雙靶向固體脂質磁性納米粒及其制備方法
【專利摘要】本發明提供一種具有雙重靶向作用的固體脂質磁性納米粒，該磁性納米粒由F-68溶液、硬脂胺-半乳糖嫁接物、單甘脂、四氧化三鐵及油酸乙醇組成。通過硬脂胺、乳糖酸和碳二亞胺溶于無水乙醇中，得硬脂胺-半乳糖嫁接物，以水性溶劑擴散法制備脂質磁性納米粒。本發明提供的固體脂質磁性納米粒，可制備成一種對肝臟具有主動和被動雙重靶向功能的磁共振特異對比劑，可應用于生物醫學領域。利用這種對比劑，有望實現安全、快速的肝靶向分子影像成像；提高我國磁共振對比劑研發的自主創新能力，為開拓我國磁共振新型對比劑的研發，提供理論與技術基礎。
【專利說明】
雙靶向固體脂質磁性納米粒及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬化合物制備方法，涉及固體脂質磁性納米粒的合成方法，以及作為納米級肝組織雙靶向磁共振對比劑在生物醫學領域中的應用。
【背景技術】
[0002]磁共振成像(MRI)技術是目前對肝臟疾病，尤其是局灶性病變的診斷和鑒別診斷最有效的影像學檢查手段之一，能夠提供準確的解剖形態和功能信息，在分子成像中具有良好的應用前景。但是，MRI對分子探針探測的靈敏度低，要實現疾病的MR分子成像，必須要有足夠濃度的對比劑與相關分子靶點結合，并產生可分辨的MR信號改變。因此，制備安全有效的靶點特異性對比劑是MRI分子成像的關鍵所在，不僅可以減少成像所需對比劑的劑量，降低對比劑所致的毒副作用，還可以提高疾病早期診斷的準確性。
[0003]固體脂質納米粒(Solid lipid nanoparticles, SLN)是近年來正在發展的一種新型納米粒給藥系統，其為粒徑在l(Tl 000 nm之間的固態膠體顆粒。這種新型給藥載體使用無生物毒性的脂質作為基質，同時具備納米粒的物理穩定性高、可控制藥物釋放以及良好的靶向性等優勢，又兼具了脂質體、乳劑的毒性低、能大規模生產的優點，是一種極有發展前景的新型給藥載體。SLN以固態的天然或合成的類脂如單硬脂酸甘油酯、卵磷脂、三酰甘油等為載體材料，大多數為內源性物質，將藥物或造影劑包裹或內嵌于類脂核中制成酸態固體膠粒給藥系統，具有毫微粒和脂質體的雙重特點，起到避免藥物泄漏及良好的靶向性等優點，因其表面具有強疏水性，能夠提聞網狀內皮系統的吞曬率，從而大大提聞了藥物或造影劑在肝臟中的濃度，具有顯著的被動肝靶向作用。SLN還具有下列特點:(1)毒性低，SLN對不同細胞毒性(半數細胞致死量)介于400-500 μδ/πι1之間；(2)SLN采用脂肪酸等類脂為主要材料，具有較低的代謝毒性；(3)與其它載體如右旋糖酐比較，SLN納米粒表面為強疏水性，在體內易與調理蛋白結合，靜脈注射進入機體后，很快被Kupffer細胞吞噬而被動進入肝臟，具有顯著的被動肝靶向作用；(4) SLN具有細胞攝取及轉運能力，為疾病確診后的即時靶向治療提供可能。
[0004]去唾液酸糖蛋白受體(Asialoglycoprotein receptor, ASGPR)又稱肝凝集素受體或肝細胞半乳糖受體，是一種完全由哺乳動物肝竇狀隙的肝實質細胞特異性表達的膜表面蛋白，能夠特異性地識別帶有半乳糖殘基的糖蛋白，每個肝細胞表面有多達5 X 15個受體，而在肝炎、肝硬化、肝癌或等肝轉移癌等肝臟疾病時，其數量和功能均有所下降。半乳糖(Gal)是ASGPR的特異性配體，是肝靶向基團，具有誘導和提高肝細胞在細胞外基質支架材料上的粘附性能，半乳糖受體介導的載體交聯物已成為肝靶向研究的熱點之一。
【發明內容】
[0005]本發明的第一個目的是提供具有雙重靶向作用的固體脂質磁性納米粒。該磁性納米粒由F-68溶液(94%)、硬脂胺-半乳糖嫁接物(0.4%)、單甘脂(3.6%)、四氧化三鐵納米溶液(1%)及油酸乙醇(1%)等組成，其中的百分比為體積比。脂質材料為單甘脂。
[0006]擬將經Gal修飾后的SLN作為肝靶向特異對比劑載體，構建經USP1標記的肝雙靶向特異對比劑，可能大大提高對比劑靶向性，而有望降低對比劑注射劑量，最終實現降低對比劑對全身毒副作用的目的。
[0007]本發明的第二個目的是提供固體脂質磁性納米粒的制備方法，通過以下方案實現:
(I)硬脂胺-半乳糖嫁接物的合成
取市售硬脂胺、乳糖酸和碳二亞胺(EDC，18.4 mmol)溶于一定量的無水乙醇中，在室溫下攪拌反應72 h后，加水沉淀產物，離心分離后所得沉淀經干燥后，得硬脂胺-半乳糖嫁接物，其結構通過紅外光譜(FTIR)和氫譜核磁共振(1H NMR)進行確證。
[0008](2)肝雙重靶向脂質磁性納米粒的制備
以水性溶劑擴散法制備脂質磁性納米粒。具體方法為:將一定量油溶性的Fe3O4 (粒徑為5 nm，濃度為5 mg/ml)為核心的磁性納米粒溶液超聲分散于F-68溶液(Poloxamer 188，
0.1 %,w/v)中，探頭持續超聲30 min (600 w,工作2 s,間歇3 s)后,加入10 mg/ml的油酸乙醇溶液，探頭超聲5 min，以得到Fe3O4納米粒分散液。分別取單甘脂和硬脂胺-半乳糖嫁接物，并溶于一定量的無水乙醇中，水浴70°C加熱使其完全融解；在水浴70°C的超聲條件下，將脂質的乙醇溶液快速注入到Fe3O4納米粒分散液中，持續超聲5 min后,最終得到肝雙祀向脂質磁性納米粒。
[0009]本發明的第三個目的是提供所述固體脂質磁性納米粒在制備對肝臟具有雙重靶功能的磁共振對比劑中的應用。
[0010]本發明在我們前期的研究工作基礎上，采用乳糖酸(LA)和硬脂胺(ODA)之間的化學耦合反應制備半乳糖-硬脂胺嫁接物，在此基礎上，以單甘脂為脂質材料，采用水性溶劑擴散法制備對肝臟具有雙重靶向功能的脂質磁性納米粒。該材料的出現、以及經過進一步的載體應用研究，將大大推動肝臟的靶向磁共振對比劑發展。
[0011]本發明所提供的固體脂質磁性納米粒，可制備成一種對肝臟具有主動和被動雙重靶向功能的新型磁共振特異對比劑，可應用于生物醫學領域。利用這種對比劑，有望實現安全、快速的肝靶向分子影像成像；提高我國磁共振對比劑研發的自主創新能力；為開拓我國磁共振新型對比劑的研發，提供理論與技術基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1為本發明肝組織雙靶向脂質磁性納米粒的制備路線圖。
[0013]圖2為嫁接物的紅外光譜。
[0014]圖3為嫁接物的1H核磁共振圖譜。
[0015]圖4為脂質磁性納米粒的透射電子顯微鏡(TEM)觀察。
[0016]圖5為脂質磁性納米粒與L02細胞系共孵育48 h后細胞的存活情況。
[0017]圖6為脂質磁性納米粒在L02細胞上不同時間點(I h、4 h和12 h)的攝取情況。
[0018]圖7為不同鐵濃度(Pg/ml)的脂質磁性納米粒的T2*WI磁共振圖像。
【具體實施方式】
[0019]本發明結合附圖和實施例作進一步的說明。
[0020]實施例一:硬脂胺-半乳糖嫁接物的合成
取市售硬脂胺(ODA，Mw:269.5)、乳糖酸(LA，Mw:358.3)和碳二亞胺(EDC，18.4 mmol)溶于一定量的無水乙醇中，在室溫下攪拌反應72 h后，加水沉淀產物，離心分離后所得沉淀經干燥后，得硬脂胺-半乳糖嫁接物。將冷凍干燥后的嫁接物樣品經傅里葉紅外光譜儀檢測樣品表面官能基團。將嫁接物溶于D2O中，濃度為20 mg/ml，用核磁共振儀進行檢測并記錄核磁共振氫譜，對其特征峰進行結構分析。
[0021]參見圖2，結果顯示，在LA、ODA和Gal-ODA的紅外光譜中，LA在1730(^1及1070cm—1附近出現了 LA尖銳的羧基特征吸收峰和羥基的C-O伸縮振動峰，但在Gal-ODA的紅外光譜圖中LA的羧基特征吸收峰消失，但羥基的C-O伸縮振動峰卻出現在了 Gal-ODA的紅外光譜中。另外，ODA在3000CHT1附近的烷基(-CH2-)特征吸收峰在Gal-ODA中得以完整的保留下來。說明LA的羧基和ODA中的氨基已成功結合在了一起。
[0022]參見圖3，結果顯示，LA的核磁共振氫譜圖上，在化學位移12.01-13.12 ppm處，出現了一個明顯的單信號峰，該峰可歸屬于LA中的羧基峰，而在Gal-ODA的核磁共振氫譜圖中可以看出，該處的單信號峰已經消失；在化學位移7.25-7.83 ppm處出現了一個不規整的寬峰信號，該峰歸屬于酰胺中的-NH-質子峰信號；在化學位移4.79 -5.46 ppm處，Gal-ODA的核磁共振氫譜圖上出現了一個尖銳的質子峰信號，該峰與LA上的-O-CH-O-質子峰相對應。說明ODA已經成功嫁接到了 LA上。
[0023]實施例二:
1、脂質磁性納米粒的制備及理化性質測定
以水性溶劑擴散法制備脂質磁性納米粒。具體方法為:將一定量油溶性的Fe3O4 (粒徑為5 nm，濃度為5 mg/ml)為核心的磁性納米粒溶液超聲分散于F-68溶液(Poloxamer 188，
0.1 %,w/v)中，探頭持續超聲30 min (600 w,工作2 s,間歇3 s)后,加入10 mg/ml的油酸乙醇溶液，探頭超聲5 min，以得到Fe3O4納米粒分散液。分別取單甘脂和硬脂胺-半乳糖嫁接物，并溶于一定量的無水乙醇中，水浴70°C加熱使其完全融解；在水浴70°C的超聲條件下，將脂質的乙醇溶液快速注入到Fe3O4納米粒分散液中，持續超聲5 min后,最終得到肝雙靶向脂質磁性納米粒。參見圖1。
[0024]取脂質磁性納米粒溶液適量，用一定量的去離子水進行稀釋，用3000 HS粒度及表面電位分析儀分別測定納米粒的粒徑、表面電位及多分散指數。
[0025]將一定濃度的脂質磁性納米粒樣品滴于覆蓋有碳膜的銅網(300目)上，用濾紙吸去多余的液體后，用2 % (w/v)磷鎢酸進行染色I min，干燥后透射電鏡觀察其形態及粒徑大小。
[0026]經測定，脂質磁性納米粒的粒徑、多分散指數及表面電位見表I。
[0027]參見圖4，結果顯示，脂質磁性納米粒具有較好的粒徑分布，外觀呈球形或橢圓形，大小近乎均勻一致，其內可見包裹的黑色Fe3O4納米顆粒。
表1:脂質磁性納米粒的粒徑、多分散指數及表面電位_
[0028]樣品__多分散指數(PI)粒徑(nm) Zeta電位(mV)
脂質磁性納米粒 I 0.24±0.0353.47士3.39 -30.68±?.Ι0
2、脂質磁性納米粒細胞毒性研究本研究采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法(MTT Assay)對制備的脂質磁性納米粒的細胞毒性進行評價。取對數生長期的人正常肝細胞L02細胞，經胰酶消化后，用含10%胎牛血清的細胞培養液調整細胞密度為5 X 14個/ml，然后接種于96孔細胞培養板，每孔0.2ml, 37°C, 5% CO2細胞培養箱中孵育24 h，待細胞完全貼壁生長后，加入不同濃度的脂質磁性納米粒溶液，以未處理的空白細胞為對照，每孔設3個平行組。繼續培養48 h后，每孔加入20 μ?的MTT溶液(濃度為5.0 mg/ml),于細胞培養箱中繼續孵育4 h，棄去上清液，每孔加入100 μ? 二甲基亞砜，恒溫振蕩20 min，用酶標儀測定570 nm處吸光度，計算細胞存活率。
[0029]參見圖5，結果顯示，在L02細胞培養液中各加入不同Fe3O4含量(最大濃度100 μδ/ml)的脂質磁性納米粒并孵育48 h后，L02細胞的存活率都高于80%，結果表明本研究所制備的脂質磁性納米粒具有低毒性，其應用將得益于對臨床接受磁共振造影檢查患者的安全性。
[0030]3、脂質磁性納米粒細胞攝取
取適量的異硫氰基熒光素(FITC)溶解于10 ml的無水乙醇中，加入一定量的硬脂胺-半乳糖嫁接物，室溫下避光攪拌反應24 h。然后加入100 ml的去離子水，析出物用布氏漏斗過濾，室溫下自然干燥，以獲得異硫氰基熒光素標記的嫁接物粉末，避光保存備用。
[0031]將一定量油溶性的Fe3O4 (粒徑為5 nm，濃度為5 mg/ml)為核心的磁性納米粒溶液超聲分散于F-68溶液(Poloxamer 188,0.1 %，w/v)中,探頭持續超聲30 min (600 w, X作2 S，間歇3 s)后,加入10 mg/ml的油酸乙醇溶液,探頭超聲5 min,以得到Fe3O4納米粒分散液。分別取單甘脂和異硫氰基熒光素標記的嫁接物，并溶于一定量的無水乙醇中，水浴70°C加熱使其完全融解；在水浴70°C的超聲條件下，將脂質的乙醇溶液快速注入到Fe3O4納米粒分散液中，持續超聲5 min后，最終得到硫氰基熒光素標記的脂質磁性納米粒溶液。
[0032]以人正常肝細胞L02細胞為模型細胞，在37°C，5% CO2條件下培養細胞至呈對數生長期后，離心收集，按每孔I X 15個細胞的密度接種24孔培養板，孵箱內預培養24小時。在培養液中加入異硫氰基熒光素標記的脂質磁性納米粒溶液孵育。培養一定時間后，用激光共聚焦顯微鏡觀察。結果顯示，脂質磁性納米粒能快速被細胞所攝取。圖6為脂質磁性納米粒與L02細胞共孵育后的熒光顯微鏡照片。由圖6可知，隨著時間的延長，所觀察到的綠色熒光強度逐漸增強，說明隨著時間的延長，L02細胞對脂質磁性納米粒的攝取逐漸增多，即脂質磁性納米粒在L02細胞系上的攝取具有時間依賴性。
[0033]實施例三:脂質磁性納米粒樣品磁共振掃描
通過測定磁共振掃描的T2*弛豫時間的變化來衡量脂質磁性納米粒的磁敏感性。將制備好的不同濃度(0、1、10、15、25、50、100 μδ/πι1)的脂質磁性納米粒懸液分別裝入2.0 ml的Eppendorf管內，放置在裝滿水的試管盒中，在GE 3.0T全身磁共振下用八通道頭線圈進行掃描。
[0034]參見圖7，結果顯示，在ESWAN圖像上隨著脂質磁性納米粒懸液中終鐵濃度的增力口，T2*信號強度逐漸減低，說明本實驗所制備的脂質磁性納米粒具有負性強化效果，即在一定濃度范圍之內，脂質磁性納米粒濃度越高，其負性強化效果越明顯。結果提示，本發明可作為磁共振對比劑具有應用于體內外成像的可行性。
[0035]無需進一步詳細闡述，相信采用前面所公開的內容，本領域的技術人員可最大限度地應用本發明。因此，前面的實施方案應理解為僅是舉例說明，而并非以任何方式限制本發明的應用范圍。所以本發明的主要范圍將由附屬的權利要求及其等同體來確定。
【權利要求】
1.一種雙重祀向固體脂質磁性納米粒，其特征在于，該磁性納米粒由94%F-68溶液、0.4%硬脂胺-半乳糖嫁接物、3.6%單甘脂、1%四氧化三鐵及1%油酸乙醇組成。
2.權利要求1所述的一種雙重靶向固體脂質磁性納米粒的制備方法，其特征在于，通過以下步驟實現: (1)硬脂胺-半乳糖嫁接物的合成 取市售硬脂胺、乳糖酸和碳二亞胺，溶于無水乙醇中，在室溫下攪拌反應72 h后，加水沉淀產物，離心分離后所得沉淀經干燥后，得硬脂胺-半乳糖嫁接物，其結構通過紅外光譜和氫譜核磁共振進行確證； (2)肝雙重靶向脂質磁性納米粒的制備 將油溶性的粒徑為5 nm，濃度為5 mg/ml的Fe3O4為核心的磁性納米粒溶液超聲分散于F-68溶液中，探頭持續超聲30 min,加入10 mg/ml的油酸乙醇溶液,探頭超聲5 min,以得到Fe3O4納米粒分散液，分別取單甘脂和硬脂胺-半乳糖嫁接物，并溶于無水乙醇中，水浴70°C加熱使其完全融解，在水浴70°C的超聲條件下，將脂質的乙醇溶液快速注入到Fe3O4納米粒分散液中，持續超聲5 min后,最終得到肝雙祀向脂質磁性納米粒。
3.權利要求1所述的固體脂質磁性納米粒在制備對肝臟具有雙重靶向功能的磁共振對比劑中的應用。
【文檔編號】A61K49/18GK104174038SQ201410353518
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年7月24日 優先權日:2014年7月24日
【發明者】余日勝, 朱修良, 杜永忠, 揭麗勇, 陳英, 施丹, 王穎 申請人:浙江大學