一種苦菜總黃酮的提取方法及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種苦菜總黃酮的提取方法及其應(yīng)用，具體涉及一種利用超聲波輔助醇提的方法。其處理步驟：將新鮮的野生苦菜烘干→用粉碎機(jī)粉碎→超聲波提取→合并濾液→減壓濃縮→萃取→干燥。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，提取效率高，節(jié)約能源，成本低、適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明所述的苦菜總黃酮提取物尤其適合在制備抗腫瘤產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述的產(chǎn)品包括藥品、保健品、食品。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種苦菜總黃酮的提取方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種天然藥用植物中活性成分的提取技術(shù)，特別是涉及一種利用超聲波輔助醇提提取天然植物中有效成分的方法，以及所得苦菜總黃酮在制備抗腫瘤產(chǎn)品中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥是一大類(lèi)惡性腫瘤的統(tǒng)稱(chēng)。癌細(xì)胞的特點(diǎn)是無(wú)限制、無(wú)止境地增生，使患者體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被大量消耗；癌細(xì)胞釋放出多種毒素，使人體產(chǎn)生一系列癥狀；癌細(xì)胞還可轉(zhuǎn)移到全身各處生長(zhǎng)繁殖，導(dǎo)致人體消瘦、無(wú)力、貧血、食欲不振、發(fā)熱以及嚴(yán)重的臟器功能受損等等。與之相對(duì)的有良性腫瘤，良性腫瘤則容易清除干凈，一般不轉(zhuǎn)移、不復(fù)發(fā)，對(duì)器官、組織只有擠壓和阻塞作用，但癌癥(惡性腫瘤)還可破壞組織、器官的結(jié)構(gòu)和功能，引起壞死出血合并感染，患者最終由于器官功能衰竭而死亡。到了科學(xué)高速發(fā)展的今天，我們有理由相信癌癥并非不治之癥。致力于自然醫(yī)學(xué)研究的醫(yī)學(xué)專(zhuān)家們研究發(fā)現(xiàn):負(fù)離子對(duì)抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移有令人鼓舞的效果，重要的是利用自然因子負(fù)離子對(duì)癌癥患者治療對(duì)機(jī)體無(wú)任何損害，沒(méi)有任何毒副作用。
[0003]癌癥嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的生命，是當(dāng)今世界上大多數(shù)國(guó)家的主要死因之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全世界每年死于癌癥的患者約500萬(wàn)，因此癌癥的治療和預(yù)防任務(wù)十分艱巨。
[0004]生物總黃酮是指黃酮類(lèi)化合物，是一大類(lèi)天然產(chǎn)物，廣泛存在于植物界，是許多中草藥的有效成分。在自然界中最常見(jiàn)的是黃酮和黃酮醇，其它包括雙氫黃(醇)、異黃酮、雙黃酮、黃烷醇、查爾酮、橙酮、花色苷及新黃酮類(lèi)等。
[0005]近年來(lái)，由于自由基生命科學(xué)的進(jìn)展，使具有很強(qiáng)的抗氧化和消除自由基作用的類(lèi)黃酮受到空前的重視。類(lèi)黃酮參與了磷酸與花生四烯酸的代謝、蛋白質(zhì)的磷酸化、鈣離子的轉(zhuǎn)移、自由基的清除、抗氧化活力的增強(qiáng)、氧化還原作用、螯合作用和基因的表達(dá)。它們對(duì)健康的好處有:(1)抗炎癥(2)抗過(guò)敏(3)抑制細(xì)菌(4)抑制寄生蟲(chóng)(5)抑制病毒
[6]防治肝病(7)防治血管疾病(8)防治血管栓塞(9)防治心與腦血管疾病(10)抗腫瘤
(11)抗化學(xué)毒物等。天然來(lái)源的生物黃酮分子量小，能被人體迅速吸收，能通過(guò)血腦屏障，能時(shí)入脂肪組織，進(jìn)而體現(xiàn)出如下功能:消除疲勞、保護(hù)血管、防動(dòng)脈硬化、擴(kuò)張毛細(xì)血管、疏通微循環(huán)、活化大腦及其他臟器細(xì)胞的功能、抗脂肪氧化、抗衰老。
[0006]苦菜是菊科的一年生的或兩年生的草本植物，別名山苦菜。主要分布在分布于中國(guó)北部、東部和南部等地區(qū)，生長(zhǎng)于山地草坡，路邊以及田野里，取材范圍很廣?？嗖?，味:辛、苦，性寒。功效:清熱解毒，涼血，祛瘀止痛，可以用來(lái)治療腸癰、肺癰高熱、咳吐膿血、熱毒瘡疔、瘡癤痛腫、胸腹疼痛、闌尾炎、腸炎、痢疾、產(chǎn)后腹痛、痛經(jīng)等。本實(shí)驗(yàn)發(fā)明采用的是液-液-液三相萃取，由于生物體系的組分特性以及產(chǎn)物的不穩(wěn)定性，使得在生物體系中使用傳統(tǒng)的液-液萃取過(guò)程存在很多不足之處，如選擇性差、步驟繁多、產(chǎn)品活性損失過(guò)大。由于液-液-液三相萃取體系可在一定程度上改善萃取效果，彌補(bǔ)液-液兩相萃取的不足。并且現(xiàn)在目前傳統(tǒng)植物提取方法設(shè)備昂貴，提取天然植物有效成分效率低，污染大，成本高，提取過(guò)程較復(fù)雜，使得天然藥用植物的價(jià)值得不到很好的利用。
[0007]苦菜在人類(lèi)生活中的應(yīng)用并不是很廣泛，尤其在在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用更是很少見(jiàn)報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]為了擴(kuò)大苦菜的應(yīng)用范圍，擴(kuò)大抗腫瘤產(chǎn)品的應(yīng)用品種，本發(fā)明特別提供了一種苦菜總黃酮的提取方法和其在抗腫瘤產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0009]為實(shí)現(xiàn)上述目的，苦菜總黃酮的提取方法采用如下制作步驟:
O以新鮮的野生苦菜為原料，清洗干凈，烘干，用粉碎機(jī)粉碎；
2)稱(chēng)取一定量苦菜粉末于提取器中，向提取器中加入料液比為1:1-10、50%-70%的乙醇溶液，超聲提取時(shí)間為5(T90min，提取溫度為6(T75°C，超聲波提取頻率為20_80KHz ；
3)冷卻抽濾，濾渣利用超聲提取2次，合并三次濾液后，將其減壓濃縮，減壓濃縮至原體積的1/3-1/2，然后轉(zhuǎn)至分液漏斗中用石油醚和乙酸乙酯的混合物進(jìn)行萃取，取下層，回收試劑，冷凍干燥得到苦菜總黃酮。
[0010]步驟2)中所述的濃縮液、石油醚、乙酸乙酯體積比為1:2-5:2_6。
[0011]本發(fā)明的目的在于提供一種苦菜總黃酮在抗腫瘤方面的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明制備的提取物在抗腫瘤作用上的藥理活性通過(guò)以下藥理實(shí)驗(yàn)證明。
[0013]選用人肝癌(H22)或人大腸癌(HT-29)或艾氏腹水瘤(EAC)細(xì)胞系對(duì)數(shù)期細(xì)胞，用0.5%的胰蛋白酶分解細(xì)胞后，用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中配成單個(gè)細(xì)胞懸浮液，接種到96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μ L，置37°C，5%C02的條件下培養(yǎng)24小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。(2)設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組換新的含不同濃度苦菜總黃酮培養(yǎng)基(苦菜總黃酮提取物的濃度為1.82,0.96,0.51,0.08,0.0020mg/ml)，對(duì)照組則換含等體積溶劑的培養(yǎng)基，每組設(shè)3組平行孔，置37°C，5%C02的條件下培養(yǎng)2?4天，離心(1000轉(zhuǎn)，5min),棄去上清液。
(3)每孔加入100 μ L新鮮配置的含0.15mg/ml MTT的無(wú)血清培養(yǎng)基。37°C繼續(xù)培養(yǎng)3h。小心棄去上清液，并加入200 μ LDMS0，用微型超聲振蕩器混勻后，在酶標(biāo)儀上以實(shí)驗(yàn)波長(zhǎng)為570nm測(cè)定光密度值。并計(jì)算不同藥劑量對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率。結(jié)果見(jiàn)表I。
[0014]腫瘤細(xì)胞抑制率=(1-OD實(shí)驗(yàn)/OD對(duì)照)*100%
表I
苦荽總黃Si的濃度 _編邋CH33) 人大麗埔編邋犮氏應(yīng)水?huà)骄庡? CMgtel)抻制聿(K)arr-29)押幸(K) (EAC)抑胡聿(1K)
1Λ267J0370.0369_56
0_9672*574J257134
0:5170.4169J23703t
OJOt40J2345j6350J3S
0002010.7515J231712
以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明苦菜總黃酮對(duì)人肝癌(H22)、人大腸癌(HT-29)、艾氏腹水瘤(EAC)細(xì)胞具有明顯的抑制作用。
[0015]本發(fā)明所制備的苦菜總黃酮提取物與一種或多種藥學(xué)上可接受的固體或液體賦形劑或輔劑結(jié)合，制成適合人或動(dòng)物適合的劑型。
[0016]下面將結(jié)合【具體實(shí)施方式】進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于下列實(shí)施方式。
[0017]【具體實(shí)施方式】:
實(shí)施例1:
苦菜總黃酮的提取方法
以新鮮野生苦菜為原料，清洗干凈，烘干，將其粉碎，取2kg苦菜粉末置于提取設(shè)備中，并加入料液比為1:1、50%的乙醇，超聲提取時(shí)間為50min，提取溫度為60°C，超聲波提取功率為20KHz，冷卻抽濾，濾渣超聲提取2次，合并3次濾液，減壓濃縮至原體積的1/3，并將其移至分液漏斗中，加入濃縮液、石油醚、乙酸乙酯體積比為1:2:2進(jìn)行萃取，取下層，回收試齊U，冷凍干燥得到苦菜總黃酮。經(jīng)UV檢測(cè)，得到提取物中總黃酮的含量為75.05%。
[0018]實(shí)施例2:
苦菜總黃酮的提取方法
以新鮮野生苦菜為原料，清洗干凈，烘干，將其粉碎，取2kg苦菜粉末置于提取設(shè)備中，并加入料液比為1:5、65%的乙醇，超聲提取時(shí)間為70min，提取溫度為70°C，超聲波提取功率為65KHz，冷卻抽濾，濾渣超聲提取2次，合并3次濾液，減壓濃縮至原體積的1/3，并將其移至分液漏斗中，加入濃縮液、石油醚、乙酸乙酯體積比為1:3:3進(jìn)行萃取，取下層，回收試齊U，冷凍干燥得到苦菜總黃酮。經(jīng)UV檢測(cè)，得到提取物中總黃酮的含量為75.05%。
[0019]實(shí)施例3:
苦菜總黃酮的提取方法
以新鮮野生苦菜為原料，清洗干凈，烘干，將其粉碎，取2kg苦菜粉末置于提取設(shè)備中，并加入料液比為1:10、70%的乙醇，超聲提取時(shí)間為90min，提取溫度為75°C，超聲波提取功率為80KHz，冷卻抽濾，濾渣超聲提取2次，合并3次濾液，減壓濃縮至原體積的1/2，并將其移至分液漏斗中，加入濃縮液、石油醚、乙酸乙酯體積比為1:5:6進(jìn)行萃取，取下層，回收試齊U，冷凍干燥得到苦菜總黃酮。經(jīng)UV檢測(cè)，得到提取物中總黃酮的含量為75.05%。
[0020]實(shí)施例4:
苦菜總黃酮制成注射劑
在實(shí)施例1、2、3中制得的苦菜總黃酮活性成分中加入乙醇或它們的混合物作為溶劑，并加入泊洛沙姆作為增溶劑，醋酸鹽作為PH調(diào)劑劑，氯化鈉作為滲透壓調(diào)節(jié)劑即可制成注射劑。
[0021]實(shí)施例5:
苦菜總黃酮制成片劑
在實(shí)施例1、2、3中制得的苦菜總黃酮總加入淀粉、蜂蜜、乙醇、干淀粉、滑石粉、聚乙二醇即可制成片劑。
【權(quán)利要求】
1.一種苦菜總黃酮的提取方法，其特征在于:以新鮮野生苦菜為原料，清洗干凈，烘干，用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)2(Γ60目篩，將苦菜粉末放于提取裝置中，然后按照一定的料液比加入乙醇溶液，超聲提??；冷卻抽濾，濾渣重復(fù)提取2次；合并三次濾液后，減壓濃縮至原體積的1/3-1/2，濃縮液轉(zhuǎn)至分液漏斗中用石油醚和乙酸乙酯的混合溶劑進(jìn)行萃取，取下層，回收試劑，冷凍干燥得到苦菜總黃酮。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種苦菜總黃酮的提取方法，其特征在于:所述的料液比為1:1-10。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種苦菜總黃酮的提取方法，其特征在于:所述的乙醇濃度為50%-70%，超聲提取時(shí)間為50-90min，提取溫度為60_75°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種苦菜總黃酮的提取方法，其特征在于:所述的超聲波提取頻率為20-80KHz。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種苦菜總黃酮的提取方法，其特征在于:所述的濃縮液、石油醚、乙酸乙酯體積比為1:2-5:2-6。
6.根據(jù)權(quán)利要求Γ5所述方法制備的苦菜總黃酮提取物在制備抗腫瘤產(chǎn)品中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗腫瘤產(chǎn)品包括藥品、保健品、食品。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK104173403SQ201410445547
【公開(kāi)日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2014年9月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月4日
【發(fā)明者】張金芳, 楊存 申請(qǐng)人:南京標(biāo)科生物科技有限公司