蘘荷抗腫瘤活性組分的提取方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種蘘荷抗腫瘤活性組分的提取方法，它包括以下步驟：取烘干的蘘荷根莖為原料，切成0.5-1cm小段后加入8-10倍超純水浸泡12-24小時；邊攪拌邊加入8倍70％乙醇溶液，使充分混勻，回流提取1.5小時，然后過濾；取過濾的濾渣，邊攪拌邊加入8倍70％乙醇溶液使充分混勻，回流提取1-1.5小時，過濾，重復一次；將全部過濾所得濾液合并，濃縮干燥濾液，得浸膏；浸膏過HPD400大孔樹脂，水洗至無醇味，接著過HPD400色譜柱，分別以30％、60％、95％乙醇洗脫，依次得到洗脫組分A、洗脫組分B、洗脫組分C，濃縮干燥洗脫組分C，該洗脫組分C可應用于制備抗腫瘤藥物中。
【專利說明】囊荷抗腫瘤活性組分的提取方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及中醫藥制品加工【技術領域】，具體涉及一種從囊荷中提取抗腫瘤活性組 分的方法，以及該提取到的囊荷在制備抗腫瘤藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 癌癥一直是危害人類健康的難以治愈的病癥之一，很多化學治療、手術治療、放射 線治療腫瘤的方法對人體自身也存在著很多危害，尋求一個具有好的療效同時對人體的毒 害作用小的藥物是我們醫藥學者的目標。中醫學早于二千多年前對癌癥已有所認識，中醫 療法則有其獨特的理論邏輯和思維方式，多種中藥可有效地抑制腫瘤細胞，并配合放化療 調節機體免疫、誘導腫瘤細胞分化和凋亡、預防癌轉移復發及抑制癌前病變等作用機制達 到防止癌癥發生的目的，具有良好的應用前景。特別是有關中藥誘導腫瘤細胞凋亡和分化 的研究，現已成為中藥防治惡性腫瘤的一個新動向。
[0003] 囊荷（Zingiber mioga)，姜科姜屬，多年生草本植物，俗稱野姜、茗荷、陽藿等。其 嫩芽、花軸和嫩莖味芳香微甘，可涼拌或炒食，也可制作醬菜，是營養價值很高的珍稀蔬菜。 囊荷嫩莖具有特殊氣味，其揮發油中除具有特殊氣味的揮發性組分外，還鑒定出許多藥用 成分，如烷烴醇類、酮類、醛類、環氧化合物及醚類、冰片、烯烴、脂肪酸、酯類化合物等多種 化合物。
[0004] 目前，對于襄荷根莖提取物的研究中，還未見其抗癌功效的報道。
【發明內容】
[0005] 本發明所要解決的技術問題是針對以上現有技術的不足，提供一種囊荷抗腫瘤活 性組分的提取方法，該方法操作簡單、過程可控、重復性好，提取得到的種囊荷抗腫瘤活性 組分被證明具有抗腫瘤活性。
[0006] 本發明所采用的技術方案為：
[0007] -種囊荷抗腫瘤活性組分的提取方法，它包括以下步驟：
[0008] (1)取烘干的囊荷根莖為原料，切成0. 5-lcm小段后，加入超純水進行浸泡12-24 小時，其中超純水的加入量為囊荷根莖質量的8-10倍；
[0009] (2)邊攪拌邊加入70%乙醇溶液，使充分混勻，乙醇溶液的加入量為囊荷根莖質 量的8倍，然后進行回流提取1. 5小時，提取完后進行過濾；
[0010] (3)取步驟（2)中過濾的濾渣，邊攪拌邊加入70%乙醇溶液使充分混勻，乙醇溶液 的加入量為濾渣質量的8倍，然后進行回流提取1. 5小時，提取完后進行過濾；
[0011] (4)取步驟（3)中過濾的濾渣，邊攪拌邊加入70%乙醇溶液使充分混勻，乙醇溶液 的加入量為濾渣質量的8倍，然后進行回流提取1小時，提取完后進行過濾；
[0012] (5)將步驟（2)、（3)、（4)過濾所得的濾液進行合并，濃縮干燥濾液，得浸膏；
[0013] (6)將得到的浸膏過HPD400大孔樹脂，然后水洗至無醇味，接著浸膏過HPD400色 譜柱，分別以30 %、60 %、95 %乙醇洗脫，依次得到洗脫組分A、洗脫組分B、洗脫組分C，濃縮 干燥洗脫組分C，即為本發明目的抗腫瘤活性組分。
[0014] 本發明還進一步提供上述從囊荷提取到的抗腫瘤活性組分在制備抗腫瘤藥物中 的應用。該活性組分作為有效成分按常規方法與藥學上可接受的任何載體制成各類藥用制 劑。
[0015] 與現有技術相比，本發明具有以下顯著優點和有益效果：
[0016] 1、本發明先使用超純水對囊荷根莖進行浸泡，以軟化囊荷根莖堅硬的細胞壁，然 后采用多次回流提取的方法、加上攪拌過程中乙醇濃度的緩慢漸變，使盡可能地多提取 到有效組分，并通過工藝參數的精確控制，使回流提取過程穩定可控、重復性好，最后過 HPD400色譜柱，通過大量對比試驗最終確定30%、60%、95%三個乙醇洗脫梯度，使得得到 的目的組分中其抗腫瘤活性成分含量高，使盡可能地提高有效成分的提取率；
[0017] 2、本方法采用回流提取加色譜分離的方法，成功提取到體內和體外抗腫瘤實驗均 呈陽性的活性組分，本方法總的來說操作簡單、過程可控，可實施化程度高，有利于后期工 業化推廣；
[0018] 3、本發明提取得到的活性組分原料來源于天然，副作用小或沒有，可進一步開發 出藥效更好、不良反應更小更少的抗癌劑，用于癌癥的治療，具有明顯的社會效益和經濟效 Μ ;
[0019] 4、本發明拓展了抗腫瘤藥物或保健食品的原料來源，擴大了囊荷的應用范圍，使 囊荷成為抗腫瘤藥物的有效組分原料，顯著提高了囊荷的附加值。
【具體實施方式】
[0020] 以下結合實施例對本發明作進一步具體描述。應該指出，以下具體說明都是例示 性的，旨在對本發明提供進一步的說明。除非另有說明，本發明使用的所有科學和技術術語 具有與本發明所屬【技術領域】人員通常理解的相同含義。
[0021] 實施例1 :囊荷抗腫瘤活性組分的提取
[0022] 1、原料、材料：
[0023] 囊荷根莖采自浙江湖州莫干山。
[0024] 2、試劑：
[0025] 超純水由密立博純水儀生產；95 %乙醇購自天津市北方天醫化學試劑廠。
[0026] 3、儀器設備：
[0027] HPD400(43cmX3. 5cm)色譜柱購自滄州寶恩吸附材料科技有限公司；電子調溫電 熱套購自天津市泰斯特儀器有限公司；旋轉蒸發儀購自上海亞容生化儀器廠。
[0028] 4、提取方法包括以下步驟：
[0029] (1)取烘干的囊荷根莖為原料，切成0. 5-lcm小段后，加入超純水進行浸泡18小 時，其中超純水的加入量為囊荷根莖質量的8倍；
[0030] (2)邊攪拌邊加入70%乙醇溶液，使充分混勻，乙醇溶液的加入量為囊荷根莖質 量的8倍，然后進行回流提取1. 5小時，提取完后進行過濾；
[0031] (3)取步驟（2)中過濾的濾渣，邊攪拌邊加入70%乙醇溶液使充分混勻，乙醇溶液 的加入量為濾渣質量的8倍，然后進行回流提取1. 5小時，提取完后進行過濾；
[0032] (4)取步驟（3)中過濾的濾渣，邊攪拌邊加入70%乙醇溶液使充分混勻，乙醇溶液 的加入量為濾渣質量的8倍，然后進行回流提取1小時，提取完后進行過濾；
[0033] (5)將步驟（2)、（3)、（4)過濾所得的濾液進行合并，減壓回收溶劑，濃縮干燥濾 液，得浸膏；
[0034] (6)將得到的浸膏過HPD400大孔樹脂，然后水洗至無醇味，收集水洗液，接著浸膏 過HPD400(43cmX3. 5cm)色譜柱，分別以30%、60%、95%乙醇洗脫，依次得到洗脫組分八、 洗脫組分B、洗脫組分C，減壓回收乙醇，濃縮干燥各洗脫組分。
[0035] 實施例2 :藥理實驗-體外實驗
[0036] 1、實驗材料
[0037] 人肝癌細胞Η印G2、人纖維肉瘤細胞HT-1080、人結腸癌細胞HCT116、人黑色素瘤 細胞A375-S2、人組織細胞淋巴瘤細胞U-937、人慢性髓原白血病細胞Κ562、人原髓細胞白 血病細胞 HL60 購于 American Type Culture Collection(ATCC，Rockville，MD，USA)。細 胞接種在含10%胎牛血清、2%谷氨酰胺的RPMI-1640培養液中，在37°C，5% C02培養箱中 培養。
[0038] 2、操作步驟：
[0039] 2. 1貼壁細胞
[0040] 選用對數生長期的貼壁腫瘤細胞,用胰酶消化后，用含10%小牛血清的RPMI 1640 培養基配成5X104/ml的細胞懸液，接種在96孔培養板中，每孔1001，37°C，5% C02培養 24h。
[0041] 實驗組更換新的含不同濃度（〇· l、l、10、20、50、100ug/mL)被測樣品（洗脫組分C) 的培養液，對照組則更換含等體積溶劑的純培養液，每組設3個平行孔，37°C，5 % C02培養 48h。棄去上清液，用PBS小心洗2次，每孔加入100 μ L新鮮配制的含0. 5mg/ml MTT的培 養基，37°C繼續培養4h。小心棄去上清，并加入150yL DMS0,用微型振蕩器混勻lOmin后， 用酶標儀在492nm處測定光密度值。
[0042] 2. 2懸浮細胞
[0043] 選用對數生長期的細胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培養基配成2X105/ml的 細胞懸液，接種在96孔培養板中，每孔50 μ L，37°C，5% C02培養24h。實驗組加入含不同濃 度（同上）被測樣品（洗脫組分C)的培養液50 μ L，對照組則加入含等體積溶劑的純培養 液，每組設3個平行孔，37°C，5% C02培養48h，每孔加入101新鮮配制的含5mg/ml ΜΤΤ的 培養基，37°C繼續培養4h。用三聯液（SDS 10g，10M HC10. lmL，異丁醇5mL，用蒸餾水稀釋至 100mL) 100μ L溶解結晶，37°C孵育12h。用酶標儀在492nm處測定光密度值。
[0044] 3、按下式計算藥物對腫瘤細胞生長的抑制率
[0045] 腫瘤細胞生長抑制率（％ )
[0046] = [A492 (陰性對照）一A492 (加藥組）]/A492 (陰性對照）X 100 %，
[0047] 從中求出樣品的半數抑制濃度（IC5Q)。
[0048] 4、實驗結果如表1所示
[0049] 表1囊荷95%醇層提取物對7種腫瘤細胞株的抑制作用
[0050]
【權利要求】
1. 一種囊荷抗腫瘤活性組分的提取方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 取烘干的囊荷根莖為原料，切成0.5-lcm小段后，加入超純水進行浸泡12-24小時， 其中超純水的加入量為囊荷根莖質量的8-10倍； (2) 邊攪拌邊加入70%乙醇溶液，使充分混勻，乙醇溶液的加入量為囊荷根莖質量的8 倍，然后進行回流提取1. 5小時，提取完后進行過濾； (3) 取步驟（2)中過濾的濾渣，邊攪拌邊加入70%乙醇溶液使充分混勻，乙醇溶液的加 入量為濾渣質量的8倍，然后進行回流提取1. 5小時，提取完后進行過濾； (4) 取步驟（3)中過濾的濾渣，邊攪拌邊加入70%乙醇溶液使充分混勻，乙醇溶液的加 入量為濾渣質量的8倍，然后進行回流提取1小時，提取完后進行過濾； (5) 將步驟（2)、（3)、（4)過濾所得的濾液進行合并，濃縮干燥濾液，得浸膏； (6) 將得到的浸膏過HPD400大孔樹脂，然后水洗至無醇味，接著浸膏過HPD400色譜柱， 分別以30 %、60 %、95 %乙醇洗脫，依次得到洗脫組分A、洗脫組分B、洗脫組分C，濃縮干燥 洗脫組分C，即為本發明目的抗腫瘤活性組分。
2. 利用權利要求1所述的囊荷抗腫瘤活性組分的提取方法得到的抗腫瘤活性組分在 制備抗腫瘤藥物中的應用。
【文檔編號】A61K36/9068GK104147565SQ201410386584
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月7日 優先權日:2014年8月7日
【發明者】魏秀杰, 魏秀巖, 李玉英 申請人:魏秀杰, 李玉英