miR-638在抗急性髓系白血病中的應用的制作方法

miR-638在抗急性髓系白血病中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種miR-638在抗急性髓系白血病中的應用，屬于分子生物學領域。實驗表明，在正常造血細胞分化發育和急性髓系白血病發生發展過程中，miR-638的表達水平存在明顯的變化；在白血病細胞系和原代急性髓系白血病細胞中miR-638表達水平的上調或下調，可以顯著促進或抑制細胞分化進程。本發明研究結果表明通過上調miR-638的表達能夠達到治療急性髓系白血病的目的。基于miR-638的功能其可用于制備抗急性髓系白血病藥物，其模擬物或表達載體也可用于制備抗急性髓系白血病藥物。本發明為開發新的抗急性髓系白血病的藥物或診斷試劑提供了重要的基礎。
【專利說明】mi R-638在抗急性髓系白血病中的應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學領域，涉及一種靈長類特異的非編碼微小RNA-- hsa-miR-638(以下稱為miR-638)在抗急性髓系白血病中的應用。

【背景技術】
[0002] 微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一類長約19?25個核苷酸（nt)的單鏈小分 子RNA，主要通過抑制蛋白翻譯或破壞靶基因轉錄本穩定性而調節轉錄后基因表達。1993 年，分別由兩個研究小組在線蟲中發現了第一種miRNA--lin-4,2001年將之正式命名為 microRNA。隨后大量的研究表明，miRNAs的生物學功能幾乎涉及到動植物生命活動的方方 面面，包括胚胎發育和腫瘤發生過程。胚胎發育是動植物從受精卵到成體的必經之路；腫 瘤，包括惡性血液疾病和實體瘤，是生長失控和分化異常的細胞群體，惡性腫瘤嚴重威脅著 人們的身心健康。越來越多的研究已經表明，早期胚胎發育與腫瘤發生發展的生物學行為 之間存在許多相似之處。這些研究為從發育生物學角度理解腫瘤的發生發展和為開發下一 代腫瘤診斷治療技術提供了新的科學思維方法。
[0003] 為了全面深入剖析人類早期胚胎發育過程中基因表達調控特點和尋找新的腫 瘤診斷和治療靶標， 申請人:和其他研究組曾利用CDNA表達文庫制備和篩選、大規模表達 譜芯片等方法對人胚早期發育4-9周（人胚大多數組織器官形成、分化和發育的關鍵時 期）的基因表達譜進行了分析，并且對篩選的相關性基因在惡性疾病中的生物學功能開 展了一系列研究。隨后還利用微流體miRNAs表達譜芯片分析鑒定了人胚發育4-6周中 miRNAs的表達特點：人類早期胚胎發育4-6周中大多數miRNAs的表達均很低，只有約5% 的miRNAs呈現高表達；并首次定義了 50種人胚特異高表達的miRNAs (HES-miRNAs)，包括 miR-638、miR-720 和 miR-1280 等（Characterization of MicroRNA Expression Profiles and the Discovery of Novel MicroRNAs Involved in Cancer during Human Embryonic Development. PLoS 0NE2013, 8(8):e69230)〇
[0004] 對大量的腫瘤樣本進行的miRNA芯片研究表明，幾乎所有的腫瘤中都出現了 miRNA的異常表達。異常表達miRNA對腫瘤發生的影響主要可以總結為以下幾個方面：（1) 異常表達的miRNA調控原癌基因或抑癌基因異常表達。比如，miR-155基因位于非編碼基 因 BIC的轉錄本中，而在各種淋巴瘤尤其是彌漫性大B細胞淋巴瘤中，這種非編碼RNA的表 達水平都顯著上升；miR-17-92基因簇位于一個在B細胞淋巴瘤病人中常見的基因擴增區 域內，故一般該簇表達的miRNA在這類淋巴瘤病人中異常高表達。在小鼠模型中，過表達 miR-17-92基因簇阻礙了細胞的凋亡并能促進由c-myc基因誘導的B細胞淋巴瘤的形成； 而c-myc基因本身也能轉錄調控miR-17-92基因簇及其該類miRNA的靶基因之一的細胞周 期正調控因子E2F1，形成對細胞生長增殖的嚴密調控。（2)異常表達的miRNA導致細胞周期 的異常。例如miR-221/222報道在許多腫瘤中都表達上調，功能研究表明它們能直接調控 p27kipl和p57kip2的表達，后者能通過與⑶K蛋白與周期蛋白復合體的結合抑制細胞Gl/ S期的轉換。（3)異常表達的miRNA影響腫瘤的發展和轉移。研究表明在高度轉移性的乳 腺癌和惡性肝癌細胞中抑制原癌性的miR-21的表達，能有效抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移， 而這一過程與其靶基因⑶4和maspin的相應表達上調有關。
[0005] miRNA在細胞調控網絡中發揮著平衡基因表達水平的作用，而腫瘤細胞中異常 表達的miRNA往往會打亂這種平衡，因而導致了腫瘤的發生發展。大量的芯片研究表明， miRNA可以用作區分不同腫瘤以及同一腫瘤類型中的不同亞型的分子標志物。人們通過對 334例不同腫瘤樣本的miRNA表達譜分析表明，miRNA的表達模式可以用于區分不同組織發 育起源的腫瘤。另外，Murakami和其合作者報道，miR-222、miR-106a和miR-17-92基因簇 的表達水平共同決定了肝細胞癌的分化程度，而miR-21的高表達與胰腺癌病人的低生存 率密切相關。
[0006] 鑒于miRNA在腫瘤發生發展過程中的重要作用，對miRNA表達水平的調控可以作 為腫瘤治療的一個有效手段。眾多的研究指出miRNA的異常表達與腫瘤的耐藥性密不可 分，故miRNA或miRNA的抑制劑能單獨用于或者輔助用于對那些已經產生抗藥性腫瘤的治 療。
[0007] 已經有許多研究組也對miRNA在小鼠和人造血系統中的表達模式進行了深入研 究。報道表明，miRNA作為一種小分子非編碼RNA幾乎在造血過程的每一個階段都發揮著 極其重要的調控作用。急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML)是由造血干細胞 異常導致的髓系前體細胞分化受阻，且過度增殖而形成造血異常的疾病。AML患者外周血和 骨髓中的髓系前體細胞分化受阻，并喪失了分化成正常髓系終末細胞的能力。有大約25? 30%的基因組突變能引發造血異常，比如t(15 ;17)、t(8 ;21)和inv(16)等。
[0008] 大量的研究表明，miRNA在腫瘤尤其是白血病的發生中也發揮著重要的功能。Mi 和其合作者首次研究了 AML患者中miRNA的表達譜（MicroRNA expression signatures accurately discriminate acute lymphoblastic leukemia from acute myeloid leukemia. Proc Natl Acad Sci USA104(50) :19971-19976)。他們采用 11 例急性淋巴細 胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL)病人，47例AML病人和7株相應的白血 病細胞系進行miRNA表達譜分析，結果發現有27個miRNA在兩種急性白血病中呈現差異 表達，其中miR-128a、miR-128b、let-7b及miR-223的表達出現顯著差異，并且運用其中的 2個miRNA作為指標就可以精確的區分急性髓系和淋巴系白血病，準確率達到了 97-98%。 Isken等分析了 50例AML病人和健康人樣本中154個miRNA的表達譜發現，miR-26a、 miR-26b和miR-29b的表達水平介于⑶34+細胞和正常的骨髓樣本之間，而AML病人中的 miR-23b、miR-34a和miR-221/miR-222基因簇的表達水平與正常骨髓樣本比較則出現了顯 著差異（Identification of acute myeloid leukaemia associated microRNA expression patterns, J Haematol 140 (2) :153-161)。而在一些腫瘤細胞中 miR-221/miR-222 基因 簇的高表達會抑制抑癌基因⑶KNlB的表達，進而促進細胞增殖。此外人們還發現miR-181a 在AML亞型FAB (French-American-British)M4型和M5型的表達水平遠低于Ml型和M2型， 提示miR-lSla可以作為區分急性髓系白血病亞型的指標。
[0009] 為了發掘針對AML這一疾病的miRNA診斷可能性，Wang等人分析了 10例AML (Ml 型到M5型）病人和6例健康人外周血單個核細胞中的miRNA表達譜。對照樣本相比，大量 的miRNA在總的AML樣本或不同亞型中出現了差異表達，其中miR-29a和miR-142-3p在 AML病例中顯著下調，且其表達水平能作為AML的診斷指標之一（miR-29a and miR-142-3p downregulation and diagnostic implication in human acute myeloid leukemia. Mol 81〇11?印39(3):2713-2722)。隨后，他們又詳細研究了11111?-293和11111?-142-3口是如何參與 調控AML疾病的發生的。功能研究顯示，過表達miR-29a或miR-142-3p都能促進誘導劑 誘導下的白血病細胞系的髓系分化，抑制其表達則相反。而且在原發性AML病人的CD34+ 細胞中重建這兩個miRNA的表達能促進其體外誘導的粒系和單核/巨噬系的分化。進一 步的實驗表明，miR-29a和miR-142-3p能同時調控CCNT2,進而阻礙磷酸化Rb蛋白的釋 放，細胞周期受阻，分化得以順利進行。此外miR-29a還能單獨調控⑶K6,而miR-142-3p 則能調控TAB2蛋白的表達，其中TAB2同時參與了粒系和單核巨噬系分化的調控。以上 結論表明miR-29a和miR-142-3p是髓系造血分化的關鍵調控因子，其表達異常與AML疾 病的發生密切相關（MicroRNA_29a and microRNA-142_3p are regulators of myeloid differentiation and acute myeloid leukemia. Bloodl19(21):4992-5004)〇
[0010] 最近，Marcucci等人研究了 60歲以下成年AML病人的miRNA表達譜，病人分為核 型正常或伴有FLT3-ITD(fms_related tyrosine kinase3gene)基因的內部串聯重復，或 二者兼有。其中有12個miRNA的表達與病人的臨床診斷相關，其中miR-181家族在高危 AML病人中顯著下調，而且其表達水平與toll樣受體和白介素10信號通路中相關蛋白的 水平變化高度相關（MicroRNA expression in cytogenetically normal acute myeloid leukemia. N Engl J Med358(18):1919-1928) 〇
[0011] 如上所述，miRNA在許多腫瘤包括白血病中都能扮演原癌基因或者抑癌基因的角 色。于是將miRNA作為疾病治療的作用靶標或者直接用于疾病治療就成為了可能。迄今， 研究的比較充分的是miRNA的抑制分子，比如用鎖核酸（locked nucleic acid, LNA)合 成的miRNA互補鏈抑制劑，用2-氧-甲基修飾的miRNA互補小RNA都被廣泛用于臨床研 究。2-氧-甲基修飾的miRNA互補RNA最早被用于在果蠅和線蟲體內直接沉默siRNA或者 miRNA。在一項基礎研究中發現，將miR-16、miR-122、miR-192和miR-194修飾后的抑制劑 直接注入小鼠體內，能有效的抑制這些miRNA在各個組織中的表達。另外，miR-122非常特 異的在肝組織中高表達，如果小鼠體內注入miR-122的拮抗劑（修飾后的抑制劑）能有效 的下調miR-122的表達，且持續時間能達到23天。其后的實驗表明miR-122調控膽固醇代 謝這一重要功能完全被拮抗劑所阻斷，顯示了 miRNA可以作為一種非常有前景的疾病治療 靶標。除了 miR-122,另外幾種miRNA也在小鼠中被沉默表達，比如在小鼠內皮細胞特異的 miR-126的表達能有效的被其抑制劑下調。
[0012] 迄今為止，世界范圍內首例把miRNA作為臨床治療革巴標的案例來自于miR-122。人 們研究了用LNA合成的miR-122抑制劑在抗HCV感染中的應用前景，并完成了在部分臨床 試驗。肝臟中高表達的miR-122通過與HCV基因組5'非編碼區的結合能增強HCV相關蛋 白的翻譯。另外，一種非常吸引人們注意的方式就是將miRNA和腫瘤的化療相結合，同時檢 測化療前后miRNA的表達譜變化來指導治療。一項對頭頸鱗狀細胞癌的研究發現，HMGA2表 達水平與該腫瘤對阿霉素的敏感性相關。HMGA2是非組蛋白染色體高遷移率蛋白家族成員， 其在低氧條件下表達下調，與之相應的是miR-98的上調，而在常氧條件下過表達miR-96能 下調HMGA2,并導致該類腫瘤細胞對于阿霉素敏感性的增加。
[0013] 除此之外，人們觀察到在一些腫瘤中miRNA基因被甲基化而沉默，是否可以將沉 默的miRNA激活作為疾病治療的靶標之一呢？比如，在ALL患者中，DNA甲基化導致部分 miRNA下調，而用5-硫唑嘌呤-2-脫氧胞苷處理就能激活這些沉默的miRNA。miRNA的甲基 化導致ALL病人miR-124表達下調，后者又可以下調控制ALL細胞生長增殖的蛋白⑶K6， 而擁有低水平miR-124的ALL病人疾病易復發且死亡率高。所以，甲基化的miRNA基因在 該類疾病的治療中可以作為一種非常有前景的靶標，或者將其作為疾病診斷非常有效的指 標。
[0014] 最后，miRNA還可以作為疾病預后的檢測指標。在CLL病人中，miR-29c和miR-223 在由A期向C期轉換，或者預后差的病人樣本中表達下調。因此，這些miRNA可以預測病人 的非治療生存率（treatment-free survival，TFS)和總體生存率（overall survival，OS)。 Stamatopoulos等人介紹了一個由miR_29c、miR-223、ZAP-70和LPL四個分子共同組成的 評分系統，以評價不同亞型的CLL病人預后情況。
[0015] 綜上所述，雖然還需要人們進行更系統的基礎研究和大量的臨床數據，但是將 miRNA用于多種重大惡性疾病的臨床診斷和治療，仍然具有非常光明的前景。


【發明內容】

[0016] 本發明的目的在于確定與人胚發育相關的、靈長類特異的非編碼小RNA miR-638 在髓系造血分化中的調控作用，以及miR-638與急性髓系白血病發生的關系，提供一種 miR-638在抗急性髓系白血病中的應用。
[0017] 本發明的目的通過下述技術方案實現：
[0018] 本發明確定了 miR-638在髓系造血分化中的調控作用，以及miR-638與急性髓系 白血病發生的關系，研究結果如下：
[0019] 1、miR-638在造血細胞不同分化發育階段以及造血細胞不同譜系間的表達、在白 血病細胞系和健康人外周血細胞之間的表達、以及在AML病人和健康人對照組的外周血單 個核細胞之間的表達，均具有顯著的差異性。
[0020] 2、miR-638在PMA誘導白血病細胞THP-I和HL-60向單核/巨噬細胞系分化過程 中、在ATRA誘導白血病細胞HL-60和NB4向粒細胞系分化過程中、以及在PMA和ATRA分別 誘導原發性AML患者外周血原始細胞（blasts)向單核/巨噬細胞系和粒細胞系分化過程 中，均表現為顯著的表達上調。
[0021] 3、miR-638在白血病細胞分化過程中的功能，即在白血病細胞THP-I和HL-60中 分別瞬時上調miR-638表達后，可以促進PMA誘導THP-I向單核/巨噬細胞系的分化過程、 以及促進ATRA誘導HL-60向粒細胞系的分化過程；反之，在白血病細胞THP-I和HL-60中 分別下調miR-638表達后，可以抑制PMA誘導THP-I向單核/巨噬細胞系的分化過程、以及 抑制ATRA誘導HL-60向粒細胞系的分化過程。
[0022] 4、miR-638在白血病細胞HL-60中瞬時過表達或穩定過表達后，可以顯著地抑制 細胞增殖和軟瓊脂克隆形成能力。
[0023] 5、miR-638在原發性AML患者外周血原始細胞中表達上調，可以顯著地促進誘導 劑PMA和ATRA誘導的細胞分化過程。
[0024] 本發明通過如下方法得出上述結果：
[0025] 通過商品化的設計引物（購自中國廣東廣州市銳博生物科技有限公司）檢測了 miR-638在正常造血細胞分化發育過程以及不同細胞譜系中的表達，也檢測了 miR-638在 白血病細胞在誘導劑誘導下向不同分化方向分化過程中的表達，以及在健康人和AML患者 中的表達，結果表明，miR-638的表達均有明顯變化或顯著差異，這些結果暗示miR-638可 能涉及到正常造血細胞發育過程和AML的發生發展過程。
[0026] 通過瞬時表達或穩定過表達手段，上調或下調白血病細胞和原代AML患者外周血 原始細胞中miR-638的表達，結果顯示，miR-638的表達變化顯著影響了白血病細胞和原代 AML患者外周血原始細胞的細胞分化進程,這些結果提示miR-638可能作為一種潛在的診 治靶標用于AML的防治作用。
[0027] 利用逆轉錄病毒載體MDH1-PGK-GFP2. 0 (該載體為一種常規商品化質粒載 體，詳見網站 http://www.addgene.org/11375/和引用文獻（MicroRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation. Science, 2004, 303(5654) :83_6)和對應的 感染人細胞系的輔助載體pCL-Eco (-種常規商品化質粒載體，詳見網站http://www. addgene. org/12371/)，以及從人基因組中克隆到的miR-638基因序列，構建了 miR-638的 逆轉錄病毒表達載體MDHl-miR-638,構建逆轉錄病毒表達載體MDHl-miR-638所用到的引 物分別為：
[0028] MDH1-638-FP : 5 ' -AATATCTCGAGCCCGGGAGCAACGGCTACAGA-3 '，
[0029] MDH1-638-RP :5' -GAGTTGAATTCAATTAATTTTTATGGACAGCCCGAAAGAG-3'。
[0030] 構建上述逆轉錄病毒表達載體MDHl-miR-638的方法，包括如下步驟：
[0031] l)miR-638基因片段擴增：利用上述設計的引物從人基因組序列中克隆得到 miR-638的表達基因片段；
[0032] 2)PCR產物凝膠電泳回收：參考武漢摩爾生物公司提供的試劑盒操作流程；
[0033] 3)PCR片段和載體的雙酶切、回收、連接及轉化：采用常規的分子生物學方法；
[0034] 4)陽性克隆的鑒定與測序：將篩選到的陽性克隆通過常規PCR和測序方法進行鑒 定。
[0035] 5)逆轉錄病毒包裝、病毒滴度的檢測及細胞感染：以MDH1-PGK-GFP2.0或 MDHl-miR-638和其輔助載體包裝形成逆轉錄病毒，用以感染HL-60細胞，以篩選穩轉細胞 系。
[0036] 上述逆轉錄病毒表達載體MDHl-miR-638構建成功后，將該載體和相應的對照載 體MDH1-PGK-GFP2. 0轉染白血病細胞HL-60,通過大量篩選和實驗驗證分析工作，篩選到 分別穩定表達相應載體及miR-638的HL-60亞細胞株：穩轉細胞HL-60-MDHl-Vector和 HL-60-MDHl-miR-638。將上述表達載體轉染白血病細胞或原代AML患者外周血原始細胞 中，用于miR-638基因的穩定過表達。
[0037] 利用商業化miR-638的模擬物和抑制劑可以在細胞中分別瞬時過表達miR-638和 抑制miR-638的表達；構建的逆轉錄病毒表達載體MDHl-miR-638具有在腫瘤細胞中特異性 高表達miR-638基因的能力，這為進一步研究miR-638基因的生物學功能提供更加可靠和 便捷的研究手段，同時為針對miR-638基因的相關基因治療藥物的開發提供了可能。
[0038] 上述結果表明miR-638在AML患者中的異常表達與白血病的發生間存在關聯，上 調miR-638表達能促進原始細胞在誘導劑作用下的單核/巨噬或粒系分化。而加快AML患 者外周血中的原始細胞的細胞分化進程，促進那些處于低分化或去分化狀態的惡性腫瘤細 胞向成熟細胞方向分化，重建正常血細胞表型，恢復正常造血功能，并最終促進惡性白血病 細胞凋亡和抑制增殖，從而達到治愈白血病的目的。即miR-638的表達能夠促進惡性白血 病細胞凋亡和抑制增殖，促進惡性腫瘤細胞向正常血細胞分化，恢復正常造血功能。
[0039] 上述結果表明，通過上調miR-638的表達能夠達到治療急性髓系白血病的目的； miR-638在髓系細胞中的表達量也能夠用于診斷髓系白血病的發生。
[0040] 基于上述結果,本發明提供的miR-638在抗急性髓系白血病中的應用如下：
[0041] miR-638在制備抗急性髓系白血病藥物中的應用。
[0042] miR-638的模擬物在制備抗急性髓系白血病藥物中的應用。
[0043] miR-638的表達載體在制備抗急性髓系白血病藥物中的應用。
[0044] 一種抗急性髓系白血病藥物，包含miR-638。
[0045] 一種抗急性髓系白血病藥物，包含miR-638的模擬物。
[0046] 一種抗急性髓系白血病藥物，包含miR-638的表達載體。
[0047] 所述的miR-638的表達載體可以為上述構建的逆轉錄病毒表達載體 MDHl-miR-638。
[0048] miR-638在制備急性髓系白血病的診斷試劑中的應用。
[0049] 本發明首次發現了 miR-638在髓系造血分化中的調控作用，以及miR-638與急性 髓系白血病發生的關系，即通過上調miR-638的表達能夠達到治療急性髓系白血病的目 的。根據miR-638功能，可將其應用于制備抗急性髓系白血病的藥物，為開發新的抗AML疾 病的藥物或診斷試劑提供了重要的基礎。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0050] 圖1實時熒光定量PCR檢測miR-638在人血液譜系特異性細胞中的相對表達情 況。
[0051] 圖2miR-638在白血病細胞和急性髓系白血病病人中的表達水平檢測。A、6例健康 人外周血MNC與白血病細胞系THP-I、HL-60、NB4和U937中miR-638表達水平比較，p〈0. 05 ; 每組實驗重復三次,結果顯示為"均值土SD" ;B、13例健康人與9例急性髓系白血病（AML) 病人外周血單個核細胞中miR-638表達水平比較，結果顯示為箱線圖。
[0052] 圖3瑞氏吉姆薩染色法分析THP-I和HL-60分別誘導向單核/巨噬系和粒系分化。 圖示誘導Oh和誘導24h、48h、72h和96h時細胞的形態變化，其中以誘導96h時間點用黑色 箭頭指示了典型的單核/巨噬系和粒系分化的細胞形態；圖片中細胞放大倍數為250倍。
[0053] 圖4miR_638在白血病細胞系體外誘導分化過程中表達上調。流式細胞術檢測髓 系分化指標（單核/巨噬細系：⑶14 ;粒系：⑶11b，A?D，右側）表達和實時定量PCR檢測 (A?D，左側）。每組實驗重復三次，miR-638表達柱狀圖結果顯示為"均值土SD"。）
[0054] 圖5miR_638在原發白血病細胞體外誘導分化過程中表達上調。每組實驗重復三 次，miR-638表達柱狀圖結果顯示為"均值土SD"。
[0055] 圖6半定量和實時熒光定量PCR檢測轉染后THP-I和HL-60細胞內miR-638表 達。A、B圖中表示模擬物對照；C、D圖中表示抑制劑對照，inh.表示抑制劑；每組實驗重復 三次，miR-638表達柱狀圖結果顯示為"均值土SD"。
[0056] 圖7流式分析和統計調節THP-I和HL-60細胞內miR-638表達對誘導髓系分化的 影響；圖示中流式檢測結果，每一小圖中"右邊的峰圖"表示細胞經對應的誘導劑誘導，"左 邊的峰圖"表示細胞經誘導劑對照（0. 1% DMSO)誘導。A、B圖中表示模擬物對照；C、D圖 中表示抑制劑對照，Inh.為抑制劑的縮寫。每組實驗重復三次，⑶14、⑶Ilb表達柱狀圖結 果顯示為"均值土SD"。）
[0057] 圖8瑞氏吉姆薩復合染色法檢測細胞形態學的變化。圖片中細胞放大倍數為250 倍，黑色箭頭指示為分化較為典型的細胞。
[0058] 圖9實時熒光定量PCR檢測模擬物轉染后誘導THP-I和HL-60細胞髓系特異基因 轉錄本的表達。miR-638表示miR-638模擬物。林，p〈0. 01 ;GAPDH為熒光定量的內參基因。
[0059] 圖10實時定量PCR檢測抑制劑轉染后誘導THP-I和HL-60細胞髓系特異基因轉 錄本的表達。miR-638(inh.)表示miR-638抑制劑。林，p〈0. 01;GAPDH為內參基因。每組 實驗重復三次，結果顯示為"均值土 SD"。
[0060] 圖11過表達miR-638影響HL-60細胞增殖。A、轉染miR-638模擬物（或對照） 后，HL-60生長曲線繪制（細胞計數）；B、轉染miR-638模擬物（或對照）并添加 PM誘導 劑后，HL-60生長曲線的繪制（CCK-8檢測）。圖中數據顯示為"均值土SD"。
[0061] 圖12miR-638穩轉細胞（HL-60)的構建。A、流式細胞術分析分選后病毒轉導陽性 細胞的比例；B、實時熒光定量PCR檢測穩轉細胞中miR-638表達水平。圖中數據顯示為"均 值土 SD"。
[0062] 圖13miR-638穩轉細胞（HL-60)增殖情況分析。A、B :誘導劑（PMA和ATRA)作用 下，穩轉細胞生長曲線繪制。圖中數據顯示為"均值土SD"。
[0063] 圖14miR-638抑制HL-60細胞的軟瓊脂克隆形成能力。A、miR-638 (或對照）穩 轉細胞在軟瓊脂中形成的克隆圖，每組設置兩組重復；B、對克隆數目進行統計分析，圖中數 據顯示為"均值土 SD"。#，p〈0. 01。
[0064] 圖15過表達miR-638促進原發性AML細胞在誘導劑作用下的髓系分化。A、實時 熒光定量PCR檢測轉染24h后細胞中miR-638的表達水平；B和C、流式細胞術分析誘導髓 系分化特異標志物⑶14和⑶Ilb的表達。

【具體實施方式】
[0065] 下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細的描述。應理解，這些實施例僅用于 說明本發明而不用于限制本發明的范圍。
[0066] 下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規實驗條件，如 Sambrook 等編，《分子克隆：實驗室手冊》（New York :Cold Spring Harbor laboratory Press，2002)中所述的實驗條件，或按照制造廠商所建議的實驗條件。
[0067] 實施例lmiR-638在不同來源血細胞中的表達調查
[0068] 為了探索miR-638是否涉及到正常造血過程和白血病發生發展過程，本實施例分 離并檢測了 miR-638在健康人外周血的髓系、淋巴系以及造血多能干細胞群落中的本底表 達水平；以及健康人對照外周血單個核細胞、多種白血病細胞系和AML患者外周血原始細 胞中的表達水平。
[0069] AML患者外周血和臍帶血取自武漢大學中南醫院、華中科技大學附屬同濟醫院和 江蘇省中醫院，每份樣本均得到患者知情同意以及相應的醫學倫理委員會批準。白血病細 胞系包括HL-60、THP-I、NB4細胞（均購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫），以 及U937細胞。
[0070] 從外周血樣本中分離單個核細胞（mononuclear cells, MNCs)的方法是采用密 度梯度離心法。其原理在于Ficoll-paque TM Plus分離液（美國GE Healthcare公司 產品）的密度為I. 〇77g/mL，MNCs的密度大約在1. 076?I. 090g/mL之間，而紅細胞密度 為I. 093g/mL，粒細胞密度為I. 092g/mL，它們密度都大于MNCs，所以用與MNCs密度相近的 Ficoll-paque TM Plus,再結合密度梯度離心可以分離得到比較純的單個核細胞。具體步 驟參照商品化試劑盒的詳細說明。
[0071] 一、miR-638在造血細胞不同分化發育階段以及造血細胞不同譜系間的表達調查
[0072] 使用加拿大StemCell公司的⑶34+分選試劑盒采用磁珠正向吸附法從單個核細 胞中分離純化CD34陽性細胞。其原理是：使用偶聯有抗CD34抗體的磁珠顆粒，結合強力磁 極將陽性細胞從細胞群體中分離出來。根據StemCell公司實驗手冊，所用起始MNCs來源 于臍帶血，因為其含有較高比例的CD34陽性細胞。具體步驟參照試劑盒的詳細說明。
[0073] 通過磁珠正向分離法在健康人臍帶血的單個核細胞中得到純度在90%以上的 CD34+細胞。將通過密度梯度離心的方法得到了健康人外周血中的單個核細胞（PBMC)采 用流式細胞術分選，得到了高純度的⑶14+和⑶Ilb+的髓系細胞亞群和⑶3 e +和⑶45R+ 的淋巴細胞亞群（流式細胞分析采用的熒光標記抗體：FITC-⑶lib、APC-⑶lib、PE-⑶14、 FITC-CD14、FITC-CD45R、PE-CD3 e 和 APC-CD34 均購自 Biolegend 公司）。實時熒光定量 PCR檢測miR-638 (miRNA 定量檢測試劑盒Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR Kit，包括miR-638 檢測引物和內參引物均購自廣州銳博生物科技公司）在這些細胞中的表達水平顯示（如圖 I) :(l)miR-638在髓系細胞發育過程中表達水平顯著上調（與⑶34+細胞相比，⑶Ilb+細 胞水平上調約10倍，而⑶14+細胞水平上調約30倍）；（2)與⑶34+細胞相比，miR-638在 淋巴細胞亞群中的表達水基本檢測不到。這些結果表明miR-638可能在正常的髓系造血分 化中發揮作用。
[0074] 二、miR-638在健康人外周血單個核細胞、白血病細胞系以及AML患者樣本中的表 達調查
[0075] 為了探索miR-638與白血病的相關性，本實施例檢測了 miR-638在白血病細胞中 的表達。實時熒光定量PCR結果顯示，與健康人的MNC比較，miR-638在4個被檢測的白血 病細胞系中的表達水平都比較低，與正常人PBMCs存在顯著差異（圖2A)。另外，本實施例 還檢測了從AML病人外周血分離獲得了單個核細胞miR-638的表達水平。類似的，miR-638 在AML白血病病人外周血細胞中表達水平顯著低于正常人（圖2B)。結合miR-638在正常髓 系細胞中的高表達，這些結果表明miR-638的表達失調可能與白血病發生發展過程相關。
[0076] 實施例2miR-638在白血病細胞和AML患者外周血原始細胞的誘導分化過程中的 表達變化分析
[0077] -、miR-638在白血病細胞誘導分化過程中的表達變化分析
[0078] 為了進一步驗證miR638與白血病發生發展的相關性，本實施例利用白血病細胞 體外分化的模型來分析miR-638的表達與白血病細胞分化的關系。HL-60和NB4細胞在全反 式維甲酸（ATRA)的處理下，可以向粒系成熟細胞分化；THP-I和HL-60細胞在佛波酯（PMA) 的誘導下，可以向單核細胞分化。通過瑞氏吉姆薩染色法觀察白血病細胞分化時的細胞形 態變化。圖3展示了 THP-I和HL-60分別在PM和ATRA的誘導下向單核細胞核和粒細胞 分化時的細胞形態變化，圖示中分化的單核細胞與未誘導細胞相比，細胞核明顯變小，核質 比也變小；分化成熟的粒系細胞不僅核質比變小，細胞核分成多個小葉。
[0079] 通過流式細胞術檢測了細胞分化的程度（如圖4)，表現為單核細胞特異性表面標 志物CD14和粒系細胞特異性表面標志物CDllb的峰隨著誘導時間增加而明顯向右偏移， 表明細胞逐漸分化成熟。隨后，通過實時熒光定量PCR對3種細胞系分別向2個方向誘導 分化過程中miR-638的表達水平進行了檢測。如圖4所示，無論是在單核細胞還是在粒細 胞分化成熟的過程中，miR-638的表達水平都是持續上調的，尤其是HL-60由PMA誘導的末 期（96h)，miR-638表達水平相比誘導前上調有約90倍之多。這些發現與之前分析得到的 miR-638在髓系血細胞中特異高表達的現象是吻合的，也進一步提示miR-638很可能參與 正常髓系造血過程，其異常表達可能參與髓系白血病的發生。
[0080] 二、miR-638在AML患者外周血原始細胞的誘導分化過程中的表達變化分析
[0081] 此外，本實施例也將從AML(FAB-M1型）病人外周血中分離得到的單個核細胞（含 大量髓系前體母細胞）進行體外誘導分化，并檢測了 miR-638的表達水平。如圖5所示，白 血病細胞經PMA誘導向單核細胞分化和ATRA誘導向粒系分化時，miR-638表達水平顯著上 調，而用對照（Vehicle，即0. 1 % DMSO溶液）試劑處理的細胞表達水平基本不變。該結果 與在白血病細胞系的誘導分化實驗結果一致。
[0082] 從正常的或異常的造血過程以及體外誘導分化等實驗結論可以得出miR-638很 可能是人髓系造血分化過程中一個重要的調控因子，其表達異常可能參與髓系白血病的發 生。
[0083] 實施例3miR_638在白血病細胞中的表達變化顯著影響細胞分化進程
[0084] 為了研究miR-638對髓系白血病細胞系體外誘導分化的影響，本實施例通過瞬 時轉染miRNA模擬物（mimics)和抑制劑（inhibitors)及其對照的方法，人為調節細胞 (THP-1 和 HL-60)內 miR-638 的表達水平。miRNA 模擬物（mimics)和抑制劑（inhibitors) 及各自對照均購自中國廣東廣州市銳博（Ribio)生物技術有限公司，模擬物序列與成熟 miR-638的序列完全一致，抑制劑序列與成熟miR-638的序列完全互補配對。通過使用 IfectRNA Plus轉染試劑（PharmInova公司產品）和BLOCK-iT熒光分子（FITC)標記寡核 苷酸（Invitrogen公司產品），初步觀察這些寡核苷酸的轉染效率均達到了 90%以上。
[0085] 通過半定量（所使用檢測miR-638和內參引物序列與實施例1所述的熒光定量 PCR引物序列一致）和熒光定量PCR的方法（所使用的方法與實施例1 一致）對轉染細胞 系中miR-638的表達水平進行了定性和定量的分析。如圖6所示，THP-I和HL-60細胞在轉 染miR-638mimics24h之后，細胞內miR-638表達水平得到了顯著的提高；而轉染miR-638 的抑制劑，其表達水平顯著降低。
[0086] 通過流式細胞術分析和統計了調節THP-I和HL-60細胞內miR-638表達對誘導髓 系分化的影響，結果見圖7。如圖7A所示，在THP-I細胞中，與轉染模擬物對照相比，PM誘 導72小時后，轉染miR-638mimic S的單核細胞特異表達的表面標志物⑶14的表達水平明 顯上調；模擬物對照組分化水平為23. 8 %，而過表達miR-638的實驗組細胞⑶14表達水平 為34.6%。圖7B左側對流式的三次重復實驗進行統計，發現二者之間存在顯著差異。相似 地，在HL-60細胞中，ATRA誘導向粒系分化時，過表達miR-638能顯著提高粒系特異表面標 志物⑶Ilb的表達，對照組分化水平為29. 4%，過表達miR-638則達到41. 4%。圖7B右側 對流式細胞分析的三次重復實驗進行統計，發現二者之間也存在顯著差異。
[0087] 同樣地，在轉染miRNA的抑制劑時（如圖7C)，THP-I由PM誘導的單核細胞分化被 顯著抑制，其分化比例由對照組的37. 6%下降到實驗組的27. 3%。相似的結果也在HL-60 由ATRA誘導向粒系分化時發現，抑制miR-638的表達水平后分化比例由對照組的30. 5% 下降到實驗組的18.3%。圖7D對抑制劑作用下的實驗結果進行了統計分析，結果表明在 THP-I和HL-60細胞中，抑制miR-638表達能顯著抑制誘導劑作用下的髓系分化表面標志物 的表達。
[0088] 同時通過瑞氏吉姆薩復合染色法對誘導分化末期的細胞進行了細胞形態學的觀 察，如圖8所示，染色后能清楚地顯示細胞核和細胞質的狀態。如圖8A未分化的THP-I細胞 (左上角）核質比較大,細胞核基本占據整個細胞,細胞質很少；而經過PM誘導細胞質比 例增加，細胞核明顯變小，此為分化的典型特征。與右上角轉染miRNA模擬物對照的THP-I 細胞相比，如黑色箭頭所示，過表達miR-638后更多比例的細胞呈現分化狀態。同樣地，如 圖8B，HL-60在未分化時，細胞核幾乎占據整個細胞；分化后細胞核出現小葉（箭頭所示） 或呈現馬蹄狀。與右上角轉染miRNA模擬物對照的HL-60細胞相比，過表達miR-638后更 多比例的細胞呈現分化狀態（右下角）。
[0089] 下調miR-638的結果與過表達恰好完全相反，抑制miR-638的表達顯著的抑制了 THP-I和HL-60在PMA或ATRA誘導劑作用下的髓系分化。結果如圖8C，與左上角轉染miRNA 模擬物對照的THP-I細胞相比，如黑色箭頭所示，抑制miR-638表達后的呈現單核系分化狀 態的細胞比例明顯降低；相似的在HL-60細胞中，抑制miR-638表達導致ATRA誘導的粒系 分化細胞比例比對照組更低（如圖8D)。
[0090] 此外，通過實時熒光定量PCR對誘導72小時后細胞內髓系特異性基因表達情況進 行了檢測（所使用的各對熒光定量PCR引物序列如表1所示，熒光定量PCR方法與實施例1 所述一致）。對髓系分化的兩個方向，分別選取了常見的幾個特異性基因作為分化指標，如 單核/巨噬系分化過程中⑶14、ITGAM(即⑶lib)和CSFlR表達水平明顯上調；而粒系分化 過程中，ITGAM和CSF3R的表達水平上調的同時MPO表達水平卻出現下調。MPO為髓系祖細 胞或前提細胞特異表達的基因，在向粒系分化時其表達水平會逐漸下調。如圖9A所示，與 轉染對照相比，在誘導劑PMA作用下，過表達miR-638能顯著提升⑶14、ITGAM和CSFlR三 個髓系特異性基因 mRNA的表達水平；相似的結果也在HL-60誘導向粒系分化時發現（如圖 9B)，與轉染對照相比，在誘導劑ATRA作用下，過表達miR-638顯著提升ITGAM和CSF3R的 表達水平。而MPO這一髓系前體細胞特異表達的基因，在miR-638過表達的細胞中下降的 水平比對照細胞更為明顯。
[0091] 表1實時熒光定量PCR引物列表
[0092]

【權利要求】
1. miR-638在制備抗急性髓系白血病藥物中的應用。 2. miR-638的模擬物在制備抗急性髓系白血病藥物中的應用。 3. miR-638的表達載體在制備抗急性髓系白血病藥物中的應用。
4. 一種抗急性髓系白血病藥物，其特征在于：包含miR-638。
5. -種抗急性髓系白血病藥物，其特征在于：包含miR-638的模擬物。
6. -種抗急性髓系白血病藥物，其特征在于：包含miR-638的表達載體。
7. 根據權利要求3所述的應用或權利要求6所述的藥物，其特征在于：所述的miR-638 的表達載體的骨架載體為MDH1-PGK-GFP 2.0。 8. miR-638在制備急性髓系白血病的診斷試劑中的應用。
【文檔編號】A61P35/02GK104208723SQ201410466367
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月12日 優先權日:2014年9月12日
【發明者】李文鑫, 郭明雄, 黃贊, 林義 申請人:武漢大學