載鹽霉素膠束及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明載鹽霉素膠束及其制備方法和應用屬于醫藥【技術領域】，本發明提供了一種載鹽霉素具有高靶向性及滲透能力的小粒徑膠束，是以DSPE-PEG2000-CRGDK共聚物為載體，包載鹽霉素鈉的膠束；本發明還提供該膠束的制備方法，以及在制備治療肝癌藥物中的應用。本發明的載鹽霉素膠束，可達到同時靶向分化肝癌細胞和肝癌干細胞。本發明是肝癌治療的一種新策略，利用膠束載體的優勢，再聯合高滲透性靶向多肽CRGDK達到靶向肝癌細胞和肝癌干細胞的效果，可以從其根源上治療肝癌，具有廣闊的運用前景。
【專利說明】載鹽霉素膠束及其制備方法和應用
【技術領域】：
[0001] 本發明屬于醫藥【技術領域】，具體的說，涉及一種載鹽霉素膠束聯合穿膜肽CRGDK 靶向肝癌干細胞的藥物制劑，及其制備與應用。
【背景技術】：
[0002] 肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，由于其惡性程度高、病情進展快，加上早期無明 顯癥狀以致就診時肝臟已經受到嚴重損害，故治療難度大、療效差，病死率高，被稱"癌中之 王"。因此，肝癌的預防和治療成為我國醫藥研究的一項重要任務。
[0003] 由于肝癌發生時肝臟已經受到嚴重損害，因此導致具體治療選擇受到很大制約。 目前盡管生物治療與單一的手術治療、放療、化療相比取得了很大的進展，但手術切除和肝 癌移植仍是治療肝癌的主要方法。然而長期隨訪發現多數肝癌根治性切除手術后仍發生腫 瘤復發轉移，其術后一年的復發率達3至4成，是乳腺癌的4倍。此外，傳統的肝癌化療進 展不大，可能與多耐藥基因有關。常用化療藥物仍為順鉬、阿霉素或表阿霉素、絲裂霉素、 5_氟脲嘧啶或氟苷等。然而這些化療藥物不僅全身毒性嚴重，且通常也無明顯疾病緩解或 延命效果。目前的治療方法存在一個共同問題：這些療法中用于肝癌治療的一線藥物針對 的都是已分化的腫瘤細胞，可以在較短時間內殺滅這類細胞，使腫瘤體積減小甚至消失，然 而難以根除肝癌的復發，沒有從根源上對肝癌進行治療。因此肝癌迄今尚還處于一種嚴重 缺乏有效治療藥物的尷尬境地。
[0004] 隨著人們對肝癌醫學理論及臨床實踐的深入研究，特別是腫瘤分子生物學的 飛速發展，越來越多的證據證明，腫瘤組織中存在一小部分具有高度增殖能力與自我更 新能力的細胞群體，也具備多向分化的潛能。這類細胞被稱為腫瘤干細胞（tumor stem cell，TSC)。它的數目極其稀少，但成瘤能力較普通腫瘤細胞大數百倍以上，是腫瘤發生、發 展與維持的基礎。TSC可以長時間處于休眠狀態并具有多種耐藥分子而對殺傷腫瘤細胞的 外界理化因素不敏感，被認為是腫瘤治療失敗和腫瘤復發的主要原因之一。因此，靶向腫瘤 干細胞治療為從本質上根除腫瘤提供了一條新的途徑。
[0005] 鹽霉素是一種從白色鏈霉素的發酵液中分離提取得到的聚醚類離子載體型抗生 素。它廣泛應用于畜禽類動物雞球蟲病的防治，并且還能作為飼料添加劑以促進畜禽的生 長。自2009年Gupta發表在CELL的文章中指出他們用高通量的方法發現鹽霉素可以降低 腫瘤干細胞的比例，其效力是常用抗乳腺癌藥物紫杉醇的100倍后，鹽霉素開始成為一種新 型抗腫瘤藥物受到研究人員的廣泛關注（Gupta PB，0nder TT, Jiang G,等? Identification of selective inhibitors of cancer stem cells by high-throughput screening[J]. Cell, 2009, 138(4) :645?659.)。近些年關于鹽霉素對人腫瘤細胞和腫瘤干細胞的研究突 出表明了鹽霉素優于傳統化療藥，尤其是它可以通過一種或幾種藥物機制來誘導正常癌細 胞和進展非常緩慢的腫瘤細胞的凋亡，也可以改變腫瘤干細胞對放、化療的敏感性，或與其 他抗癌藥物聯用來誘導腫瘤干細胞分化為較成熟細胞，提高其對治療的敏感性。鹽霉素不 僅殺死了腫瘤干細胞，同時也消滅了正常腫瘤細胞和對細胞毒性藥物，放射物，促進細胞凋 亡藥物的抵抗性較強的高度休眠的腫瘤細胞。目前，鹽霉素被認為是三刃刀來對抗癌癥，為 臨床惡性腫瘤的治療提供了新的方向。
[0006] 然而高濃度的TSC存在于實體瘤中含氧量低以及壞死的部位，游離的抗腫瘤 藥物不僅對基體存在較大毒性，也很難在整個腫瘤中均勻分布來滲透致死濃度進入TSC 中。藥物靶向傳遞并不令人十分滿意，由于腫瘤血管結構紊亂以及腫瘤內部高的組織間 隙壓導致大多數靶向藥物傳遞系統只能滲透3-5個細胞直徑，并且主要沉積在周圍的腫 瘤血管中。因此需要一種載體能有效的包載游離藥物、高效滲透腫瘤內部并選擇性地殺 傷腫瘤細胞，減少非靶向器官的藥物積聚，降低對機體的毒副作用。文獻報道，一種新型 的線肽CRGDK(穿膜祀向肽，氨基酸序列為Cys-Arg-Gly-Asp-Lys)當結合或協同抗癌 藥物給藥時可以顯著提高抗癌藥物進入實體瘤的滲透性（Gill KK，Kaddoumi A，Nazzal S. Mixed micelles of DSPE_PEG2000and vitamin-E TPGS for concurrent delivery of paclitaxel and parthenolide:Enhanced chemosenstization and antitumor efficacy against non-small cell lung cancer(NSCLC)cell lines[J].Eur J Pharm Sci，2012, 46(1 - 2) :64 ?71.)。
[0007] 1, 2-distearoyl-sn-glycer〇-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy (polyethyle ne glyc0l)-2000] (DSPE-PEG2_)是兩親性分子共聚物，容易形成小粒徑膠束，并具有較低 的CMC值，現已被FDA批準用于臨床。由它制成的脂質膠束本身具有良好的生物相容性，可 以有效地增溶各種難溶性藥物，降低藥物的毒性。而且形成的小粒徑膠束（<30nm)不僅可 以逃避單核細胞吞噬作用，延長體內循環時間，增加藥物在實體瘤的蓄積，還具有腫瘤組織 高滲透能力，能有效地滲透入腫瘤組織內部，釋放藥物達到消滅腫瘤干細胞的致死濃度。
[0008] 目前也尚無文獻報道用DSPE-PEG2000-CRGDK共聚物為載體包載鹽霉素制備的膠 束來針對肝癌細胞和干細胞進行靶向給藥。
【發明內容】
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[0009] 本發明的目的是提供一種載鹽霉素具有高靶向性及滲透能力的小粒徑膠束及其 制備方法，本發明的另一個目的是提供該膠束在制備治療肝癌藥物中的應用。
[0010] 本發明人設想，選擇新型的抗腫瘤藥物鹽霉素，用合成的可生物可降解的 DSPE-PEG2000-CRGDK共聚物作為載體，包載抗腫瘤藥物鹽霉素，制備成粒徑小于30nm的膠 束，應該可以加強藥物對腫瘤的靶向性與滲透性，消滅肝癌細胞和干細胞。
[0011] 本發明的主要技術方案包括：
[0012] 一、DSPE-PEG2000-CRGDK 的合成：
[0013] 所述的DSPE-PEG2000-CRGDK的合成方法，是將穿膜靶向肽CRGDK的巰基（一SH) 與 DSPE-PEG2000-MAL(1，2-distearoyl-sn-glycer〇-3-phosphoeyhanolamine_N-[maleimi d(polyethy_len e glycol)-2000])中的馬來酰亞胺基團結合，形成接肽嵌段共聚物。
[0014] 本發明人在CRGDK:DSPE-PEG2000-MAL重量比1:1至1:10中進行摸索，發現1: 5w/ w時，反應更完全；另外，本發明還選擇了pH6. 5的4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES)緩沖溶 液，使反應更充分。
[0015] 二、載鹽霉素DSPE-PEG2000-CRGDK混合膠束的制備：
[0016] 技術關鍵在于，要尋找到最佳鹽霉素包封率，本發明人將鹽霉素與 DSPE-PEG2000-CRGDK載體質量比值進行了優化。優化方法為：取不同鹽霉素與載體質量比 例進行制備，1:5至1:15,測其包封率，得出鹽霉素與載體質量比為1:10時，制備的載藥膠 束鹽霉素包封率最佳。
[0017] 另外，本發明人還對水化的pH值進行優化，在pH 5. 0、pH7. 4、pH9. 0中進行篩選， 結果表明水化pH值在7. 4時，粒徑最理想，包封率最高。
[0018] 三、載藥膠束體外穿透肝癌干細胞能力的檢測；
[0019] 四、載藥膠束體外抗肝癌干細胞活性的檢測。
[0020] 本發明的第一方面，是提供了 一種載鹽霉素膠束，該膠束為：首先合成 DSPE-PEG2000-CRGDK共聚物作為載體，包載鹽霉素鈉，制備成粒徑小于30nm的膠束；
[0021] 所述的 CRGDK 和 DSPE-PEG2000 (DSPE-PEG2000-MAL)的重量比 1:5 ;
[0022] 所述的鹽霉素鈉與DSPE-PEG2000-CRGDK混合載體的質量比為1:10。
[0023] 本發明的第二方面，是提供了上述的載鹽霉素膠束的制備方法，該制備方法包括 以下步驟：
[0024] A. DSPE-PEG2000-CRGDK 的合成
[0025] DSPE-PEG2000-CRGDK 的合成，可參考文獻 Tuo Wei，Juan Liu，Huili Ma et al. Functionalized Nanscale Micelles Imprve Drug Delivery for Cancer Therapy in Vitro and in Vivo. Nano Lett. 2013, 13, 2528-2534〇
[0026]較優的，步驟 A 為 CRGDK 與 DSPE-PEG2000-MAL 以 1: 5w/w，溶解于 50mM 的 HEPES 緩 沖溶液中（pH 6. 5)，在室溫中持續攪拌48小時，混合物通過截留分子量1000的透析袋純 化；
[0027] B.載鹽霉素膠束的制備
[0028] 將步驟A制備的DSPE-PEG2000-CRGDK和DSPE-PEG2000溶解于氯仿中；另按混合 載體質量的〇. 1倍量取鹽霉素鈉，溶解于甲醇中；將兩種溶液混合，35°C下減壓旋轉蒸發4 小時除去有機溶劑，形成干燥薄膜；向旋轉蒸發瓶中加入PH7. 4的磷酸鹽緩沖液并充滿氮 氣，水化30min ;過50nm聚碳酸酯膜去除未包封的鹽霉素鈉。
[0029] 較優的，步驟B.載鹽霉素膠束的制備中，混合載體中DSPE-PEG2000-CRGDK和 DSPE-PEG2000是按l:4w/w比例溶解于氯仿中。
[0030] 本發明中，所用的DSPE-PEG2000及合成的DSPE-PEG2000-CRGDK屬于嵌段共聚物， 并且水性環境中可形成核-殼結構的球形膠束。
[0031]本發明中，DSPE-PEG2000-CRGDK 混合載體是指 DSPE-PEG2000-CRGDK 和 DSPE-PEG2000組成的載體，混合載體的量即為DSPE-PEG2000-CRGDK+DSPE-PEG2000的總 量。出于制劑成本的考慮，DSPE-PEG2000-CRGDK在混合載體中的比例為10 - 50%，較優為 20%。
[0032]本發明的第三方面，是提供了上述的載鹽霉素膠束在制備治療肝癌藥物中的應 用。
[0033] 所述的應用，是指上述的載鹽霉素膠束靶向已分化的肝癌干細胞。
[0034] 本發明的膠束體外高靶向性及滲透能力的檢測：
[0035] 本發明用流式細胞儀及激光共聚焦顯微鏡檢測肝癌細胞和肝癌干細胞中對含有 熒光物質膠束的攝取能力，來評價膠束體外靶向性及滲透能力。流式細胞儀對肝癌細胞和 干細胞內的熒光值進行定量分析，激光共聚焦顯微鏡對肝癌干細胞內熒光強弱進行定性分 析。結果表明肝癌干細胞對膠束的攝取能力明顯高于肝癌細胞。
[0036] 本發明的載鹽霉素膠束體外抗肝癌和肝癌干細胞活性：
[0037] 本發明采用CCK-8法測定細胞在經不同藥物濃度處理后細胞存活率，來評價藥物 和載藥納米粒的細胞毒性。細胞的生存曲線經對數模擬后，計算細胞的IC50來定量比較其 細胞毒性大小。結果顯示載鹽霉素膠束無論對肝癌細胞還是肝癌干細胞的殺傷能力都高于 游離鹽霉素且鹽霉素對肝癌干細胞的殺傷能力要高于肝癌細胞。
[0038] 因此，本發明的載鹽霉素膠束可達到同時靶向分化肝癌細胞和肝癌干細胞的作 用。這是肝癌治療的一種新策略，利用膠束載體的優勢，再聯合高滲透性靶向多肽CRGDK達 到靶向肝癌細胞和肝癌干細胞的效果，可以從其根源上治療肝癌，具有廣闊的運用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】：
[0039] 圖1為DSPE-PEG2000-CRGDK的嵌段共聚物的合成，
[0040] 其中 A 為 CRGDK 與 DSPE-PEG2000-MAL 的合成反應，B 為 MALDI-T0F-MS 檢測 DSPE-PEG2000-MAL 的分子量分布，C 為 MALDI-T0F-MS 檢測 DSPE-PEG2000-CRGDK 的分子量 分布；
[0041] 圖2為薄膜分散法制備DSPE-PEG2000-CRGDK混合膠束的反應流程；
[0042] 圖3為DSPE-PEG2000-CRGDK混合膠束的表征，
[0043] 其中A為膠束的水化粒徑分布圖，B為膠束的水化電位分布圖，C為膠束的透射電 鏡圖片；
[0044] 圖4為流式細胞儀檢測肝癌和肝癌干細胞對膠束的攝取能力，
[0045] 其中A為肝癌細胞對載熒光物質膠束攝取能力的對照組，B為肝癌細胞對載熒光 物質膠束攝取能力的實驗組，C為肝癌干細胞對載熒光物質膠束攝取能力的對照組，D為肝 癌干細胞對載熒光物質膠束攝取能力的實驗組；
[0046] 圖5為激光共聚焦檢測肝癌和肝癌干細胞對膠束的攝取能力，
[0047] 其中A為肝癌細胞攝取載熒光物質膠束（CFPE)，B為肝癌細胞攝取載熒光物質膠 束（Phase contrast)，C為肝癌干細胞攝取載熒光物質膠束（CFPE)，D為肝癌干細胞攝取載 突光物質膠束（Phase contrast);
[0048] 圖6為載鹽霉素膠束及游離鹽霉素對肝癌細胞和肝癌干細胞的半數抑制濃度 (IC50)。
【具體實施方式】：
[0049] 以下結合附圖和具體實施例，對本發明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用于 說明本發明而非用于限定本發明的范圍。
[0050] 材料和儀器：
[0051] 激光粒度測定儀，英國馬爾文儀器有限公司；
[0052] R系列旋轉蒸發器，上海申生科技有限公司；
[0053] CRGDK線肽，吉爾生化有限公司；
[0054] 1, 2-distearoyl-sn-glycer〇-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyeth ylene glycol)-2000](ammonium salt)(DSPE_mPEG2000)，Avanti Polar Lipids 公司； 1, 2-distearoyl-sn-glycer〇-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000](DSPE-mPEG2000_MAL)，Avanti Polar Lipids 公司；1,2-dioleoyl-sn-glyc ero-3-phosphoethanolamin-N-(carboxyf luorecein) (CFPE),Avanti Polar Lipids 公司；
[0055] 鹽霉素鈉，美國Sigma公司；
[0056] HPLC色譜純度 >93. 8 %;
[0057]透析袋（截留分子量1000)，上海綠鳥生物發展有限公司；
[0058]磷酸鹽緩沖液（PBS)，美國Hyclone公司；
[0059] 乙腈及四氫呋喃為色譜純，其他試劑均為分析純；
[0060]堿性成纖細胞生長因子（bFGF)，以色列prospec公司；
[0061]內皮生長因子（EGF)、胰島素，以色列prospec公司；
[0062] 胎牛血清、胰酶、青鏈雙抗、B27添加物，美國Gibico公司；
[0063] 其他化學試劑均購自上海國藥集團；
[0064]杜氏磷酸緩沖液（D-PBS)，美國Thermo公司；
[0065] 萬分之一電子天平AL104,梅特勒托利多公司；
[0066] 十萬分之一電子天平MS20OTU，梅特勒托利多公司；
[0067] 透射電子顯微鏡JEM2100F，日本JE0L公司；
[0068] Zetasizer nano ZS激光粒度分析儀，英國馬爾文公司；
[0069] 島津高效液相色譜儀LC-20A，日本島津公司。
[0070] 實施例1: DSPE-PEG2000-CRGDK的嵌段共聚物的合成
[0071]如圖 1A 所示，精密稱量 0? 3mgCRGDK 與 1. 5mg DSPE-PEG2000-MAL 溶解于 2ml 50mM 的HEPES緩沖溶液中（pH 6. 5)，在室溫中磁力攪拌48h，反應過程中CRGDK的巰基（一SH) 與DSPE-PEG2000-MAL中的馬來酰亞胺基團結合。反應結束后，將反應溶液裝入透析袋中 (Spectra/Por, MWC01000)，在去離子水中透析24小時，其中每12h更換一次透析液。
[0072] 透析結束將袋內溶液凍干待用。
[0073] 結果如圖1B所示，DSPE-PEG2000相對分子量集中在2800-3400,而圖1C DSPE-PEG2000-CRGDK則在3500-4000出現峰值，增加的分子量數值與CRGDK的分子量700 相符，結果表明CRGDK成功地連接到DSPE-PEG2000上。
[0074] 實施例2:鹽霉素鈉膠束的制備
[0075]如圖 2 所示，將 lmg DSPE-PEG2000-CRGDK 和 4mg DSPE-PEG2000 溶解于 3ml 氯仿 中，另取0. 5mg鹽霉素鈉溶解于lml甲醇中，將上述兩種溶液混合，35°C下減壓旋轉蒸發4h 除去有機溶劑，形成干燥薄膜。向瓶中加入2mL pH 7. 4的磷酸鹽緩沖液并充滿氮氣，水化 30min。過50nm聚碳酸酯膜去除未包封的鹽霉素鈉。
[0076] 通過薄膜分散法制備的膠束粒徑在13nm (圖3A)，zeta電位維持在_13mV左右（圖 3B)，透射電鏡（圖3C)表明本發明制備的DSPE-PEG2000-CRGDK混合膠束為球形，且具備典 型的核-殼結構。通過該實驗表明本發明制備的DSPE-PEG2000-CRGDK自組裝膠束具備明 確的微觀結構。
[0077] 實施例3:鹽霉素膠束制備工藝的優化
[0078](1)載體總量與鹽霉素鈉質量比的篩選
[0079]分別將（0? 5、1、1. 5)mg DSPE-PEG2000-CRGDK 和（2, 4, 6)mgDSPE-PEG2000 溶解于 3ml氯仿中，另取0.5mg鹽霉素溶解于lml甲醇中，（即載體總量與鹽霉素鈉質量比分別為 1:5, 1:10, 1:15)將上述兩種溶液混合，35°C下減壓旋轉蒸發4h除去有機溶劑，形成干燥薄 膜。向瓶中加入21111^117.4的磷酸鹽緩沖液并充滿氮氣，水化3〇1^11。過5〇11111聚碳酸酯膜 去除未包封的鹽霉素鈉。結果表明質量比為1:10時，膠束的包封率最高，詳見表1。
[0080] 表1 :載體總質量與鹽霉素鈉質量比對膠束的影響（n = 3)
[00811
【權利要求】
1. 一種載鹽霉素膠束，其特征在于，該膠束為： 以DSPE-PEG2000-CRGDK共聚物作為載體，包載鹽霉素鈉，粒徑小于30nm的膠束； 所述的CRGDK和DSPE-PEG2000的重量比1:5 ; 所述的鹽霉素鈉與DSPE-PEG2000-CRGDK混合載體的質量比為1:10。
2. -種如權利要求1所述的載鹽霉素膠束的制備方法，其特征在于，該制備方法包括 以下步驟： A. DSPE-PEG2000-CRGDK 的合成； B. 載鹽霉素|父束的制備 將步驟A制備的DSPE-PEG2000-CRGDK和DSPE-PEG2000溶解于氯仿中；另按混合載體 質量的〇. 1倍量取鹽霉素鈉，溶解于甲醇中；將兩種溶液混合，35°C下減壓旋轉蒸發4小時 除去有機溶劑，形成干燥薄膜；向旋轉蒸發瓶中加入PH7. 4的磷酸鹽緩沖液并充滿氮氣，水 化30min ;過50nm聚碳酸酯膜去除未包封的鹽霉素鈉。
3. 根據權利要求2所述的載鹽霉素膠束的制備方法，其特征在于，步驟 A. DSPE-PEG2000-CRGDK 的合成，為： CRGDK 與 DSPE-PEG2000-MAL 以 1: 5w/w，溶解于 50mM 的 p H6. 5 的 HEPES 緩沖溶液中， 在室溫中持續攪拌48小時，混合物通過截留分子量1000的透析袋純化。
4. 根據權利要求2所述的載鹽霉素膠束的制備方法，其特征在于，步驟B.載鹽霉素膠 束的制備中，混合載體中DSPE-PEG2000-CRGDK和DSPE-PEG2000是按1: 4w/w比例溶解于氯 仿中。
5. -種如權利要求1所述的載鹽霉素膠束在制備治療肝癌藥物中的應用。
6. 根據權利要求5所述的載鹽霉素膠束在制備治療肝癌藥物中的應用，其特征在于， 所述的應用是指所述的載鹽霉素膠束靶向已分化的肝癌干細胞。
【文檔編號】A61K9/51GK104257628SQ201410468789
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月15日 優先權日:2014年9月15日
【發明者】鐘延強, 毛驍麗, 張翮, 魯瑩, 鄒豪, 陳琰, 俞媛, 高靜, 劉俊杰, 孫治國, 解方圓, 鞏志榮, 何文婷, 張思悅, 陳大中 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學