨材料在體內降解而緩慢有序釋放，活性硅易水解的特點可實現SDF-1及活性硅酸的首先釋放，從而發揮細胞募集及促血管新生的功能，有利于移植區血供的盡早建立，為骨缺損的修復提供細胞及營養基礎；羥基磷灰石骨傳導性強的特點有利于骨結合的早期形成，水解緩慢的特點可實現ΒΜΡ-7的緩釋，從而促進募集而來的骨髓間充質干細胞的成骨分化。該材料有望達到誘導自體骨組織原位再生的功能，從而克服了常規骨組織工程中種子細胞獲取困難、來源有限、費用昂貴、成骨活性不足等嚴重缺陷。
[0021](2)本發明通過將自然骨膠原基質的分級結構與纖維內仿生雜化理念相結合，所形成的多分級、纖維內鈣/硅雜化仿生骨膠原支架相比于其他骨修復材料具有明顯的優越性，體現在:
[0022]I)脫礦脫抗原的骨膠原基質在消除異種骨抗原性的同時，保留了自然骨組織多分級結構的增強增韌機制，并能夠為細胞生長提供更好的內環境；
[0023]2)纖維內羥基磷灰石/ 二氧化硅礦物質的沉積及骨膠原基質7級分級結構的保存，顯著增強了膠原纖維的機械強度；
[0024]3)材料中多組分有序結合的特點綜合了膠原纖維的生物相容性、羥基磷灰石的骨傳導性及活性硅促進成骨、成血管特性；
[0025]4)材料鈣/硅比例的可控化為定向調節材料的理化性能、機械強度及生物學特性提供了可能，有利于形成適于不同類型骨缺損修復的系列材料；
[0026]5) 二氧化硅表面的活性硅醇基團及納米羥基磷灰石的強吸附性，使得材料的可修飾性強，且不同的修飾位點及修飾機理有利于對材料實現多重功能化改性。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0027]圖1為實施例1的纖維內仿生雜化骨膠原支架材料的Micro-CT掃描重建圖，其中a為三維重建圖、b為冠狀面圖像、c為矢狀面圖像、d為橫斷面圖像。
[0028]圖2為實施例1制備的硅/鈣雜化骨膠原支架的傅里葉紅外光譜與硅化、鈣化骨膠原支架的傅里葉紅外光譜的對比圖。
[0029]圖3為實施例1制備的纖維內仿生雜化骨膠原支架在模擬體液中浸泡24小時后的投射電鏡觀察圖；其中a為25000倍圖像；b為40000倍圖像。
[0030]圖4為實施例1的脫礦骨膠原、對比例I仿生硅化骨膠原、實施例1的仿生雜化骨膠原的生物相容性對比圖，相同大寫字母表示不同支架組間不具有統計學顯著(P>0.05)；相同小寫字母表示不同支架浸提液組間不具有統計學顯著(P>0.05)。
[0031]圖5為實施例1的纖維內仿生雜化骨膠原支架表面形成大量骨髓間充質干細胞的粘附示意圖，左上圖為488nm激發波長下共聚焦掃描重建圖，顯示的是綠色熒光蛋白標記的骨髓間充質干細胞在雜化骨膠原表面的粘附；右上圖561nm激發波長下共聚焦掃描重建圖，顯示的是細胞骨架鋪展情況；左下633nm激發波長下共聚焦掃描重建圖，顯示的是細胞核的分布；右下圖為上述三者的疊加。
[0032]圖6為實施例1制備的纖維內仿生雜化骨膠原支架雙因子攜載型雜化骨SDF-1、BMP-7的累積釋放量。
【具體實施方式】
[0033]現有的纖維內仿生鈣化膠原材料生物相容性好，機械強度高，極大地提高了膠原支架的穩定性，但是應用于具有分級結構的骨膠原支架的纖維內鈣化時存在礦化周期長(14天-3月)、礦化不均勻等問題；現有的纖維內仿生硅化膠原材料合成速度快、膠原礦化均勻、支架材料韌性高、促成骨活性強，但是仍存在機械性能尚無法與自然骨組織相媲美，細胞生物相容性與骨整合速度不及纖維內鈣化材料等問題亟待解決。因此如何將纖維內鈣化生物相容性高、力學性能接近天然骨的特點與纖維內硅化快速、高效、促成骨活性強的優勢相結合，構建出新型的纖維內羥基磷灰石/二氧化硅雜化沉積的仿生骨膠原支架成為仿生礦化技術進一步應用于骨缺損修復材料構建領域的關鍵。
[0034]本發明將自然骨膠原基質的分級結構與纖維內仿生雜化技術相結合，構建多分級纖維內鈣/硅雜化仿生骨支架，利用雜化仿生骨中兩種礦物質可修飾性強的特點，對其進行趨化因子(如SDF-1)及成骨誘導蛋白(如BMP-7)的雙因子加載，以實現其誘導骨原位再生的應用。
[0035]本發明的骨膠原支架(自然骨膠原基質)可以為牛骨膠原支架、豬骨膠原支架、猴骨膠原支架等動物骨膠原支架。骨膠原支架為具有分級結構的脫礦脫抗原骨膠原支架多分級纖維內鈣/硅雜化仿生骨支架的制備方法包括:
[0036](I)采用脫脂、脫蛋白、脫礦、脫抗原的方法制備具有分級結構的骨膠原支架。
[0037](2)通過水解正硅酸四乙酯獲得正硅酸溶液，與聚丙烯氯化銨溶液混合后，制備穩定的硅酸前體溶液；
[0038](3)將步驟⑴所得的脫礦脫抗原骨膠原支架置于步驟(2)所得的硅酸前體溶液中進行礦化處理，實現二氧化硅礦物質在膠原分子內的有序沉積。
[0039](4)制備聚陰離子穩定的無定型液相磷酸鈣前體溶液。
[0040](5)將步驟(3)所得的纖維內仿生硅化骨膠原支架材料置于步驟(4)所得的聚陰離子穩定的無定型液相磷酸鈣前體溶液中孵育制得纖維內雜化骨膠原支架材料。
[0041](6)將步驟(5)所得的纖維內雜化骨膠原支架材料置于不同濃度的趨化因子/成骨誘導蛋白溶液中一 50°C冷凍干燥24小時，制得雙因子攜載型雜化骨，賦予材料誘導骨原位再生的作用，以應用于骨缺損的修復。
[0042]本發明的硅酸前體溶液的制備方法可參考:室溫以正硅酸四乙酯為原料采用稀酸水解法制備一定濃度(3% -5% )的正硅酸；將所得正硅酸與適宜濃度(10-30mg/mL)聚丙烯氯化銨溶液按照適當的體積比均勻混合，并將終溶液PH值調至5-6 ;離心取上清制得不同濃度的聚丙烯氯化銨穩定的正硅酸前體溶液。
[0043]本發明的磷酸鈣前體溶液的制備方法可解釋如下:以Tris緩沖液為溶劑分別制備CaCl2.2H20溶液及K2HPO4溶液，之后將CaCl2.2H20溶液及K2HPO4溶液等容混合，并加入聚陰離子穩定劑如聚天冬氨酸或聚丙烯酸，從而制得聚陰離子穩定的無定型液相磷酸鈣前體溶液。
[0044]以下是發明人提供的實施例，以對本發明的技術方案作進一步解釋說明。
[0045]實施例1:
[0046]該實施例的雙因子攜載型雜化仿生骨支架構建方法，按照如下步驟:
[0047](I)取牛干飯端松質骨制備IcmX IcmX Icm骨塊；將Ikg骨塊置于1L0.lmol/LNaOH溶液中浸泡處理24h后，使用ILl:1氯仿/甲醇混合溶劑脫脂72h，每24h更換一次脫脂液，脫脂間隙4000轉/min離心30min，清除骨塊或骨粒內異物；800mL 0.3g/L雙氧水脫蛋白48h，脫除主要非膠原蛋白；800mL17% EDTA溶液室溫下脫鈣直至完全去除礦物質；500mL 4mol/L 鹽酸胍、50mmol/LTris-HCl 和 0.5mol/L CaCl2 (pH = 7.4)溶液 4°C再次脫蛋白24h，徹底去除免疫原性較強的非膠原蛋白，而保留膠原結構不被破壞；500mL雙蒸水沖洗，使用25kGy的Y-射線滅菌，4°C儲存備用。
[0048](2)室溫以正硅酸四乙酯為原料采用稀酸水解法制備濃度為3%的正硅酸；將所得正硅酸與20mg/mL的聚丙烯氯化銨溶液按照1:1的體積比均勻混合，并將終溶液pH值調至5.5 ；3000轉/分鐘離心3分鐘，取上清制得10mg/mL的聚丙烯氯化銨穩定的1.5%的正硅酸前體溶液。
[0049](3)將步驟(I)所得的脫礦脫抗原牛骨膠原支架置于步驟(2)所得的硅酸前體溶液中進行礦化處理，每天更換新鮮的硅酸前體溶液，分別孵育2天后，使用蒸餾水反復沖洗后，冷凍干燥備用，制得具有分級結構的纖維內仿生硅化骨膠原支架材料；
[0050](4)以0.1M Tris緩沖液為溶劑分別制備9mM CaCl2.2Η20溶液及4.2mM K2HPO4溶液，將上述溶液等容混合，并加入聚陰離子穩定劑如聚天冬氨酸(100 μ g/mL)，從而制得聚陰離子穩定的無定型液相磷酸鈣前體溶液(終濃度:4.5mM CaCl2.2H20/2.1mM K2HPO4)；
[0051](5)將步驟(3)所得的纖維內仿生硅化骨膠原支架材料置于步驟(4)所得的聚陰離子穩定的無定型液相磷酸鈣前體溶液中，37°C條件下孵育7天，每天更換鈣化液。最終形成以纖維內羥基磷灰石與二氧化硅有序沉積為特點、具有分級結構的仿生雜化骨膠原支架材料，如圖1所示；
[0052](6)將10g步驟(5)所得的纖維內雜化骨膠原支架材料置于10mL含800 μ g/mLSDF-1及200 μ g/mL BMP-7的溶液中，_50°C冷凍干燥24小時，制得雙因子攜載型雜化骨，應用于骨缺損的修復。
[0053]實施例2:
[0054]該實施例與實施例1不同之處在于:
[0055](3)將步驟(I)所得的脫礦脫抗原牛骨膠原支架置于步驟(2)所得的硅酸前體溶液中進行礦化處理，每天更換新鮮的硅酸前體溶液，分別孵育4天后，使用蒸餾水反復沖洗后，冷凍干燥備用，制得具有分級結構的纖維內仿生硅化骨膠原支架材料。
[0056](5)將步驟(3)所得的纖維內仿生硅化骨膠原支架材料置于步驟(4)所得的聚陰離子穩定的無定型液相磷酸鈣前體溶液中，37°C條件下孵育4天，每天更換鈣化液。最終形成以纖維內羥基磷灰石與二氧化硅有序沉積為特點、具有分級結構的仿生雜化骨膠原支架材料。
[0057]6)將10g步驟(5)所得的纖維內雜化骨膠原支架材料置于10mL含1000 μ g/mLTGF-β及400 μ g/mL BMP-2的溶液中，_20°C冷凍干燥制得雙因子攜載型雜化骨，應用于骨缺損的修復。
[0058]對比例1:
[0059]該對比例提供的是關于纖維內仿生硅化骨膠原支架材料的制備方法:
[0060](I)取牛干飯端松質骨制備IcmX IcmX Icm骨塊；將Ikg骨塊置于1L0.lmol/LNaOH溶液中浸泡處理24h后，使用ILl:1氯仿/甲醇混合溶劑脫脂72h，每24h更換一次脫脂液，脫脂間隙4000轉/min離心30min，清除骨塊或骨粒內異物；800mL 0.3g/L雙氧水脫蛋白48h，脫除主要非膠原蛋白；800mL17% EDTA溶液室溫下脫鈣直至完全去除礦物質；5OOmL 4mol/L 鹽酸狐、50mmol/LTris_HCl 和 0.5mol/L CaCl2 (pH = 7.4)溶液低溫下再次脫蛋白24h，徹底去除免疫原性較強的非膠原蛋白，而保留膠原結構不被破壞；500mL雙蒸水沖洗，使用25kGy的Y-射線滅菌，4°C儲存備用。
[0061](2)室溫以正硅酸四乙酯為原料采用稀酸水解法制備濃度為3%的正硅酸；將所得正硅酸與20mg/mL的聚丙烯氯化銨溶液按照1:1的體積比均勻混合，并將終溶液pH值調至5.5 ；3000轉/分鐘離心3分鐘，取上清制得10mg/mL的聚丙烯氯化銨穩定的1.5%的正硅酸前體溶液。
[0062](3)將步驟(I)所得的脫礦脫抗原牛骨膠原支架置于步驟(2)所得的硅酸前體溶液中進行礦化處理，每天更換新鮮的硅酸前體溶液，分別孵育2天后，使用蒸餾水反復沖洗后，冷凍干燥備用，制得具有分級結構的纖維內仿生硅化骨膠原支架材料。
[0063]對比例2:
[0064]該對比例提供的是關于纖維內仿生鈣化骨膠原支架材料的制備方法:
[0065](I)取牛干飯端松質骨制備IcmX IcmX Icm骨塊；將Ikg骨塊置于1L0.lmol/LNaOH溶液中浸泡處理24h后，使用ILl:1氯仿/甲醇混合溶劑脫脂72h，每24h更換一次脫脂液，脫脂間隙4000轉/min離心30min，清除骨塊或骨粒內異物；800mL 0.3g/L雙氧水脫蛋白48h，脫除主要非膠原蛋白；800mL17% EDTA溶液室溫下脫鈣直至完全去除礦物質；5OOmL 4mol/L 鹽酸狐、50mmol/LTris_HCl 和 0.5mol/L CaCl2 (pH = 7.4)溶液低溫下再次脫蛋白24h，徹底去除免疫原性較強的非膠原蛋白，而保留膠原結構不被破壞；500mL雙蒸水沖洗，使用25kGy的Y-射線滅菌，4°C儲存備用。
[0066](2)以0.1M Tris緩沖液為溶劑分別制備9mM CaCl2.2Η20溶液及4.2mM K2HPO4溶液，將上述溶液等容混合，并加入聚陰離子穩定劑如聚天冬氨酸(100 μ g/mL)，從而制得聚陰離子穩定的無定型液相磷酸鈣前體溶液(終濃度:4.5mM CaCl2.2H20/2.1mM K2HPO4)；
[0067](3)將步驟(I)所得的脫礦脫抗原牛骨膠原支架置于步驟(2)所得聚陰離子穩定的無定型液相磷酸鈣前體溶液中，37°C條件下孵育14天后，使用蒸餾水反復沖洗后，冷凍干燥備用，制得具有分級結構的纖維內仿生鈣化骨膠原支架材料。
[0068]發明人對實施例1和對比例1、2所得的產品進行了如下實驗:
[0069]如圖2所示，傅里葉紅外光譜分析證實這種仿生雜化骨膠原支架同時具有二氧化硅和羥基磷灰石兩種礦物；在硅化骨膠原組中在460，800和第1YOcnr1處可見S1-O-Si鍵的振動峰(TO1, TO2和TO3),但未見有關羥基磷灰石的相關峰；在鈣化骨膠原組中可檢測到960和1020CHT1處的羥基磷灰石相關的V ^O4和v 3P04峰和560和602CHT1處的v 4P04和V2PO4峰，但未見有關二氧化硅的相關峰；而在雜化骨膠原中則可同時檢測到羥基磷灰石和二氧化硅的相關峰，顯示了其雜化特性。
[0070]如圖3所不,實施例1制備的仿生雜化骨膠原支架在模擬體液中浸泡24小時后表面形成大量羥基磷灰石晶體沉積，顯示了良好的生物活性。
[0071]如圖4所示，相比于仿生硅化和脫礦骨膠原，實施例1制備的仿生雜化骨膠原支架具有更好的生物相容性。
[0072]如圖5所示，實施例1制備的仿生雜化骨膠原支架可以促進骨髓間充質干細胞可在其表面形成良好的粘附。
[0073]將實施例1制備的雙因子攜載型雜化骨(50g)置于50mL模擬體液中37°C孵育12天，利用酶聯免疫吸附實驗檢測雙因子的釋放量可見該雙因子攜載型雜化骨可以實現SDF-U BMP-7的緩釋，結果如圖6所示。
[0074]以上內容是結合具體的優選實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定本發明的【具體實施方式】僅限于此，對于本發明所屬【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干簡單的推演或替換，都應當視為屬于本發明由所提交的權利要求書確定專利保護范圍。
【權利要求】
1.一種雙因子攜載型雜化仿生骨支架的制備方法，其特征在于，該制備方法包括: 將纖維內鈣與硅雜化仿生骨支架浸入合適濃度的趨化因子和成骨誘導蛋白混合溶液中，在適宜條件下處理后得雙因子攜載型雜化仿生骨支架。
2.如權利要求1所述的雙因子攜載型雜化仿生骨支架的制備方法，其特征在于，所述的趨化因子為SDF-1或TGF-β。
3.如權利要求1所述的雙因子攜載型雜化仿生骨支架的制備方法，其特征在于，所述的成骨誘導蛋白為ΒΜΡ-2或ΒΜΡ-7。
4.如權利要求1所述的雙因子攜載型雜化仿生骨支架的制備方法，其特征在于，所述的適宜條件為_20°C?-50°C。
5.如權利要求2所述的雙因子攜載型雜化仿生骨支架的制備方法，其特征在于，所述趨化因子濃度為:SDF-1:800-1200 μ g/mL, TGF-β:600-1000 μ g/mL。
6.如權利要求1所述的雙因子攜載型雜化仿生骨支架的制備方法，其特征在于，所述成骨誘導蛋白溶液的濃度為:BMP-7 =200-500 μ g/mL, BMP-2:400-800 μ g/mL。
7.如權利要求1所述的雙因子攜載型雜化仿生骨支架的制備方法，其特征在于，所述的纖維內鈣與硅雜化仿生骨支架的制備方法包括: (1)對動物骨進行脫脂、脫蛋白、脫礦、脫抗原處理后得到具有分級結構的骨膠原支架； (2)將步驟(I)所得的骨膠原支架置于硅酸前體溶液中進行礦化處理，實現二氧化硅礦物質在骨膠原支架膠原分子內的沉積；所述硅酸前體溶液為正硅酸溶液與聚丙烯氯化銨溶液的混合溶液； (3)將步驟(2)所得的纖維內仿生硅化骨膠原支架材料置于磷酸鈣前體溶液中孵育制得纖維內鈣與硅雜化仿生骨支架；所述磷酸鈣前體溶液為聚陰離子穩定的無定型液相磷酸鈣前體溶液，所述聚陰離子的供體為聚天冬氨酸或聚丙烯酸。
8.如權利要求7所述的雙因子攜載型雜化仿生骨支架的制備方法，其特征在于，所述脫脂、脫蛋白、脫礦、脫抗原處理包括先用氫氧化鈉溶液浸泡處理，之后用氯仿和甲醇混合溶液進行脫脂處理，接著用雙氧水進行脫蛋白處理，然后用EDTA溶液進行脫礦處理，最后用鹽酸胍、Tris-HCl和CaCl2的混合溶液進行托抗原處理。
9.如權利要求7所述的雙因子攜載型雜化仿生骨支架的制備方法，其特征在于，將步驟(I)所得的骨膠原支架置于硅酸前體溶液中進行礦化處理2-6天；將步驟(2)所得的纖維內仿生硅化骨膠原支架材料置于磷酸鈣前體溶液中孵育4-7天。
10.權利要求1所述的雙因子攜載型雜化仿生骨支架的方法制備的雙因子攜載型雜化仿生骨支架作為骨缺損修復材料的應用。
【文檔編號】A61L27/58GK104288839SQ201410488208
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月22日 優先權日:2014年9月22日
【發明者】牛麗娜, 焦凱, 陳吉華, 鄭智明, 李齊宏, 陸松鶴 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學