一種水酶法-半仿生法提取虎杖中總蒽醌的方法
【專利摘要】本發明公開了一種水酶法-半仿生法提取虎杖中總蒽醌的方法，包括以下步驟：1)稱虎杖藥材粉末，加入水解酶反應液，并調節至適宜pH值，攪拌均勻，酶解4～8h后高溫滅活酶，過濾；2)酶解后的虎杖藥材中加入檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液調節pH值為1.5～3.0，提取后過濾；3)濾渣加入檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液調節pH值為6.5～7.5，提取后過濾；4)濾渣加入檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液調節pH值為8.0～8.5，提取后過濾；5)合并1)～4)濾液，濃縮并真空干燥，得到含有虎杖蒽醌的提取物。本方法避免使用有機溶劑，與其他輔助提取方法，如微波提取、超聲提取相比，提取率高，提取設備簡單，提取條件溫和，是一種環境友好，適宜工業化生產的提取方法。
【專利說明】一種水酶法-半仿生法提取虎杖中總蒽醌的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于天然產物提取【技術領域】，涉及一種蒽醌的提取方法，具體涉及一種水酶法-半仿生法提取虎杖中總蒽醌的方法。
【背景技術】
[0002]虎杖為寥科廖屬植物虎杖的根和根莖，是我國傳統中藥，味苦性寒，有活血定痛、清熱利濕、化痰止咳等功效。臨床用于濕熱黃疸、肺熱咳嗽、瘡癰腫痛、跌打損傷等癥。虎杖中主要含有蒽醌類、芪類、黃酮、酚酸類成分，這些成分具有抗菌、抗血栓、降脂等重要生理活性。虎杖蒽醌是其重要抗菌成分，其提取多采用有機溶劑提取，成本高、環境污染大，還有用微波提取、超聲提取，對設備要求高。因此，開發以水為溶媒的環境友好的提取方式具有重要意義。
[0003]水酶法是一種較為高效環保的提取方法，但是提取效率不高，一定程度上造成了藥材資源的浪費。半仿生提取法是模擬藥物進入胃腸道環境，從生物藥劑學的角度設計的一種新的提取工藝。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供一種水酶法-半仿生法提取虎杖中總蒽醌的方法，該方法將水酶法與半仿生法相結合用于虎杖中總蒽醌的提取，能夠顯著提高提取效率，操作簡單，對設備要求低，適合工業化大規模生產的需求。
[0005]本發明是通過以下技術方案來實現:
[0006]一種水酶法-半仿生法提取虎杖中總蒽醌的方法，包括以下步驟:
[0007]I)首先，取虎杖粉末，按Ig: (5?20)mL的料液比向虎杖粉末中加入水解酶反應液，充分混勻，調節PH值至4.0?5.5，然后在45?55°C的攪拌條件下，酶解4?8小時，再經高溫滅活酶處理，最后進行過濾；
[0008]其中，每10mL水解酶反應液是按照每10mL蒸餾水中加入125mg纖維素酶的比例將纖維素酶溶解于蒸餾水中制成；
[0009]2)向步驟I)過濾后的濾渣中加入檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液，充分混勻，調節pH值至1.5?3.0,水浴提取后過濾；
[0010]3)向步驟2)過濾后的濾渣中加入檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液，充分混勻，調節pH值至6.5?7.5,水浴提取后過濾；
[0011]4)向步驟3)過濾后的濾渣中加入檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液，充分混勻，調節pH值至8.0?8.5,水浴提取后過濾；
[0012]5)將步驟I)?4)過濾得到的濾液合并，回收溶劑后干燥處理，得到的得到包含虎杖總蒽醌的干浸膏。
[0013]步驟I)所述的高溫滅活酶處理是將酶解處理后的反應體系的水浴溫度升高至80。。，加熱 1min。
[0014]步驟2)、3)、4)中濾渣與檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液的反應料液比為Ig: (10?22)mL。
[0015]步驟2)、3)、4)所述的水浴提取溫度為50?80°C。
[0016]步驟2) ,3),4)所述的水浴提取時間為I?3h。
[0017]步驟5)所述的回收溶劑后干燥處理是將合并后的濾液減壓濃縮后在60?80°C下進行真空干燥處理。
[0018]所述虎杖粉末是將虎杖藥材清洗干凈后，經粉碎過篩、烘干至恒重后制得。
[0019]與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果:
[0020]本發明采用水酶法結合半仿生法的方法從虎杖中提取總蒽醌，所采用的提取方法均不使用有機溶劑，避免了環境污染問題并降低了操作成本。在提取過程中首先加入水酶解反應液進行酶解處理，該水酶解反應液是將能夠消解植物細胞壁的纖維素酶溶液蒸餾水中制成，在的攪拌條件下進行酶解，能夠對虎杖藥材的細胞壁進行最大限度的分解破壞，從而降低了傳質阻力，更有利于有效成分的溶出。且在酶解時調節溶液PH值至酶的最適pH值(4.0?5.5)，并采用最適反應溫度(45?55°C)，以利于酶發揮效用。酶解后更利于總蒽醌的提取，提高了提取效率。在半仿生法在提取過程中符合中藥臨床應用的特點，模擬口服藥物在胃腸道轉運吸收的過程。本發明采用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖體系作為半仿生法的提取溶劑，通過設置不同的PH值梯度，達到模擬藥物在體內轉運吸收過程的目的。
[0021]本發明采用的水酶法-半仿生法提取虎杖中的總蒽醌，與超聲輔助提取法和微波輔助提取法相比，提取率有明顯提高，且對設備的要求低。本發明的提取條件溫和、成本低廉、環境友好、適合大規模工業化生產，具有良好的應用前景。
【具體實施方式】
[0022]下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。
[0023]實施例1
[0024]一種水酶法-半仿生法提取虎杖中總蒽醌的方法，包括以下步驟:
[0025]I)虎杖藥材的處理:虎杖藥材清洗干燥，粉粹過篩，烘干至恒重，得虎杖藥材粉末；
[0026]2)水酶法提取:準確稱取1g虎杖藥材粉末，按Ig:16mL的料液比向虎杖粉末中加入水解酶反應液，混勻后，調節PH值至4.5，在攪拌條件下，于50°C水浴中酶解6小時，升高水浴溫度至80°C，加熱10分鐘，冷卻過濾；其中，所述水解酶反應液是按照每10mL蒸餾水中加入125mg纖維素酶的比例將纖維素酶溶解于蒸餾水中制成；
[0027]3)半仿生法提取:按照料液比lg: 18mL的料液比，向步驟I)過濾的濾渣中加入檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液，調節PH值為2.0，攪拌均勻，在70°C水浴中提取2h后，過濾；濾渣按照以上料液比加入檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液調節PH值為7.5，70°C水浴提取2h后過濾；濾渣再次按照以上料液比加入檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液調節PH值為8.0，70°C水浴提取2h后過濾；
[0028]4)將步驟2)、3)中過濾得到的所有濾液合并，在旋轉蒸發儀上濃縮至流浸膏，而后在真空干燥箱中以60°C真空干燥，獲得含有虎杖蒽醌的干浸膏7.08go
[0029]對虎杖蒽醌干浸膏中的大黃素含量進行測定:
[0030]1、大黃素標準曲線的建立
[0031]精密稱取1mg大黃素標準品至10mL容量瓶中，加入甲醇:0.015mol/L磷酸水溶液(80:20)作溶劑定容至刻度，搖勻。分別精密量取上述標準溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL至六個1mL容量瓶中，加入溶劑定容至刻度，搖勻，得到大黃素溶液濃度分別為 0.002mg/mL、0.004mg/mL、0.006mg/mL、0.008mg/mL、0.010mg/mL、0.012mg/mL。用0.25ym微孔濾膜過濾，分別進樣20yL，每個濃度進樣3次。流動相為甲醇:0.015mol/L磷酸水溶液(80:20)，等度洗脫，紫外檢測波長為284nm，色譜柱為DiamonsilC18 (5 μ m, 250X4.6mm),流速為1.0mL/min。以平均峰面積值為縱坐標,大黃素濃度為橫坐標，繪制標準曲線，獲得線性方程為Y = 254155.29X-5173.93 (R2 = 0.9997)，濃度范圍為
0.002 ?0.012mg/mL。
[0032]2、提取物中大黃素含量測定
[0033]精密稱取1mg上述干浸膏，至于1mL容量瓶中，加入流動相做溶劑定容至刻度，搖勻，過濾，進樣20 μ L，進樣3次，求取平均值。測得干浸膏中大黃素含量為6.95mg/10g藥材。
[0034]3、方法學考察
[0035]I)精密度:精密量取0.lmg/mL大黃素標準溶液lmL，置于1mL容量瓶中，加流動相溶液作為溶劑定容至刻度，搖勻，過濾，進樣20 μ L，重復進樣6次。測得相對標準偏差(RSD)為 1.27%。
[0036]2)重復性:取上述提取浸膏100.32mg,置于25mL容量瓶中，加流動相溶液定容至刻度，搖勻。再精密量取2mL上述溶液至1mL容量瓶中，加流動相溶液定容至刻度，搖勻，過濾，進樣20μ L，重復進樣5次。測得相對標準偏差為1.73%。
[0037]3)加標回收率:精密稱取上述提取浸膏199.78mg，分別加入其中大黃素含量80%，100%及120%的大黃素標準品，置于25mL容量瓶中，加流動相溶液定容至刻度，搖勻。再分別精密量取5mL該溶液置于50mL容量瓶中，加流動相溶液定容至刻度，搖勻，過濾。進樣20 μ L。按照如下公式計算加標回收率:加標回收率=(加標試樣測定值-試樣測定值)/加標量X 100%。最終計算獲得加標回收率為101.38%，相對標準偏差為2.97%。
[0038]實施例2
[0039]一種水酶法-半仿生法提取虎杖中總蒽醌的方法，包括以下步驟:
[0040]I)虎杖藥材的處理:虎杖藥材清洗干燥，粉粹過篩，烘干至恒重，得虎杖藥材粉末；
[0041]2)水酶法提取:準確稱取1g虎杖藥材粉末，按Ig =1mL的料液比向虎杖粉末中加入水解酶反應液，混勻后，調節PH值至4.5，在攪拌條件下，于50°C水浴中酶解7小時，升高水浴溫度至80°C，加熱10分鐘，冷卻過濾；其中，所述水解酶反應液是按照每10mL蒸餾水中加入125mg纖維素酶的比例將纖維素酶溶解于蒸餾水中制成；
[0042]3)半仿生法提取:按照料液比lg: 14mL的料液比，向步驟I)過濾的濾渣中加入檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液，調節PH值為2.0，攪拌均勻，在80°C水浴中提取2h后，過濾；濾渣按照以上料液比加入檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液調節PH值為7.5，80°C水浴提取2h后過濾；濾渣再次按照以上料液比加入檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液調節PH值為8.0，80°C水浴提取2h后過濾；
[0043]4)將步驟2)、3)中過濾得到的所有濾液合并，在旋轉蒸發儀上濃縮至流浸膏，而后在真空干燥箱中以60°C真空干燥，獲得含有虎杖蒽醌的干浸膏7.02g。
[0044]對提取物中大黃素含量測定:精密稱取1mg上述干浸膏，至于1mL容量瓶中，力口入流動相做溶劑定容至刻度，搖勻，過濾，進樣20 μ L，進樣3次，求取平均值。測得干浸膏中大黃素含量為3.87mg/10g藥材。
[0045]實施例3
[0046]—種水酶法-半仿生法提取虎杖中總蒽醌的方法，包括以下步驟:
[0047]I)虎杖藥材的處理:虎杖藥材清洗干燥，粉粹過篩，烘干至恒重，得虎杖藥材粉末；
[0048]2)水酶法提取:準確稱取1g虎杖藥材粉末，按Ig:15mL的料液比向虎杖粉末中加入水解酶反應液，混勻后，調節PH值至4.0，在攪拌條件下，于55°C水浴中酶解6小時，升高水浴溫度至80°C，加熱10分鐘，冷卻過濾；其中，每10mL水解酶反應液是按照每10mL蒸餾水中加入125mg纖維素酶的比例將纖維素酶溶解于蒸餾水中制成；
[0049]3)半仿生法提取:按照料液比lg:22mL的料液比，向步驟I)過濾的濾渣中加入檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液，調節PH值為2.0，攪拌均勻，在70°C水浴中提取1.5h后，過濾；濾渣按照以上料液比加入檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液調節pH值為7.5，70°C水浴提取1.5h后過濾；濾渣再次按照以上料液比加入檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液調節PH值為8.0, 700C水浴提取1.5h后過濾；
[0050]4)將步驟2)、3)中過濾得到的所有濾液合并，在旋轉蒸發儀上濃縮至流浸膏，而后在真空干燥箱中以60°C真空干燥，獲得含有虎杖蒽醌的干浸膏7.83g。
[0051]對提取物中大黃素含量測定:精密稱取1mg上述干浸膏，至于1mL容量瓶中，力口入流動相做溶劑定容至刻度，搖勻，過濾，進樣20 μ L，進樣3次，求取平均值。測得干浸膏中大黃素含量為3.34mg/10g藥材。
[0052]實施例4
[0053]一種水酶法-半仿生法提取虎杖中總蒽醌的方法，包括以下步驟:
[0054]I)虎杖藥材的處理:虎杖藥材清洗干燥，粉粹過篩，烘干至恒重，得虎杖藥材粉末；
[0055]2)水酶法提取:準確稱取1g虎杖藥材粉末，按Ig:5mL的料液比向虎杖粉末中加入水解酶反應液，混勻后，調節PH值至5.0，在攪拌條件下，于45°C水浴中酶解8小時，升高水浴溫度至80°C，加熱10分鐘，冷卻過濾；其中，每10mL水解酶反應液是按照每10mL蒸餾水中加入125mg纖維素酶的比例將纖維素酶溶解于蒸餾水中制成；
[0056]3)半仿生法提取:按照料液比lg:1OmL的料液比，向步驟I)過濾的濾渣中加入檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液，調節PH值為1.5，攪拌均勻，在50°C水浴中提取3h后，過濾；濾渣按照以上料液比加入檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液調節PH值為6.5，50°C水浴提取3h后過濾；濾渣再次按照以上料液比加入檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液調節PH值為8.3，50°C水浴提取3h后過濾；
[0057]4)將步驟2)、3)中過濾得到的所有濾液合并，在旋轉蒸發儀上濃縮至流浸膏，而后在真空干燥箱中以70°C真空干燥，獲得含有虎杖蒽醌的干浸膏7.57g。
[0058]實施例5
[0059]一種水酶法-半仿生法提取虎杖中總蒽醌的方法，包括以下步驟:
[0060]I)虎杖藥材的處理:虎杖藥材清洗干燥，粉粹過篩，烘干至恒重，得虎杖藥材粉末；
[0061]2)水酶法提取:準確稱取1g虎杖藥材粉末，按Ig:20mL的料液比向虎杖粉末中加入水解酶反應液，混勻后，調節PH值至5.5，在攪拌條件下，于55°C水浴中酶解4小時，升高水浴溫度至80°C，加熱10分鐘，冷卻過濾；其中，每10mL水解酶反應液是按照每10mL蒸餾水中加入125mg纖維素酶的比例將纖維素酶溶解于蒸餾水中制成；
[0062]3)半仿生法提取:按照料液比lg: 15mL的料液比，向步驟I)過濾的濾渣中加入檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液，調節PH值為3.0，攪拌均勻，在80°C水浴中提取Ih后，過濾；濾渣按照以上料液比加入檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液調節PH值為7.2，80°C水浴提取Ih后過濾；濾渣再次按照以上料液比加入檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液調節PH值為8.5，80°C水浴提取Ih后過濾；
[0063]4)將步驟2)、3)中過濾得到的所有濾液合并，在旋轉蒸發儀上濃縮至流浸膏，而后在真空干燥箱中以80°C真空干燥，獲得含有虎杖蒽醌的干浸膏7.24g。
[0064]對比例I
[0065]超聲輔助提取法提取虎杖中總蒽醌的方法，包括以下步驟:
[0066](I)虎杖藥材的處理:虎杖藥材清洗干燥，粉粹過篩，烘干至恒重，得虎杖藥材粉末。
[0067](2)超聲輔助提取:準確稱取三份虎杖藥材粉末各10g，按照料液比1:40加入蒸餾水，50°C預熱20分鐘后，采用超聲輔助萃取，超聲功率為10kW/m3，占空比為2:1，超聲時間為I小時。重復提取3次，合并濾液。
[0068](3)制作浸膏:3次提取的濾液分別合并，在旋轉蒸發儀上濃縮至流浸膏，而后在真空干燥箱中以60°C真空干燥，獲得含有虎杖蒽醌的干浸膏的平均質量為3.31g。
[0069](4)提取物中大黃素含量測定:分別精密稱取1mg上述干浸膏，至于1mL容量瓶中，加入流動相做溶劑定容至刻度，搖勻，過濾，進樣20 μ L，進樣3次，求取平均值。測得干浸膏中大黃素含量為1.43mg/10g藥材。
[0070]對比例2
[0071]微波輔助提取法提取虎杖中總蒽醌的方法，包括以下步驟:
[0072](I)虎杖藥材的處理:虎杖藥材清洗干燥，粉粹過篩，烘干至恒重，得虎杖藥材粉末。
[0073](2)微波輔助提取:準確稱取三份虎杖藥材粉末各10g，按照料液比1:40加入蒸餾水，70 V預熱20分鐘后，采用微波輔助萃取，微波功率為480W，占空比為2:3，超聲時間為20分鐘。重復提取3次，合并濾液。
[0074](3)制作浸膏:3次提取的濾液分別合并，在旋轉蒸發儀上濃縮至流浸膏，而后在真空干燥箱中以60°C真空干燥，獲得含有虎杖蒽醌的干浸膏的平均質量為5.04g。
[0075](4)提取物中大黃素含量測定:分別精密稱取1mg上述干浸膏，至于1mL容量瓶中，加入流動相做溶劑定容至刻度，搖勻，過濾，進樣20 μ L，進樣3次，求取平均值。測得干浸膏中大黃素含量為1.97mg/10g藥材。
[0076]從本發明的實施例和對比例相比，可以看出:水酶法-半仿生法提取虎杖藥材粉末獲得的浸膏得率最高，而且浸膏中大黃素的含量也最高。酶的應用和提取過程中PH值的梯度升高均可以促進有效物質的溶出，因而，本發明所提供的虎杖藥材的提取新方法具有一定的優越性。
【權利要求】
1.一種水酶法-半仿生法提取虎杖中總蒽醌的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)首先，取虎杖粉末，按Ig: (5?20)mL的料液比向虎杖粉末中加入水解酶反應液，充分混勻，調節pH值至4.0?5.5，然后在45?55°C的攪拌條件下，酶解4?8小時，再經高溫滅活酶處理，最后進行過濾； 其中，每10mL水解酶反應液是按照每10mL蒸餾水中加入125mg纖維素酶的比例將纖維素酶溶解于蒸餾水中制成； 2)向步驟I)過濾后的濾渣中加入檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液，充分混勻，調節pH值至1.5?3.0，水浴提取后過濾； 3)向步驟2)過濾后的濾渣中加入檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液，充分混勻，調節pH值至6.5?7.5，水浴提取后過濾； 4)向步驟3)過濾后的濾渣中加入檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液，充分混勻，調節pH值至8.0?8.5,水浴提取后過濾； 5)將步驟I)?4)過濾得到的濾液合并，回收溶劑后干燥處理，得到的得到包含虎杖總蒽醌的干浸膏。
2.根據權利要求1所述的一種水酶法-半仿生法提取虎杖中總蒽醌的方法，其特征在于，步驟I)所述的高溫滅活酶處理是將酶解處理后的反應體系的水浴溫度升高至80°C，力口熱 1min0
3.根據權利要求1所述的一種水酶法-半仿生法提取虎杖中總蒽醌的方法，其特征在于，步驟2)、3)、4)中濾渣與檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液的反應料液比為lg:(10?22)mL。
4.根據權利要求1所述的一種水酶法-半仿生法提取虎杖中總蒽醌的方法，其特征在于，步驟2)、3)、4)所述的水浴提取溫度為50?80°C。
5.根據權利要求1所述的一種水酶法-半仿生法提取虎杖中總蒽醌的方法，其特征在于，步驟2)、3)、4)所述的水浴提取時間為I?3h。
6.根據權利要求1所述的一種水酶法-半仿生法提取虎杖中總蒽醌的方法，其特征在于，步驟5)所述的回收溶劑后干燥處理是將合并后的濾液減壓濃縮后在60?80°C下進行真空干燥處理。
7.根據權利要求1?6中任意一項所述的一種水酶法-半仿生法提取虎杖中總蒽醌的方法，其特征在于，所述虎杖粉末是將虎杖藥材清洗干凈后，經粉碎過篩、烘干至恒重后制得。
【文檔編號】A61K47/42GK104127509SQ201410350771
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月22日 優先權日:2014年7月22日
【發明者】張卉, 郭增軍, 覃源芮, 李夢怡, 席可, 薛璇璣 申請人:西安交通大學