低免疫原性抗TNF-α全人源單抗及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種低免疫原性的抗TNF-α全人源單抗及其應用。通過對阿達木(adalimumab)單抗氨基酸序列分析，對其中免疫原性高的非抗原結合序列進行改進，構建并篩選出多個免疫原性有效降低的抗TNF-α全人源單抗，其與人TNF-α結合的親和力和原始adalimumab抗體相近，可特異性地阻斷TNF-α與細胞表面TNF受體p55和p75的結合。本發明為針對TNF-α靶標的抗腫瘤及其他疾病如炎癥及自身免疫性疾病的預防和治療提供了免疫原性更低、半衰期更長的抗體藥物，該抗體藥有望減少其在病人體內產生免疫原性的風險，延長抗體藥的半衰期，提高療效，具有優異的臨床應用價值。
【專利說明】低免疫原性抗TNF-α全人源單抗及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及治療用人源基因工程抗體的制備及應用，主要是涉及特異性針對人 TNF-α的抗體及其應用。
【背景技術】
[0002] TNF-α是一種在炎癥和免疫應答中自然出現的細胞因子。研究發現在類風濕性 關節炎（RA)患者的滑膜液中，TNF-α水平升高，并在病理性炎癥和關節破壞方面起重要作 用。目前一般采用單克隆IgG抗體或者可溶性的TNF-α受體來中和體內的TNF-α。市售 的單抗有如下：英夫利昔是人源化的TNF-α鼠單克隆抗體，依那西普是由兩條人TNF-α受 體（P75)偶聯到Fc端的融合蛋白。利用放射性標記的TNF-α進行結合能力測定，結果顯 示英夫利昔能結合單體（無活性）及三聚體（有活性）類型的可溶TNF ;依那西普更傾向 于結合有活性的聚體形式的TNF-α及TNF-β。阿達木（adalimumab)單抗是美國雅培公 司研制的一個全人的TNF-α單克隆抗體，其可特異性地與TNF結合并阻斷其與p55和p75 細胞表面TNF受體的相互作用。但adalimumab單抗在宿主體內免疫原性較強，高達26% 以上的患者使用該單抗會發生免疫反應，這給臨床患者的使用帶來了風險和不便，同時藥 物半衰期也相對較短，使用的過程中也需要增大藥物劑量來彌補該方面的缺陷。基于此，若 能夠在不影響抗體親和力和特異性的前提下，通過將抗體中高免疫原性的非抗原結合位點 換成低免疫原性的同源序列來降低抗體藥的免疫原性，則一方面可使單抗的安全性得到提 高；另一方面可增加藥物半衰期，在減少其用劑量同時也能起到提高療效的作用。目前未見 低免疫原性TNF-α的抗體的報道。
【發明內容】
[0003] 本發明的第一個目的在于提供一種低免疫原性的全人源抗TNF-α的單克隆抗 體。
[0004] 本發明的另一個目的在于提供一種制備低免疫原性全人源抗TNF-α的單克隆抗 體的方法。
[0005] 本發明利用商業化的DNAStarTM軟件對阿達木單抗（購自美國雅培公司）的原始 序列進行評價，結果顯示，阿達木免疫原性系數為16。利用上述軟件對抗體的可變區里面的 非抗原結合片段（FR)進行免疫原性評價，找到免疫原性強的相關序列。隨后，查找人抗體 基因庫中所有涉及輕重鏈的FR區段，通過比較后選擇出一些免疫原性相對較低的區段。將 區段中相應變動的部分分別得同阿達木單抗中對應的區段進行替換，隨后用Pymol蛋白分 子模擬軟件進行3D建模，選擇保持了原有的抗原結合位點的序列進行基因合成，測序，選 擇測序正確的序列。
[0006] 本發明的低免疫原性抗TNF-α全人源單克隆抗體，即是在原始阿達木序列的輕 鏈可變區和重鏈可變區的FR區進行氨基酸改造，降低其免疫原性，所述原始阿達木序列的 輕鏈可變區和重鏈可變區的氨基酸序列分別如SEQIDNO. 23、24所示。
[0007] 進一步地，本發明提供的低免疫原性抗TNF-α全人源單克隆抗體，其輕鏈可變區 的氨基酸序列為SEQIDNO. 11?15或SEQIDNO. 23任一所示，其重鏈可變區的氨基酸序 列為SEQIDNO. 16?20任一所示。
[0008] 更進一步地，本發明提供的低免疫原性抗TNF-α全人源單克隆抗體，其輕鏈可變 區的氨基酸序列如SEQIDNO. 13所示，其重鏈可變區的氨基酸序列如SEQIDNO. 19所示。 編碼其的核苷酸序列分別如SEQIDNO. 3和SEQIDNO. 9所示。
[0009] 本發明提供的全人源的抗人TNF-α單克隆抗體，其輕鏈可變區具有Ll至L5(SEQ IDNOl?5所示）這五條堿基序列所示的任一個輕鏈可變區序列，重鏈可變區具有hi至 h5(SEQIDNO. 6?10所示）這五條堿基序列所示的任一個重鏈可變區序列。
[0010] 具備上述輕鏈可變區和重鏈可變區的組合中，本發明共篩選得到10個單抗序列， 它們既保持了原有抗原結合位點、又與人TNF-α結合的親和力和原始adalimumab抗體相 近，可特異性地阻斷TNF-α與細胞表面TNF受體p55和p75的結合。
[0011] 這10個單克隆抗體都具有相同的⑶R區域且具有同樣的功能，但對這10個抗體 FR區域中某些氨基酸進行了不同的調整，這可使它們的免疫原性得到有效的降低。
[0012] 本發明的提供編碼上述10個單克隆抗體輕鏈可變區和重鏈可變區的基因。
[0013] 本發明得到的10個低免疫原性的全人源抗TNF-α的單克隆抗體，分別為L3h2、 L3h4、L5h2、L4hl、L4h2、L4h4、Llh3、L2hl、L0h4、L2h5、
[0014] 其中L3h2單抗的輕鏈的核苷酸序列分別如SEQIDNO. 3所述，重鏈的核苷酸序列 分別如SEQIDNO. 7所述，其輕鏈的氨基酸序列分別如SEQIDNO. 13所述，重鏈的氨基酸 序列分別如SEQIDNO. 17所述。
[0015] 其中L3h4單抗的輕鏈的核苷酸序列分別如SEQIDNO. 3所述，重鏈的核苷酸序列 分別如SEQIDNO. 9所述，其輕鏈的氨基酸序列分別如SEQIDNO. 13所述，重鏈的氨基酸 序列分別如SEQIDNO. 19所述。
[0016] 其中L5h2單抗的輕鏈的核苷酸序列分別如SEQIDNO. 5所述，重鏈的核苷酸序列 分別如SEQIDNO. 7所述，其輕鏈的氨基酸序列分別如SEQIDNO. 15所述，重鏈的氨基酸 序列分別如SEQIDNO. 17所述。
[0017] 其中L4hl單抗的輕鏈的核苷酸序列分別如SEQIDNO. 4所述，重鏈的核苷酸序列 分別如SEQIDNO. 6所述，其輕鏈的氨基酸序列分別如SEQIDNO. 14所述，重鏈的氨基酸 序列分別如SEQIDNO. 16所述。
[0018] 其中L4h2單抗的輕鏈的核苷酸序列分別如SEQIDNO. 4所述，重鏈的核苷酸序列 分別如SEQIDNO. 7所述，其輕鏈的氨基酸序列分別如SEQIDNO. 14所述，重鏈的氨基酸 序列分別如SEQIDNO. 17所述。
[0019] 其中L4h4單抗的輕鏈的核苷酸序列分別如SEQIDNO. 4所述，重鏈的核苷酸序列 分別如SEQIDNO. 9所述，其輕鏈的氨基酸序列分別如SEQIDNO. 14所述，重鏈的氨基酸 序列分別如SEQIDNO. 19所述。
[0020] 其中Llh3單抗的輕鏈的核苷酸序列分別如SEQIDNO. 1所述，重鏈的核苷酸序列 分別如SEQIDNO. 8所述，其輕鏈的氨基酸序列分別如SEQIDNO. 11所述，重鏈的氨基酸 序列分別如SEQIDNO. 18所述。
[0021] 其中L2hl單抗的輕鏈的核苷酸序列分別如SEQIDNO. 2所述，重鏈的核苷酸序列 分別如SEQIDNO. 6所述，其輕鏈的氨基酸序列分別如SEQIDNO. 12所述，重鏈的氨基酸 序列分別如SEQIDNO. 16所述。
[0022] 其中L2h5單抗的輕鏈的核苷酸序列分別如SEQIDNO. 2所述，重鏈的核苷酸序列 分別如SEQIDNO. 10所述，其輕鏈的氨基酸序列分別如SEQIDNO. 12所述，重鏈的氨基酸 序列分別如SEQIDNO. 20所述。
[0023] 其中L0h4單抗的輕鏈的核苷酸序列分別如SEQIDNO. 21所述，重鏈的核苷酸序 列分別如SEQIDNO. 9所述，其輕鏈的氨基酸序列分別如SEQIDNO. 23所述，重鏈的氨基 酸序列分別如SEQIDNO. 19所述。
[0024] 本發明提供了含有上述10個中任一個低免疫原性的全人源抗TNF-α的單克隆抗 體輕鏈可變區和重鏈可變區基因的表達載體。含有所述表達載體的宿主菌、宿主細胞或表 達盒也在本發明的保護范圍內。
[0025] 本發明提供上述10個低免疫原性的全人源抗TNF-α的單克隆抗體在制備治療自 身免疫性疾病藥物中的應用。
[0026] 所述的疾病為風濕性關節炎，紅斑狼瘡。
[0027] 本發明提供了上述全人源抗TNF-α單克隆抗體在制備以TNF-α為靶標的疾病治 療藥物中的應用。
[0028] 所述的藥物為抗腫瘤藥、抗炎藥物或治療自身免疫性疾病的藥物。
[0029] 本發明提供了含有上述全人源抗TNF-α單克隆抗體的藥物或檢測試劑。
[0030] 本發明提供了制備上述全人源抗TNF-α單克隆抗體的方法，包括以下步驟：
[0031] (1)對NCBI數據庫里的人源抗體的FR序列進行分析（詳見圖2、3)，根據上述結 果同時利用商業化的DNAstar軟件對抗體的可變區里面的4個非抗原結合片段（FR)進行 免疫原性評價，找到免疫原性強的片段。然后通過對已知的人抗體基因庫里面找出所有重 鏈的FR3段，挑選出一些免疫原性低的相應區段。將阿達木單抗上相應的重鏈及輕鏈區段 進行替換，隨后用Pymol蛋白分子模擬軟件進行3D建模，結果發現大部分替換排列組合導 致抗體的抗原結合位點構象變動很大，但是也有部分基本保持了原有的抗原結合位點；
[0032] (2)根據以上信息，本發明對相應修改后的序列進行全基因合成，對合成的基因 進行測序同時選擇測序正確的序列進行下一步操作，將輕鏈可變區設計酶切位點為Kpn I+BamHI，重鏈可變區設計酶切位點為KpnI+Agel，分別與表達載體pJH16載體連接，同時 轉化大腸桿菌DH5ci，得到重鏈、輕鏈嵌合抗體表達載體，結果詳見圖1。同時對構建的抗體 進行測序和序列對比；
[0033] (3)對上述表達的載體進行質粒大提工作，選取Qiagen的無內毒素質粒大提試劑 盒（詳見該質粒試劑盒說明書）；
[0034] (4)對選取的質粒進行優化組合，同時利用293F細胞進行瞬時轉染表達，對表達 的抗體進行親和力和EC50檢測（詳見圖4)根據檢測結果來選定哪些組合進行穩定轉染；
[0035] (5)根據上述檢測結果，本發明選取相應的組合利用電轉染方式構建穩定株，同時 利用MTX進行抗體表達程度的篩選，對于加壓后的穩定株進行單克隆篩選，最終挑選出抗 體產量較高的穩定株，用于后續實驗所用；
[0036] (6)本發明生產的單克隆抗體在小鼠體內的免疫反應比adalimumab低，同時半衰 期明顯延長。
[0037] 本發明提供的全人源抗TNF-α抗體和adalimumab針對的是TNF-α相同位點，但 其免疫原性和抗體構象同adalimumab不同，同adalimumab相比其藥物半衰期延長，有望成 為非常理想的生物祀向治療抗體。本發明通過對adalimumab單抗進行免疫原性改造，使抗 體中部分氨基酸序列改變，將顯著降低該抗體藥在病人體內產生免疫原性的風險。本發明 實施例顯示本發明的改進型adalimumab抗體與TNF-α結合的親和力和原始adalimumab 相近，并延長抗體藥的半衰期，提高療效。
【專利附圖】
【附圖說明】：
[0038] 圖1為質粒及合成基因酶切結果；其中a圖為pJH16質粒雙酶切結果（kpnI和 AgeI)，1:質粒雙酶切結果。b圖為pJH16質粒雙酶切結果（kpnI和BamHI)，1:質粒雙 酶切結果。c圖為阿達木原始重鏈（kpnI和AgeI)及輕鏈（KpnI+BamHI)基因雙酶切 結果，1 :重鏈雙酶切結果，2 :輕鏈雙酶切結果；其中M為DL15000marker。
[0039] 圖2人源化輕鏈氨基酸序列BLAST比對結果；其中，圖2a、圖2b、圖2c三個圖均為 該BLAST比對結果。
[0040] 圖3人源化重鏈氨基酸序列BLAST比對結果；其中，圖3a、圖3b、圖3c三個圖均為 該BLAST比對結果。
[0041] 圖4改進型阿達木親和力EC50。
[0042] 圖5改進型阿達木抑制TNF- α誘導L929細胞毒性實驗。其中，圖5a代表TNF- α 誘導L929細胞毒性實驗，作為實驗的陽性對照；圖5b代表改進型阿達木抗體抑制TNF-α 誘導L929細胞毒性。
[0043] 圖6改進型阿達木抗體藥代動力學檢測。
【具體實施方式】
[0044] 以下實施實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不 背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本 發明的范圍。
[0045] 若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0046]實施例1降低免疫原性阿達木序列的分析及設計
[0047] 利用商業化DNAStar?軟件對阿達木原始序列進行評價，評價結果顯示，阿達木免 疫原性系數為16,針對此本發明需要進行下一步免疫原性的降低工作。
[0048] 通過利用上述軟件對抗體的可變區里面的非抗原結合片段（FR)進行免疫原性評 價，找到免疫原性強的相關序列。隨后，查找人抗體基因庫中所有涉及輕重鏈的FR區段，通 過比較后選擇出一些免疫原性相對較低的區段。基于上述信息，將區段中相應變動的部分 分別得同阿達木單抗中對應的區段進行替換，初步得到的全人源的抗人TNF-α單克隆抗 體，其輕鏈可變區選自Ll?L5、LO(SEQIDNO. 1?5、所示SEQIDNO. 21)任一個堿基序 列組成的輕鏈可變區序列，重鏈可變區選自hi?h5(SEQIDNO. 6?10)所不任一個堿基 序列組成的重鏈可變區序列。
[0049] 隨后用Pymol蛋白分子模擬軟件進行3D建模，結果發現大部分替換排列組合導致 抗體的抗原結合位點構象變動很大，但是也有部分基本保持了原有的抗原結合位點；因此 對保持原有抗原結合位點的修改后的所有序列進行全基因合成（委托金唯智公司合成）， 對合成的基因進行測序（委托金唯智公司進行測序工作），根據測序比對結果選擇正確的 序列。
[0050] 實施例2阿達木單抗表達載體的構建
[0051] 根據實施例1測序得到的改進型阿達木重鏈、輕鏈可變區堿基序列，設計輕鏈序 列兩側的酶切位點為KpnI+BamHI，設計重鏈序列兩側的酶切位點為KpnI+Agel，以上序列 送交金唯智公司合成全基因序列，合成所用的連接載體為PUC57。以pJH16為表達載體，合 成基因返回后，將它們分別與金唯智公司合成的序列進行酶切后（見圖1)，16°C過夜連接。 將酶切后得到的目的基因和表達載體（PJH16)進行瓊脂糖凝膠電泳分離，隨后切下目的條 帶并用QiagenGelExtractionKit回收，按T4DNA連接體系連接過夜，然后轉化大腸桿菌 DH5α，對相應的菌株進行質粒提取和序列測定工作，測序結果表明二者序列完全一致，這 表明抗體表達載體構建成功。
[0052] 實施例3改進型阿達木單抗的瞬時表達與純化
[0053] 用實施例2構建的pJH16重鏈、輕鏈表達載體轉染大腸桿菌DH5a。接種于IOOml LB培養基中，按照常規方法進行培養。收獲培養物，用Qiagen公司的UltraPure質粒DNA 純合試劑盒抽提純化質粒DNA。將上述純化的質粒DNA采用Invitrogen公司的脂質體法試 劑盒轉染293F細胞，操作參照廠家的說明書進行。
[0054] 首先對293F細胞進行不同輕、重鏈質粒組合的轉染，組合見表1，共31組293F瞬 時表達，需要從這31組中篩選出免疫原性降低的組合。培養3天后，取培養上清液，進行抗 體表達量檢測，結果如下表1所示：
[0055] 表1 :原始及改進型阿達木抗體表達量檢測結果（ng/ml)
[0056]
【權利要求】
1. 一種低免疫原性抗TNF-a全人源單克隆抗體，其特征在于，在原始阿達木序列的輕 鏈可變區和重鏈可變區的FR區進行氨基酸改造，降低其免疫原性，所述原始阿達木序列的 輕鏈可變區和重鏈可變區的氨基酸序列分別如SEQ ID NO. 23、24所示。
2. 如權利要求1所述的低免疫原性抗TNF-a全人源單克隆抗體，其特征在于，其輕鏈 可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO. 11?15或SEQ ID NO. 23任一所示，其重鏈可變區的氨 基酸序列為SEQ ID NO. 16?20任一所示。
3. 如權利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于，其輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO. 13所示，其重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO. 19所示。
4. 編碼權利要求1?3任一所述單克隆抗體的基因。
5. 含有權利要求4所述的基因的表達載體。
6. 權利要求4所述的基因或權利要求5所述的表達載體在制備治療以人TNF-a為靶 標的疾病藥物中的應用。
7. 權利要求1?3任一所述單克隆抗體在制備治療以人TNF-a為靶標的疾病藥物中 的應用。
8. 權利要求1?3任一所述單克隆抗體在制備治療自身免疫性疾病藥物中的應用。
9. 如權利要求8所述的應用，其特征在于，所述的疾病為風濕性關節炎、紅斑狼瘡。
10. 含有權利要求1?3任一所述單克隆抗體的藥物或檢測試劑。
【文檔編號】A61K39/395GK104341502SQ201410390493
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2014年8月8日 優先權日:2013年8月9日
【發明者】孫樂, 張小剛, 李茂華, 樊貴寶, 孫哲, 張翠娟 申請人:北京天成新脈生物技術有限公司