激活素受體樣激酶7（alk7）在治療心肌肥厚中的功能及應用的制作方法

激活素受體樣激酶7（alk7）在治療心肌肥厚中的功能及應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了激活素受體樣激酶7（ALK7）在治療心肌肥厚疾病中的功能及應用。本發明確定了ALK7基因與心肌肥厚之間的關系：心肌肥厚發生時，ALK7的表達明顯下調；ALK7的干擾和過表達腺病毒分別促進和抑制心肌細胞肥大；ALK7基因敲除顯著上調MEK1/2/ERK1/2、Smad2/Smad3信號通路的激活，促進心肌肥厚、纖維化，惡化心功能；ALK7基因過表達顯著下調MEK1/2/ERK1/2、Smad2/Smad3信號通路的激活，抑制心肌肥厚、纖維化，改善心功能。因此，ALK7基因可作為基因治療中的靶基因，制備保護心臟功能和/或預防、緩解和/治療心肌肥厚的藥物，為心肌肥厚的治療提供了新途徑。
【專利說明】激活素受體樣激酶7 (ALK7)在治療心肌肥厚中的功能及應 用

【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因的功能與應用領域，特別涉及一種激活素受體樣激酶7 (ALK7)在 治療心肌肥厚中的功能和應用，具體是在制備預防、緩解和/或治療心肌肥厚藥物中的應 用。

【背景技術】
[0002] 據世界衛生組織報告，心血管疾病已成為威脅人類生命健康的全球性慢性非傳染 性疾病之一。多種心血管疾病包括高血壓、動脈粥樣硬化、心臟瓣膜病、心肌病等隨之進展 為心力衰竭，是大多數病患住院和死亡的首要原因。心肌肥厚是指心臟在遺傳、環境、多種 生理及病理因素的作用下，為了適應心臟做功增加而出現的心臟重量和體積增加，主要以 心肌細胞體積增大和細胞外基質增多為特征，被認為是單個心肌細胞增大所致的形態學改 變而不是心肌細胞數量的增長。研究表明，心肌肥厚是冠心病、高血壓、心律失常、心臟瓣 膜病及心肌病等多種心血管疾病的共同病理生理過程，是多種心血管并發癥的獨立危險因 素。心肌肥厚作為心臟應對負荷增加的一種適應性反應，在心肌肥厚發生的早期發揮了有 益的代償效應，但持續的心肌肥厚是有害的，會引起擴張性心肌病，并可能導致突然死亡； 隨著心臟功能的進一步惡化，會轉變成心力衰竭。抑制心肌肥厚，對防止心力衰竭的發生、 改善心臟功能具有重要作用。
[0003] 心肌肥厚是心室肥大刺激誘導核內基因異常表達的結果，細胞內信號轉導是心室 肥大刺激與核內基因轉錄活化的重要環節。不同刺激誘導的心肌肥厚可能具有不同的分子 機制。目前研究的主要分子機制有：1. Ca2+及其依賴的信號途徑；2.絲裂原活化蛋白激 酶（MAPK)信號途徑；3. JAK-STAT信號通路；4.蛋白激酶C(PKC)信號通路；5.磷脂酰肌 醇-3激酶（PI3K) /Akt信號通路；6.炎癥、NF-κ B信號通路等。MAPK是真核細胞中的一 個重要信號系統，G蛋白耦聯受體、酪氨酸激酶受體或離子通道耦聯受體均可經過不同的中 間環節引起MAPK的激活，激活的MAPK通過調節核內轉錄因子，致細胞增殖和生長反應信號 轉導通路。MAPK可分為4個亞族：細胞外信號調節激酶（ERK)、p38激酶、應急激活蛋白激 酶（JNK)和ERK5。哺乳動物中，ERK廣泛存在于各種組織，參與細胞的增殖、分化，調控多種 生長因子受體、營養相關因子受體等。心血管疾病發病率和病死率在全世界范圍內持續升 高，盡管在治療方法上有了進步，但是目前依然沒有有效方法減少心血管事件的發生。因此 尋找抑制心肌肥厚的特異性分子，對于進一步闡述心肌肥厚的發生發展機制，具有重大的 理論意義，可為臨床防治心肌肥厚提供新靶點和新策略。
[0004] 激活素受體樣激酶 7 (activin receptor-like kinase 7，ALK7)是 I 型轉化生 長因子β (TGF-β )受體，TGF-β是目前公認的、導致多器官及組織纖維化的關鍵細胞因 子，在調節細胞增殖、譜系分化、遷移、黏附和凋亡過程中具有重要作用，在維持代謝平衡中 也發揮重要的作用。在哺乳動物中發現有7種TGF-β I型受體亞型（即ALK1至ALK7)， TGF- β通過跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶受體激活Smad蛋白發揮作用。Smad蛋白是TGF- β的 下游信號分子之一，介導TGF-β的細胞內信號轉導。研究表明，在心肌細胞受到TGF-β刺 激發生肥大的過程中，信號蛋白Smad 2、Smad 3表達的變化與心肌細胞肥大的發生有著明 顯的一致性【1】，⑶F1通過調控MEK-ERK1/2和Smad信號通路，在心臟重構中發揮重要作用 【2】。目前有研究表明ALK7與代謝綜合征及其引起的心血管重構顯著相關【3】;ALK7可通 過激活Smad2/3從而調控高糖誘導的H9C2心肌祖細胞的凋亡【4】;ALK7可激活Smad2/3/4 從而抑制脂肪生成；ALK7的失活會激活PPARy，從而下調炎癥脂肪細胞因子，上調脂聯素， 而激活的PPAR γ可刺激分化的脂肪細胞中甘油三酯的合成和分解從而促進脂質的轉換和 重構【5】。因此推測ALK7在心肌肥厚中發揮著重要的作用。
[0005]【參考文獻】 1、 國輝，黃俊，馬業新.TGF-β及其信號蛋白Smad2,3在大鼠心肌細胞肥大中的作用. 現代醫學，2003, 31 :301-303. 2、 Zhang Y, Zhang XF, Gao L, et al. Growth/differentiation factor 1 alleviates pressure overload-induced cardiac hypertrophy and dysfunction. Biochim Biophys Acta. 2014; 1842(2):232-44. 3、 Zhang ff, et al. ALK7 gene polymorphism is associated with metabolic syndrome risk and cardiovascular remodeling. Arq Bras Cardiol. 2013;101(2):134-40. 4、 Liu L, et al. Activin receptor-like kinase 7 mediates high glucose-induced H9c2 cardiomyoblast apoptosis through activation of Smad2/3. Int J Biochem Cell Biol. 2013 Sep;45(9):2027-35. 5、 Yogosawa S, et al. Roles of activin receptor-like kinase 7 signaling and its target, peroxisome proliferator-activated receptor y, in lean and obese adipocytes. Adipocyte. 2013;2 (4):246-50。


【發明內容】

[0006] 為解決上述現有技術的缺陷和不足，本發明的目的在于確定ALK7的表達和心肌 肥厚的相互關系，提供一種ALK7在篩選保護心臟功能和/或預防、緩解和/治療心肌肥厚 的藥物中的應用，提供一個用于保護心臟功能和/或預防、緩解和/或治療心肌肥厚的靶基 因 ALK7的新用途。
[0007] 本發明的目的通過下述技術方案實現： 本發明首先通過試驗確定ALK7表達與心肌肥厚之間的關系： 1、在發生心肌肥厚的情況下，ALK7的表達明顯下調 本發明選用正常人和肥厚性心肌病患者以及正常小鼠和發生心肌肥厚小鼠的心臟，對 心臟提取蛋白質進行SDS-PAGE-免疫印跡試驗（Western blot)，結合特異性識別ALK7蛋白 和心肌細胞肥大標志物ANP、Myh7的抗體進行檢測，測定其ALK7的表達。結果表明，在人和 小鼠發生肥厚的心臟中，心肌細胞肥大標志物ANP、Myh7的表達明顯上調，ALK7的表達明顯 下調（圖1、圖2)。
[0008] 2、ALK7的干擾腺病毒促進心肌細胞肥大；ALK7的過表達腺病毒抑制心肌細胞肥 大 本發明通過在體外分離、培養了 SD乳鼠心肌細胞，構建ALK7干擾（Adsh ALK7)及過表 達（Ad-ALK7)腺病毒，并通過結合Ang II刺激模擬心肌細胞肥大模型，研究ALK7在心肌細胞 中的表達特征。通過在熒光顯微鏡下觀察到Ang II刺激后心肌細胞明顯大于PBS組，Ang II 刺激后ALK7干擾腺病毒的心肌細胞肥大更顯著，而ALK7過表達腺病毒的心肌細胞肥大則 顯著減小（圖3)。
[0009] 3、ALK7基因敲除顯著促進了心肌肥厚、纖維化，惡化心功能；ALK7基因過表達顯 著抑制了心肌肥厚及其纖維化，改善心功能 本發明選用野生型小鼠、ALK7基因敲除小鼠及心臟特異性ALK7轉基因小鼠和非轉基 因小鼠進行試驗，并將每種小鼠分成假手術組和手術組，每組10只小鼠。手術組給予主動 脈弓縮窄手術，假手術組不予主動脈弓縮窄，然后通過對假手術組和手術組的各組小鼠進 行心臟心肌肥厚、纖維化及心功能的測定，研究ALK7基因敲除/過表達對主動脈弓縮窄誘 導的心肌肥厚的影響。結果表明敲除ALK7基因所致的ALK7缺陷顯著惡化心肌肥厚、纖維 化及心功能；過表達ALK7基因顯著抑制心肌肥厚及纖維化，保護心功能（圖4-11)。
[0010] 4、ALK7基因敲除促進MEK1/2 / ERK1/2、Smad2/Smad3信號通路；ALK7基因過表 達抑制 MEK1/2 / ERKl/2、Smad2/Smad3 信號通路 本發明用野生型小鼠、ALK7基因敲除小鼠及心臟特異性ALK7轉基因小鼠和非轉基因 小鼠分別進行假手術和主動脈弓縮窄手術，然后在術后4周對各組小鼠心臟提取蛋白質進 行SDS-PAGE-免疫印跡試驗（Western blot)，結果顯示敲除ALK7基因所致的ALK7缺陷顯 著促進 MEK1/2 / ERKl/2、Smad2/Smad3 信號通路，ALK7 基因過表達抑制 MEK1/2 / ERK1/2、 Smad2/Smad3信號通路，而JUK1/2、P38則無顯著變化（圖12-15)。
[0011] 由以上結果可知發生心肌肥厚時，ALK7表達會下調，ALK7基因缺陷促進MEK1/2 / ERK1/2、Smad2/Smad3信號通路，顯著促進了心肌肥厚、纖維化，惡化心功能，ALK7基因過表 達抑制MEK1/2 / ERK1/2、Smad2/Smad3信號通路，顯著抑制了心肌肥厚、纖維化，保護心功 能。因此ALK7基因具有保護心功能和抑制心肌肥厚及纖維化的作用，特別是ALK7基因能 夠抑制主動脈弓縮窄引起的心肌肥厚相關疾病發生的作用。
[0012] 一種ALK7在心肌肥厚中的功能，主要體現在ALK7基因具有保護心功能和抑制心 肌肥厚的作用，特別是ALK7基因能夠抑制主動脈弓縮窄引起的心肌肥厚發生的作用。
[0013] 針對ALK7的上述功能，提供一種ALK7的應用，主要體現為ALK7在保護心臟和治 療心肌肥厚中的應用，特別是ALK7在制備保護心臟功能和/或預防、緩解和/或治療心肌 肥厚的藥物中的應用。
[0014] 一種保護心臟功能的藥物，包含ALK7。
[0015] 一種預防、緩解和/治療心肌肥厚的藥物，包含ALK7。
[0016] 本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果： (1)本發明發現了 ALK7基因的新功能，S卩ALK7基因具有能夠保護心臟功能和抑制心肌 肥厚的作用。
[0017] (2)基于ALK7在保護心臟功能和抑制心肌肥厚疾病中的作用，其可以用于制備保 護心臟功能和/或預防、緩解和/或治療心肌肥厚的藥物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1是正常人和肥厚性心肌病患者心臟中ANP、Myh7、ALK7的表達，說明發生心肌 肥厚的心臟ALK7的表達下調（* :p < 0. 05 vs正常人組)。
[0019] 圖2是小鼠在假手術（Sham)和主動脈弓縮窄手術（AB)后心臟中ANP、Myh7、ALK7 的表達，說明發生心肌肥厚的心臟ALK7的表達下調；其中4W表不4周，8W表不8周（* :p <0· 05 vs野生型小鼠 Sham組）。
[0020] 圖3是SD乳鼠原代心肌細胞用腺病毒AdshRNA、Adsh ALK7、Ad-GFP和Ad-ALK7 感染，經Ang II刺激后的免疫熒光圖，結果表明ALK7的干擾腺病毒促進心肌細胞肥大，ALK7 的過表達腺病毒抑制心肌細胞肥大（* Φ < 0. 05 vs PBS組，# :p < 0. 05 vs Ang II組)。
[0021] 圖4是ALK7+/+和ALK7-/-小鼠 AB模型4周后HW/BW、LW/BW及HW/TL的統計柱 狀圖（* :p < 0. 05 vs野生型Sham組，# :p < 0. 05 vs野生型AB組）。
[0022] 圖5是ALK7+/+和ALK7-/-小鼠 AB模型4周后心臟組織HE染色及心肌細胞橫截 面積統計柱狀圖（* :p < 〇· 05 vs野生型Sham組，# p < 0· 05 vs野生型AB組)。
[0023] 圖6是ALK7+/+和ALK7-/-小鼠 AB模型4周后心臟組織天狼星紅染色及左室月父 原面積統計柱狀圖（* :P < 〇. 05 vs野生型Sham組，# :p < 0. 05 vs野生型AB組)。
[0024] 圖7是NTG和TG小鼠 AB模型4周后HW/BW、LW/BW及HW/TL的統計柱狀圖（* :p < 0· 05 vs NTG Sham 組，# :p < 0· 05 vs NTG AB 組）。
[0025] 圖8是NTG和TG小鼠 AB模型4周后心臟組織HE染色及心肌細胞橫截面積統計 柱狀圖（* :P < 〇· 05 vs NTG Sham 組，# :p < 0· 05 vs NTG AB 組）。
[0026] 圖9是NTG和TG小鼠 AB模型4周后心臟組織天狼星紅染色及左室膠原面積統計 柱狀圖（* Φ < 〇· 05 vs NTG Sham 組，# :p < 0· 05 vs NTG AB 組）。
[0027] 圖10是ALK7+/+和ALK7-/-小鼠 AB模型4周后心功能檢測結果。A是超聲檢測 心功能結果統計柱狀圖；B是血流動力學檢測心功能結果統計柱狀圖，其中，LVEDD為左室 舒張末期內徑、LVESD為左室收縮末期內徑、FS為短軸縮短率、EF為射血分數、dP/dt max 為左室內壓最大上升速率及dP/dt min為左室內壓最小上升速率（*:p< 0.05 vs野生型 Sham 組，# :p < 0· 05 vs 野生型 AB 組）。
[0028] 圖11是NTG和TG小鼠 AB模型4周后心功能檢測結果。A是超聲檢測心功能結 果統計柱狀圖；B是血流動力學檢測心功能結果統計柱狀圖，其中，LVEDD為左室舒張末期 內徑、LVESD為左室收縮末期內徑、FS為短軸縮短率、EF為射血分數、dP/dt max為左室內 壓最大上升速率及dP/dt min為左室內壓最小上升速率（* :p < 0. 05 vs NTG Sham組，# : p < 0· 05 vs NTG AB 組）。
[0029] 圖 12 是 ALK7+/+和 ALK7-/-小鼠 Sham及 AB 模型 4 周時 MEK1/2 / ERK1/2 信號通 路蛋白Western blot檢測圖，結果顯示ALK7敲除會促進MEK1/2和ERK1/2的磷酸化激活 水平，而對JNK1/2和P38的激活則無影響；其中"p-"代表磷酸化的激酶（MEKl/2，ERKl/2、 JNK1/2和P38)，"T-"代表總的(磷酸化的和未磷酸化的）激酶（MEK1/2, ERK1/2、JNK1/2和 P38)，GAPDH 用作內參（*:p<0. 05 vs 野生型 Sham 組，#:p<0. 05 vs 野生型 AB 組）。
[0030] 圖13是NTG和TG小鼠 Sham及AB模型4周時MEK1/2 / ERK1/2信號通路蛋白 Western blot檢測圖，結果顯示ALK7過表達會抑制MEK1/2和ERK1/2的磷酸化激活水平， 而對JNK1/2和P38的激活則無影響；其中"p-"代表磷酸化的激酶（MEKl/2，ERKl/2、JNKl/2 和P38)，"T-"代表總的(磷酸化的和未磷酸化的）激酶（MEK1/2, ERK1/2、JNK1/2和P38)， GAPDH 用作內參（* :p < 0· 05 vs NTG Sham 組，# :p < 0· 05 vs NTG AB 組）。
[0031] 圖14是ALK7+/+和ALK7-/-小鼠 Sham及AB模型4周時Smad2/Smad3信號通路 蛋白Western blot檢測圖，結果顯示ALK7敲除會促進Smad2和Smad3的磷酸化激活水平； 其中"P-"代表磷酸化的激酶（Smad2和Smad3)，"T_"代表總的(磷酸化的和未磷酸化的）激 酶（Smad2 和 Smad3)，GAPDH 用作內參（* :p < 0· 05 vs 野生型 Sham 組，# :p < 0· 05 vs 野 生型AB組)。
[0032] 圖15是NTG和TG小鼠 Sham及AB模型4周時Smad2/Smad3信號通路蛋白Western blot檢測圖，結果顯示ALK7過表達會抑制Smad2和Smad3的磷酸化激活水平；其中"p-"代 表磷酸化的激酶（Smad2和Smad3)，"T-"代表總的(磷酸化的和未磷酸化的）激酶（Smad2和 Smad3)，GAPDH 用作內參（* :p < 0· 05 vs NTG Sham 組，# :p < 0· 05 vs NTG AB 組）。

【具體實施方式】
[0033] 下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限 于此。
[0034] 實驗用動物及飼養 實驗動物：選用8-10周齡、體重在23. 5-27. 5g，背景為雄性C57BL/6的心臟特異性Cre 小鼠 （a -MHC-Cre (命名ALK7+/+)作為對照野生型小鼠，背景為C57BL/6,購自Jackson Laboratory，貨號 005650)、ALK7 基因敲除小鼠（ALK7-/-，購自 European Mouse Mutant Archive (EMMA)，貨號：EMMA02574)、心臟特異性ALK7轉基因小鼠（TG，心臟特異性ALK7轉 基因小鼠由武漢大學心血管病研究所李紅良教授實驗室構建）及非轉基因小鼠（NTG，同窩 對照非轉基因小鼠）為實驗對象。
[0035] 心臟特異性ALK7轉基因小鼠的構建： 用引物（上游引物：GTTGTCGACGCCACCATGCTAACCAACGGGAAAGA ;下游引物： GCCAAGCTTTACAGTCTTCCTTGA)擴增小鼠 ALK7 全長基因（NCBI，Gene ID:269275， XM_006498086. 1)，把擴增的ALK7全長基因連接于心肌肌球蛋白重鏈（α-MHC)啟動子 下游，將構建的序列通過顯微注射構造成受精胚胎（C57BL/6J背景)，得到心臟特異性 ALK7轉基因老鼠。（上述的轉基因小鼠參照下述文獻制備：Jiang DS，Bian ZY，Zhang Y, Zhang SM, Liu Y, Zhang R et al. Role of interferon regulatory factor 4 in the regulation of pathological cardiac hypertrophy. Hypertension 2013; 61:1193-1202. )〇
[0036] 飼養環境：所有實驗小鼠均飼養在武漢大學心血管病研究所SPF級實驗動物中 心。SRF級大小鼠飼料購自北京華阜康生物科技有限公司。飼養條件：室溫在22-24°C之 間，濕度在40-70%之間，明暗交替照明時間為12h，自由飲水攝食。
[0037] 實施例1 ALK7在正常人和肥厚性心肌病患者心臟中的表達 選用正常人心臟(非心臟原因的死亡捐獻的個體）和肥厚性心肌病患者心臟(做心臟 移植手術病人置換的受體)，對心臟提取蛋白質進行SDS-PAGE-免疫印跡試驗（Western blot)，結合特異性識別ALK7 (Abgent，AP7102b)蛋白和心肌細胞肥大標志物ANP (Millipore，AB2232)、Myh7 (santa cruz，sc53090)的抗體進行檢測，測定其 ALK7 的表達， GAPDH (Cell Signaling Technology, 2118)做內參。檢測結果如圖1所示，與正常人心臟 相比，肥厚性心肌病患者心臟心肌細胞肥大標志物ANP、Myh7的表達明顯上調，ALK7的表達 明顯下調。
[0038] 實施例2 ALK7在野生型小鼠 Sham組和AB手術4W、8W心臟中的表達 1.心肌肥厚模型采用主動脈弓縮窄手術，模型操作流程： 1. 1術前準備 (1)麻醉：先給小鼠稱重，按照90mg/kg體重計算所需麻藥（3%戊巴比妥鈉）量，通過腹 腔注射，并記錄注射時間點。夾尾、夾趾無明顯反應且小鼠狀態良好為麻醉成功標準(一般 注射后約lOmin無明顯反應，以麻醉后約50min小鼠夾趾有反應，麻醉后30min左右為最佳 手術時間）。
[0039] (2)術區準備：將小鼠左胸部、左側胸部及左前肢腋下的皮膚去毛。剃毛后用濕紗 布擦拭術區去除鼠毛，以不影響手術視野為宜。
[0040] (3)氣管插管：用橡皮筋將小鼠上門齒固定于V形板斜面上，并迅速將氣管插管經 聲門準確插入氣管內，隨后右側臥位置于加熱墊上(加熱墊需提前預熱)，然后將氣管插管 與呼吸機連接，固定小鼠。若小鼠的胸廓起伏與呼吸機頻率一致，說明氣管插管成功。
[0041] 1.2主動脈弓縮窄術 取右側臥位，小鼠左前肢置于右前肢上方，并用醫用膠帶將兩前肢固定。右胸部下方墊 入棉簽，抬高胸廓，依次用碘酒及體積分數為75%酒精對手術區域皮膚消毒。左手持眼科鑷 將左胸部皮膚捏起，右手持眼科剪剪開皮膚約lcm，依次分離肌肉及軟組織，于第2-3肋水 平打開胸腔，用棉簽稍撥開左肺，游離主動脈弓降支，將7-0手術縫線穿過血管，并在血管 上方平行放置一段26G (25. 0-27. 5g小鼠）或者27G (23. 5-25. Og)注射器針頭，將血管及 針頭一起結扎好，再抽出針頭即可達到相應程度的血管縮窄。結扎完畢后依次縫合，關閉胸 腔，用注射器從縫口處插入胸腔并抽出lcc氣體以恢復胸腔內負壓，拔出注射器后迅速縫 合皮膚切口。假手術組（Sham)在游離出主動脈降支后只穿線不結扎，其余步驟同心肌肥厚 (AB)模型組。
[0042] 1.3術后護理 主動脈弓降支結扎術后，待小鼠出現自主呼吸、夾趾出現強烈反應，拔出氣管插管，并 將小鼠放入裝有高壓滅菌過的墊料、飼料和飲用水的飼養籠內，于飼養室繼續飼養觀察。
[0043] 2.取材：打開分析天平，調零備用。再稱重處死小鼠。眼科彎鑷夾住心耳下方的 血管蒂，剪下心臟，迅速置于滅菌紗布上，輕輕擠壓心腔內液體，蘸干表面液體后，稱重并記 錄，將心臟放入相應的凍存管中，迅速置于液氮罐中，于-80°C冰箱保存后用于分子生物學 檢測。
[0044] 3. ALK7在Sham小鼠和AB小鼠心臟中的表達 分別選野生型Sham小鼠和AB手術后4周及8周的心臟，對心臟提取蛋白質進行 SDS-PAGE-免疫印跡試驗（Western blot)，結合特異性識別ALK7蛋白和心肌細胞肥大標志 物ANP、Myh7的抗體進行檢測，測定其ALK7的表達，檢測結果如圖2所示，心肌細胞肥大標 志物在AB術后ANP、Myh7的表達明顯上調，ALK7的表達在AB術后明顯下調。
[0045] 實施例3 ALK7干擾（Adsh ALK7)及過表達（Ad ALK7)腺病毒對Ang II刺激的原 代心肌細胞ALK7表達的影響 1.原代新生SD大鼠心肌細胞培養 (1)新生1天Sprague-Dawley乳鼠，頸部以下75%酒精消毒，用眼科剪和顯微鑷取下心 臟，放入盛有10mL DMEM/F12液的玻璃平皿中。再取另一只，重復以上過程。
[0046] (2)用DMEM/F12培養基清洗心臟，并將心臟剪成l-2mm3的碎片。轉入到放有轉子 的血清瓶中，吸去DMEM/F12,加入胰酶消化液。轉速為120r/min，消化15min，靜止數秒鐘， 棄去上清液。
[0047] (3)加入胰酶消化液，轉速為120r/min，消化15min。靜止數秒鐘，吸取上清液，用 20%小牛血清的DMEM/F12培養基終止消化，并置于4°C冰箱保存。重復該步驟，循環若干次。 取上清時應盡量取盡，當組織塊變白并明顯變小時，終止消化。
[0048] (4)將收集好的心肌細胞懸液，以1500rpm轉速離心8min，棄去上清液。在離心管 中加入適量培養基，輕柔吹打重懸細胞，集中至1個50mL離心管中，細胞懸液用細胞40 μ m 過濾網過濾。
[0049] (5)將細胞接種在100mm的培養皿中，差時貼壁90min，吸取未貼壁的細胞懸液過 濾。根據細胞懸液的總量加入Brdu (終濃度0. ImM)，混勻之后，加入到用0. 1%明膠包被的 器皿中。
[0050] (6)輕搖分散細胞，勿漩渦搖晃。37°C、5% C02孵育48小時用PBS清洗1次，更換 培養基。
[0051] 2. ALK7干擾（Adsh ALK7)及過表達（Ad ALK7)腺病毒對經Ang II誘導的心肌細 胞肥大模型的影響 AdshRNA (含 shRNA (沉默 RNA)的腺病毒，用作對照，SABIOSCIENCES 公司）、AdshALK7 (含shRNA-ALK7 (沉默RNA-ALK7融合蛋白）的腺病毒，購自SABIOSCIENCES公司，貨號 KR44935G)、AdGFP (含GFP (綠色熒光蛋白）的腺病毒，用作對照，購自Vector Biolabs公 司，貨號1060)及AdALK7 (含GFP-ALK7 (綠色熒光蛋白-ALK7融合蛋白）的腺病毒，購自 Vector Biolabs公司，貨號ADV-252020)腺病毒10 MOIs分別感染培養3天的原代心肌細 胞，12小時后用1 μ Μ血管緊張素 II (Ang II)(購自Sigma公司，A9525)或對照PBS刺激48 小時，然后進行免疫熒光試驗。結果表明AdshALK7感染后的心肌細胞表面面積較AdshRNA 對照組增加，而AdALK7感染的心肌細胞表面面積則比對照組AdGFP減少（圖3)。說明ALK7 的干擾腺病毒促進心肌細胞肥大，ALK7的過表達腺病毒抑制心肌細胞肥大。
[0052] 實施例4小鼠心肌肥厚（AB)模型心肌肥厚及纖維化檢測 1.心肌肥厚模型采用主動脈弓縮窄手術，模型操作流程： 選用8-10周齡、體重在23. 5-27. 5g的野生型小鼠、ALK7基因敲除小鼠、心臟特異性 ALK7轉基因小鼠及非轉基因小鼠各分成假手術組和心肌肥厚模型組，每組10只小鼠。造模 方法同實施例2。
[0053] 2.取材 (1)前期工作：預先準備裝有20mL的體積分數10%甲醛的尿杯，并貼好標簽(小鼠編號、 組別、手術類型及取材日期)。將倒滿質量分數10% KC1溶液的培養皿置于取材處。打開分 析天平，調零備用。再稱重處死小鼠。
[0054] (2)取材：眼科彎鑷夾住心耳下方的血管蒂，剪下心臟，迅速置于質量分數10% KC1 溶液中。待心臟停跳在舒張期后，置于滅菌紗布上，輕輕擠壓心腔內液體，蘸干表面液體后， 稱重并記錄，將心臟放入相應的尿杯中，固定48h后用于病理學檢測。
[0055] (3)相關測量及計算：取出小鼠肺臟，修剪后濾紙吸干，稱重并記錄。剪開小鼠后 肢脛骨處皮膚，測量并記錄脛骨長度。計算心重與體重的比值（HW/BW)，肺重與體重的比值 (LW/BW)以及心重與脛骨長度的比值（HW/TL)。
[0056] 3.病理學檢測 3. 1制備石錯標本切片 主要操作程序包括修剪心臟一包埋框處理一流水沖洗一脫水一透明一浸蠟一包埋一 切片一攤片一晾干或烘烤后備用。
[0057] 3.2蘇木精-伊紅（HE)染色 主要步驟為：55 °C烘烤30min -二甲苯5min，3次一100%酒精lmin - 95%酒精 lmin - 70%酒精lmin -雙蒸水lmin -蘇木素溶液(珠海貝索，BA-4021) 5min -水 洗lmin - 1%鹽酸酒精(取3mL濃鹽酸與297mL 70%酒精充分混合均勻）l-3s -水洗 lmin - Scott液(碳酸氫鈉0. 35g，七水硫酸鎂2g，兩者溶于100mL蒸饋水）lmin -水洗 lmin -伊紅溶液(珠海貝索，BA-4024) 3_5min -蒸饋水洗去浮色一70%酒精Is - 95%酒 精Is - 100%酒精30s，3次一二甲苯2min，3次一趁二甲苯未干立即封片一通風櫥內吹干， 顯微鏡拍照。
[0058] HE染色圖片統計：每張圖片選擇3個以上邊界清楚、核大致位于中央的細胞，用 Image-Pro Plus 6. 0軟件圈細胞面積。
[0059] 3. 3天狼星紅（PSR)染色 主要步驟為：55 °C烘烤30min -二甲苯2min，3次一100%酒精lmin - 95%酒 精lmin - 70%酒精lmin -流水沖洗lOmin -雙蒸水lmin -質量分數0. 2%磷鑰酸 2min - 0. 1%天狼猩紅苦味酸溶液滴于組織上，濕盒中染色90min -去除殘液一0. 01N鹽 酸4s - 70%酒精1次一90%酒精1次一100%酒精30s，3次一二甲苯2min，3次一趁二甲 苯未干立即蓋玻片封片，顯微鏡拍照。
[0060] PSR染色圖片統計（Image-Pro Plus 6. 0軟件):膠原比例=膠原面積/(總面積-空 白面積）X 1〇〇%。
[0061] 心肌組織由心肌細胞和間質組織組成，心臟是一終末分化器官，心肌細胞失去增 殖能力，各種生理或病理性刺激引起的心肌細胞反應，只能是單個細胞的體積增大而不能 在數量上增殖。因此，在心肌肥厚的病理生理過程中，主要表現為心肌細胞體積增大，肌節 數量增多，細胞排列紊亂，心臟間質改變包括心肌成纖維細胞的增殖與轉化，膠原纖維密度 增加，膠原分泌增加，膠原比例平衡失調等。
[0062] ALK7+/+和ALK7-/-小鼠 AB模型后的表型結果見圖4-6。Sham (假手術）組 中ALK7+/+小鼠和ALK7-/-小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL之間的差異均無統計學意義； ALK7+/+ 小鼠 AB 術后 4 周的 HW/BW、LW/BW、HW/TL 高于其 Sham 組；AB 術后 4 周，ALK7-/-小 鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL均較ALK7+/+小鼠升高（圖4)。HE染色切片可觀察到：Sham組 心臟無明顯差異，AB組較Sham組的心臟均增大，ALK7-/-小鼠的心臟明顯大于ALK7+/+組 小鼠；Sham組心肌肌原纖維細胞排列整齊、致密，形態完整，胞核及核仁結構清晰；AB組肌 絲排列紊亂、松散，心肌細胞體積明顯增大，形態不規整，胞核深染、增大、畸形，核仁模糊， ALK7-/-組則比ALK7+/+組細胞肥大明顯，差異有統計學意義（圖5 )。PSR染色后，發現AB組 心室心肌間質膠原含量較Sham組增加，動脈血管周圍膠原增加更為明顯，膠原增粗，排列 紊亂成網絡狀；ALK7-/-小鼠 AB術后膠原含量及血管周圍膠原含量則比ALK7+/+小鼠 AB術 后增加更為顯著（圖6)。以上結果說明經AB模型后，小鼠發生明顯的心肌肥厚，ALK7-/-小 鼠的心肌肥厚程度大于ALK7+/+小鼠。
[0063] 圖7-9是NTG和ALK7-TG小鼠 AB模型后的表型結果。同樣TG小鼠 AB術后4周 的HW/BW、LW/BW及HW/TL高于其Sham組；AB術后4周TG小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL增 大的程度明顯小于NTG小鼠（圖7)。心臟表型，AB組較Sham組的心臟均增大，且AB術后TG 小鼠心臟增大的程度遠小于NTG小鼠。HE染色切片可觀察到：TG小鼠 AB術后心肌細胞橫 截面積大于Sham組，顯著小于NTG小鼠 AB組（圖8)。PSR染色可見，TG小鼠 AB術后心肌 間質膠原含量及血管周圍膠原含量均小于NTG小鼠 AB組（圖9)。以上結果說明經AB模型 后，小鼠發生明顯的心肌肥厚，ALK7-TG小鼠的心肌肥厚程度小于NTG小鼠。
[0064] 實施例5心肌肥厚（AB)模型小鼠心功能檢測 1超聲檢測心功能 1. 1前期準備 (1)麻醉機準備：先連接氧氣瓶和麻醉機上的進氣接口，再擰開麻醉機上加藥口密封 蓋，迅速加入異氟烷至安全刻度后擰緊密封蓋。擰開氧氣瓶上總閥門，調整流量控制閥的旋 鈕，出氣壓力維持在〇· 2-0. 3mPa。
[0065] (2)待測小鼠準備：待檢測小鼠用異氟烷迅速麻醉后，左胸前區剃毛，將處理好的 小鼠頭部伸入麻醉劑導管套頭內，以1. 5-2. 0%異氟烷維持小鼠穩定的麻醉狀態。
[0066] 1.2心功能檢測 小鼠取左側臥位或仰臥位，并在剃毛區均勻涂抹超聲耦合劑(天津成信公司）。采用高 頻超聲診斷儀，頻率為15MHz，選取標準左心室乳頭肌短軸切面，測量、左室舒張末期內徑 (LVEDD)、左室收縮末期內徑（LVESD)及短軸縮短率（FS)。
[0067] 2心臟導管超聲（PV)檢測血流動力學 2. 1前期準備 (1)麻醉機準備：同超聲檢測心功能部分。
[0068] (2)待測小鼠準備：待檢測小鼠用異氟烷迅速麻醉后，頸部手術區剃毛，并用濕紗 布擦拭去毛。將處理好的小鼠頭部伸入麻醉劑導管套頭內，以1. 5-2. 0%異氟烷以維持麻醉 深度，避免麻醉過深或過淺。
[0069] 2. 2 PV 檢測 碘酒及75%酒精消毒后，剪開小鼠頸部皮膚，依次分離肌肉和軟組織，并游離出右頸總 動脈，于血管下穿過雙線并結扎遠心端，同時活結結扎近心端。用血管剪在遠心端剪一切口 (1/3-1/2管徑)，于體視顯微鏡下將Millarl. 4F超微導管迅速插入右頸總動脈，同時穿一 縫線將導管和血管結扎。打開近心端活結，將導管沿右頸總動脈-升主動脈插入左心室內， 連接Powerlab生物信號采集處理系統。觀察記錄儀上波形情況，調節導管的位置使波形圖 清晰且穩定。監測射血分數（EF)、左室內壓最大上升速率（dP/dt max)及左室內壓最小上 升速率（dP/dt min)等指標。
[0070] 本實施例運用Μ型超聲心動圖和血流動力學檢測評價心肌肥厚和心功能。圖10是 ALK7+/+和ALK7-/-小鼠 ΑΒ模型后心功能檢測結果圖。與ALK7+/+ Sham組相比，ALK7+/+ 小鼠 AB術后4周表現出心功能減弱和心肌肥厚，主要表現為心肌肥厚的指標LVEDD、LVESD 均不同程度的增加，而反映心功能的指標FS則下降。AB術后4周，ALK7-/-小鼠心肌肥厚 的指標增大的程度及反映心功能的指標下降的程度比ALK7+/+小鼠明顯（圖10A)。通過血 流動力學指標的檢測，觀察到AB術后4周ALK7+/+小鼠 EF、dP/dt max和dP/dt min均比 其Sham組降低，AB術后ALK7-/-小鼠與ALK7+/+小鼠 AB相比EF、dP/dt max和dP/dt min 顯著降低（圖10B)。這些結果均與ALK7-/-小鼠心肌肥厚更為顯著的結果一致。
[0071] 圖11是NTG和ALK7-TG小鼠 AB模型后的超聲和PV檢測結果。與NTG Sham組 相比，NTG小鼠 AB術后4周表現出心功能減弱和心肌肥厚。主要表現為心肌肥厚的指標 LVEDD、LVESD增大，而反映心功能的指標EF、FS則下降。AB術后4周，與NTG小鼠相比，TG 小鼠心肌肥厚的指標增大的程度及反映心功能的指標下降的程度則小于NTG組（圖11A)。 通過血流動力學指標的檢測，觀察到AB術后4周NTG小鼠 EF、dP/dt max和dP/dt min均 比其Sham組降低，TG小鼠 AB術后EF、dP/dt max和dP/dt min降低的程度則小于NTG組， 差異有統計學意義（圖11B)。這些結果均與TG小鼠心肌肥厚被抑制的結果一致。
[0072] 實施例6 ALK7基因敲除促進MEK1/2 / ERK1/2信號通路；ALK7基因過表達抑制 MEK/ERK信號通路 用野生型小鼠、ALK7基因敲除小鼠及心臟特異性ALK7轉基因小鼠和非轉基因小鼠 分別進行假手術和主動脈弓縮窄手術，然后在術后4周對各組小鼠心臟提取蛋白質進行 SDS-PAGE-免疫印跡試驗（Western blot)，檢測MAPK信號通路蛋白的表達情況，GAPDH (Cell Signaling Technology，2118)作為內參。結果顯示 AB 手術后 MEK1/2 / ERK1/2 信 號通路被激活，敲除 ALK7 基因后 p-MEKl/2(Cell Signaling Technology，9154)、p-ERKl/2 (Cell Signaling Technology,4370)的蛋白表達水平要高于其對照野生型小鼠組，而 p-JNKl/2 (Cell Signaling Technology,4668)、p_P38 (Cell Signaling Technology, 4511)則無顯著差異，總的蛋白 T-MEK1/2 (Cell Signaling Technology，9122)、T-ERKl/2 (Cell Signaling Technology,4695)、 T-JNK1/2 (Cell Signaling Technology,9258)、 T-P38 (Cell Signaling Technology, 9212)在Sham及AB的各組小鼠見均無明顯差異（圖 12) ;ALK7基因過表達后p-MEKl/2、p-ERKl/2的蛋白表達水平要低于其對照NTG小鼠，而 p-JNKl/2、p-P38 則無顯著差異，總的蛋白 1'-]\^1(1/2、1^服1/2、1'-見1(1/2、1'-?38在511&111及 AB的各組小鼠見均無明顯差異（圖13)。這表明在心肌肥厚模型中，ALK7基因介導的MAPK 信號通路，主要是通過MEK1/2、ERK1/2發揮作用，而不是JNK1/2和P38。
[0073] 實施例7 ALK7基因敲除促進Smad2/Smad3信號通路；ALK7基因過表達抑制 Smad2/Smad3信號通路 用野生型小鼠、ALK7基因敲除小鼠及心臟特異性ALK7轉基因小鼠和非轉基因小鼠 分別進行假手術和主動脈弓縮窄手術，然后在術后4周對各組小鼠心臟提取蛋白質進行 SDS-PAGE-免疫印跡試驗（Western blot)，檢測Smad2/Smad3信號通路蛋白的表達情況， GAPDH (Cell Signaling Technology，2118)作為內參。結果顯不 AB 手術后 Smad2/Smad3 信號通路被激活，敲除 ALK7 基因后 p_Smad2(Cell Signaling Technology, 3108)、p_Smad3 (Cell Signaling Technology,9520)的蛋白表達水平要高于其對照野生型小鼠組，總的蛋 白 T-Smad2 (Bioworld，BS1425)、T-Smad3 (Bioworld，BS3255)在 Sham 及 AB 的各組小鼠間 均無明顯差異（圖14) ;ALK7基因過表達后p-Smad2、p-Smad3的蛋白表達水平要低于其對 照NTG小鼠，總的蛋白T-Smad2、T_Smad3在Sham及AB的各組小鼠間均無明顯差異（圖15)。
[0074] 由以上結果可知發生心肌肥厚時，ALK7表達會下調，ALK7基因缺陷顯著促進了心 肌肥厚、纖維化，惡化心功能，ALK7基因過表達顯著抑制了心肌肥厚、纖維化，保護心功能。 因此ALK7基因具有保護心功能和抑制心肌肥厚及纖維化的作用，特別是ALK7基因能夠抑 制主動脈弓縮窄引起的心肌肥厚相關疾病發生的作用。
[0075] 上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。 SEQUENCE LISTING 〈110>武漢大學 〈120>激活素受體樣激酶7 (ALK7)在治療心肌肥厚中的功能及應用 <130> 1 <160> 2 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 〈223>上游引物 <400> 1 gttgtcgacg ccaccatgct aaccaacggg aaaga 35 <210> 2 〈211〉 24 〈212〉 DNA <213> Artificial Sequence 〈220〉 〈223>下游引物 〈400> 2 gccaagcttt acagtcttcc ttga 24
【權利要求】
1. ALK7在制備保護心臟功能的藥物中的應用。
2. -種保護心臟功能的藥物，其特征在于：包含ALK7。 3. ALK7在制備預防、緩解和/或治療心肌肥厚的藥物中的應用。
4. 一種預防、緩解和/或治療心肌肥厚的藥物，其特征在于：包含ALK7。
【文檔編號】A61P9/04GK104117058SQ201410379193
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年8月1日 優先權日:2014年8月1日
【發明者】李紅良, 蔣丁勝, 蔣曦, 張曉東 申請人:武漢大學