RNAi干擾片段、干擾載體、制備方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種用于干擾動物睪丸生精細胞中Zfx基因的RNAi干擾片段及RNAi干擾載體。RNAi干擾載體具有所述RNAi干擾片段，所述RNAi干擾片段包含下列序列：TGAGG CAGAT GTATC TGAAA TTCAA GAGATTTCAG ATACA TCTGC CTCTT TTTTC或TGCAG AGAAG GCCATTGAAT TTCAA GAGAA TTCAA TGGCC TTCTC TGCTT TTTTC。本發明提供的RNAi干擾片段及RNAi干擾載體通過對豬睪丸細胞中Zfx基因進行干擾，使得Zfx基因表達下降，間接影響X精子的受精能力，從而達到控制豬后代性別的目的。
【專利說明】RNAi干擾片段、干擾載體、制備方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，具體涉及一種用于控制動物性別的RNAi干擾片段、 RNAi干擾載體、及RNAi干擾載體的制備方法及其應用。
【背景技術】
[0002] 動物性別控制的目的在于在動物出生前即通過人工方法控制其性別。實現動物的 性別控制，有重要意義，主要體現在：（1)能及時淘汰或終止不需要性別的動物，提高畜牧 業生產效益（奶牛、奶山羊、蛋雞雌性后代價值高，雄性價值低；肉牛、肉豬、肉雞雄性生長 速度快）；（2)在轉基因動物生產中，提高所需性別動物的利用價值（雌性動物利用價值高， 雄性動物利用價值低）；(3)通過增加希望的性別動物的比例，提高育種強度；(4)避免胚胎 移植異性胚胎導致的孿生不育等。
[0003] 對動物性別控制的相關研究早在多年前就已經開始。目前國內外動物進行性別控 制的方法主要有三種：（1) X精子與Y精子的分離，即通過X、Y精子微弱的生物學差異，分離 出含兩種不同染色體的精子。主要采用物理分離法，如采用流式細胞分離儀分離精子的準 確率可達到90%。（2)胚胎的性別鑒定，即通過鑒定胚胎的性別，從而影響出生的性別比 例。早期胚胎性別鑒定方法主要有細胞學方法、免疫性方法、分子生物學方法、雄性特異性 DNA探針法等。（3)控制動物受精的外部環境，動物受精時外部環境中的某些因素也是性別 決定機制的重要條件，主要包括營養、溫度、體液酸堿度、輸精時間、年齡胎次、激素水平等。 但這些方法都存在一些缺點，限制了實際的應用。例如，Χ、Υ精子分離的速度太慢，精液價 格昂貴且不耐冷凍，致使后代畸形率較高。進行胚胎性別鑒定時，從胚胎上切取部分細胞， 而后經冷凍、解凍會對胚胎造成一定的損害，使胚胎移植的成功率下降，同時劣質胚胎的性 別鑒定成功率更低，制約了提供預知性別動物胚胎的商業化進程。在控制動物受精的外部 環境中，由于影響動物性別決定機制的外部環境有很多因素，調控單一因素無法有效影響 性別，同時調控多種因素在實際中很難達到多種因素的最佳狀態，且調控這些因素的效果 還與動物的體質有關，因此控制性別的效果不甚明顯。
[0004] 如今，隨著科學技術水平的發展，從基因水平著手對性別控制進行研究已經成為 一種新的方向，同時隨著基因技術的日趨成熟，基因技術的成本將大幅下降，使其在生產應 用中大規模推廣成為了一種可能。
【發明內容】
[0005] 有鑒于此，本發明實施例提供一種RNAi干擾片段、干擾載體、制備方法及應用。主 要目的是通過RNAi干擾載體對動物X染色體上的Zfx基因進行干擾，使得Zfx基因表達下 降，以此達到人為控制動物性別的目的。
[0006] 為達到上述目的，本發明主要提供如下技術方案：
[0007] -方面，本發明實施例提供了一種RNAi干擾片段，用于干擾動物X染色體上的 Zfx基因，所述RNAi干擾片段包含下列任一序列：TGAGGCAGAT GTATC TGAAA TTCAA GAGAT TTCAG ATACA TCTGC CTCTTTTTTC 或 TGCAG AGAAG GCCAT TGAAT TTCAA GAGAA TTCAATGGCC TTCTC TGCTT TTTTC ；
[0008] 所述Zfx基因負責編碼一個大的酸性鏈鋅指蛋白上12-13個轉錄因子，具有特定 的核定位信號區域和DNA結合位點，能夠特異性地與靶基因結合，定向引導靶基因穿過核 膜，定位于精子細胞核內，其編碼的蛋白作為轉錄調控因子，與X精子的發育相關。
[0009] 進一步地，所述RNAi干擾片段作為制備控制動物性別的藥物、試劑盒的應用。
[0010] 本發明實施例還提供一種RNAi干擾載體，用于干擾動物X染色體上的Zfx基因， 所述RNAi干擾載體具有RNAi干擾片段；
[0011] 所述 RNAi 干擾片段包含有以下序列：TGAGG CAGAT GTATC TGAAATTCAA GAGAT TTCAG ATACA TCTGC CTCTT TTTTC 或TGCAGAGAAG GCCAT TGAAT TTCAA GAGAA TTCAA TGGCC TTCTC TGCTTTTTTC〇
[0012] 進一步地，所述RNAi干擾載體包括pLentiLox3. 7載體，所述pLentiLox3. 7載體 與所述RNAi干擾片段連接。
[0013] 進一步地，所述RNAi干擾載體在動物受精前進行性別控制中應用。
[0014] 進一步地，所述RNAi干擾載體以睪丸直接注射的方式注射至動物體內，用于干擾 動物X染色體上的Zfx基因。
[0015] 另一方面，本發明實施例還提供一種RNAi干擾載體的制備方法，所述制備方法包 括如下步驟：
[0016] 酶切所述 pLentiLox3. 7 載體；
[0017] 將所述RNAi干擾片段與酶切后的所述pLentiL〇X3. 7載體連接，得到連接產物；
[0018] 其中，所述RNAi干擾片段包含以下序列：TGAGG CAGAT GTATCTGAAA TTCAA GAGAT TTCAG ATACA TCTGC CTCTT TTTTC 或 TGCAG AGAAG GCCAT TGAAT TTCM GAGM TTCM TGGCC TTCTCTGCTT TTTTC ；
[0019] 將所述連接產物轉化至感受態細胞中，并篩選出陽性克隆菌液；
[0020] 對陽性克隆菌液進行測序鑒定，并將測序結果與所述RNAi干擾片段序列完全一 致的菌液進行擴增；
[0021] 從所述擴增的菌液中提取RNAi干擾載體。
[0022] 進一步地，所述的將所述連接產物轉化至感受態細胞中，并篩選出陽性克隆菌液， 具體為：將所述連接產物轉化至感受態細胞中，并采用氨芐（AMP+)抗性篩選和藍白斑篩選， 篩選出陽性克隆菌液。
[0023] 進一步地，所述的從所述擴增的菌液中提取RNAi干擾載體，具體為：采用質粒提 取試劑盒進行提取或采用SDS堿裂解法進行提取。
[0024] 借由上述技術方案，本發明至少具有下列優點：
[0025] 本發明實施例提供的RNAi干擾片段以及RNAi干擾載體可以對動物X染色體上的 Zfx基因進行干擾，使得Zfx基因表達下降，間接影響X染色體的發育，以此達到人為控制動 物性別的目的。另外，本發明實施例以睪丸直接注射的方式注射至動物睪丸，不會對動物的 健康和睪丸功能產生影響，而且操作方便、快捷，成本低廉。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0026] 圖1示出了 pLentiLox3. 7載體的結構示意圖；
[0027] 圖2示出了兩種干擾載體的干擾組和對照組中仔豬睪丸生精細胞Zfx基因的mRNA 表達量的示意圖；
[0028] 圖3示出了干擾片段和pLentiL〇x3. 7載體連接形成干擾載體的示意圖。
【具體實施方式】
[0029] 為更進一步闡述本發明為達成預定發明目的所采用的技術手段及功效，結合較佳 實施例詳細說明如下。
[0030] 實施例1
[0031] 設計并合成用于干擾動物睪丸生精細胞中的Zfx基因的RNAi干擾片段。下面本 實施例以豬睪丸生精細胞中的Zfx基因的RNAi干擾片段為例，對本發明提供的技術方案進 行說明。具體如下：
[0032] 根據豬Zfx基因的mRNA序列（GenBank:KF803247)設計并篩選出兩個siRNA片 段，然后按照所述pLentiL 〇X3. 7載體及所帶啟動子的要求，在兩個siRNA片段序列兩端添 加酶切位點、loop環及終止序列，最終形式為胸腺嘧啶（T)+正義鏈19nt靶序列+莖環結 構（TTCAAGAGA) +靶序列反向互補序列+RNAPolyIII聚合酶轉錄終止位點（TTTTTT)+XhoI 酶切位點（GAGCT)，合成兩對shRNAi的寡聚核苷酸序列。該兩對shRNAi干擾片段分別為 shRNAl和shRNA2,如表1所示。
[0033] 表 1
[0034]
【權利要求】
1. 一種RNAi干擾片段，用于干擾動物X染色體上的Zfx基因，其特征在于，所述RNAi 干擾片段包含下列任一序列：TGAGG CAGAT GTATCTGAAA TTCAA GAGAT TTCAG ATACA TCTGC CTCTT TTTTC 或 TGCAG AGAAG GCCAT TGAAT TTCAA GAGM TTCM TGGCC TTCTCTGCTT TTTTC; 所述Zfx基因負責編碼一個大的酸性鏈鋅指蛋白上12-13個轉錄因子，具有特定的核 定位信號區域和DNA結合位點，能夠特異性的與靶基因結合，定向引導靶基因穿過核膜，定 位于精子細胞核內，其編碼的蛋白作為轉錄調控因子，與X精子的發育相關。
2. 權利要求1所述的RNAi干擾片段作為制備控制動物性別的藥物、試劑盒的應用。
3. -種RNAi干擾載體，用于干擾動物X染色體上的Zfx基因，其特征在于，所述RNAi 干擾載體具有RNAi干擾片段； 所述 RNAi 干擾片段包含以下序列：TGAGG CAGAT GTATC TGAAATTCAA GAGAT TTCAG ATACA TCTGC CTCTT TTTTC 或TGCAGAGAAG GCCAT TGAAT TTCAA GAGAA TTCAA TGGCC TTCTC TGCTTTTTTC〇
4. 根據權利要求3所述的RNAi干擾載體，其特征在于，所述RNAi干擾載體包括 pLentiLox3. 7載體，所述pLentiLox3. 7載體與所述RNAi干擾片段連接。
5. 根據權利要求4所述的RNAi干擾載體，其特征在于，所述RNAi干擾載體在動物受精 前進行性別控制中應用。
6. 根據權利要求5所述的RNAi干擾載體，其特征在于，所述RNAi干擾載體以睪丸直接 注射的方式注射至動物體內，用于干擾動物X染色體上的Zfx基因。
7. -種RNAi干擾載體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： 酶切所述pLentiLox3. 7載體； 將所述RNAi干擾片段與酶切后的所述pLentiL〇X3. 7載體連接，得到連接產物； 其中，所述 RNAi 干擾片段包含序列：TGAGG CAGAT GTATC TGAAATTCAA GAGAT TTCAG ATACA TCTGC CTCTT TTTTC 或 TGCAGAGAAG GCCAT TGAAT TTCAA GAGAA TTCAA TGGCC TTCTC TGCTTTTTTC ； 將所述連接產物轉化至感受態細胞中，并篩選出陽性克隆菌液； 對陽性克隆菌液進行測序鑒定，并將測序結果與所述RNAi干擾片段序列完全一致的 菌液進行擴增； 從所述擴增的菌液中提取RNAi干擾載體。
8. 根據權利要求7所述的RNAi干擾載體的制備方法，其特征在于，所述的將所述連接 產物轉化至感受態細胞中，并篩選出陽性克隆菌液，具體為： 將所述連接產物轉化至感受態細胞中，并采用氨芐（AMP+)抗性篩選和藍白斑篩選，篩 選出陽性克隆菌液。
9. 根據權利要求7所述的RNAi干擾載體的制備方法，其特征在于，所述的從所述擴增 的菌液中提取RNAi干擾載體，具體為：采用質粒提取試劑盒對所述RNAi干擾載體進行提取 或采用SDS堿裂解法對所述RNAi干擾載體進行提取。
【文檔編號】A61K48/00GK104232643SQ201410421472
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年8月25日 優先權日:2014年8月25日
【發明者】賈斌, 寧孟影, 程波 申請人:石河子大學