一種愛德華氏菌的滅活方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及水產養殖動物病害防治領域，尤其涉及一種愛德華氏菌的滅活方法及其滅活疫苗，即采用H+濃度范圍在10-7mol/L—1mol/L的酸性溶液，在0℃—100℃下，滅活10min—48h，對愛德華氏菌進行完全滅活，與現有技術相比，本發明制備的滅活愛德華氏菌疫苗可有效維持愛德華氏菌抗原的免疫原性。
【專利說明】一種愛德華氏菌的滅活方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及水產養殖動物病害防治領域，尤其涉及一種愛德華氏菌的滅活方法及 其應用。
【背景技術】
[0002] 愛德華氏菌（Edwardsiella sp.)包括遲緩愛德華氏菌（E. tarda)、鲇魚愛德華氏 菌（E. ictaluri)和保科愛德華氏菌（E.hoshinae)，是水產養殖中的主要病原菌之一，其宿 主范圍十分廣泛，魚類、兩棲類、爬行類、鳥類以及包括人類的哺乳類都有感染報道，且呈世 界性分布，普遍存在于淡水和海水環境中，主要分布在中國、澳大利亞、日本、印度、以色列、 馬來群島、美國、巴拿馬等熱帶和亞熱帶國家和地區。從首次報道至今，該菌在多種養殖魚 類中引發了病害并造成了巨大損失。目前在魚類疾病防治中常采用化學治療劑以及抗生 素，但隨著它們的使用，病原耐藥性也隨之增強，而且藥物殘留和在環境中的擴散已經引起 了食品安全、環境及公共衛生方面的問題。魚用疫苗使用后不會產生污染，不會在免疫魚體 內形成殘留，可以避免環境污染并維持魚體本身的品質，反復使用也不會產生耐藥性，應用 前景廣闊。
[0003] 目前，魚用疫苗在應用中，包括有滅活疫苗、減毒活疫苗、DNA疫苗、亞單位疫苗和 菌蛻疫苗等形式，其中，滅活疫苗研發周期短、制作成本低、安全性好，在免疫效率得到保證 的情況下最容易獲得批準，因此成為目前商業化疫苗的最主要種類。但研究表明，愛德華氏 菌與弧菌等許多病原菌不同，采用常規技術制備的愛德華氏菌滅活疫苗對受試魚不能產生 有效的免疫保護性。Gutierrez 和 Miyazaki (1994, Dis Aquat Org. 6:110117.)研究中福 爾馬林滅活的遲緩愛德華氏菌注射免疫日本鰻的相對保護率僅為12. 5-25%，我們前期實 驗采用未經優化的常規技術制作的愛德華氏菌滅活疫苗的相對保護率（RPS)也不到40% ; Mekuchi等（1995，Fish Pathol. 30(4) :251-256)分別采用肌肉注射、浸泡或口服的接種 方式用福爾馬林滅活的遲緩愛德華氏菌免疫牙鲆，但均沒有取得有效的免疫保護效果；Sun 等（2011，Fish Shellfish Immunol.31(4):595-599.)雖然也報道了愛德華氏菌的滅活疫 苗，愛德華氏菌的單價滅活疫苗的免疫保護率只有33. 3%，只有當滅活的愛德華氏菌與鰻 弧菌等另三種菌聯合使用時，才能獲得較好的免疫保護率，鰻弧菌等其他三種菌滅活疫苗 其實為愛德華氏菌滅活疫苗起到了免疫佐劑的作用。總體來說，結合我們自己的多次實驗 結果以及大多數的報道，愛德華氏菌滅活疫苗的免疫效果不盡理想，這也可能是人們不得 不花更大的代價進行其他種類的疫苗的研究的原因。
[0004] 愛德華氏菌的弱毒活疫苗的應用報道中，Klesius等（2000)的發明（US Patent6153202)公開了一種鯰魚愛德華氏菌減毒活疫苗，Evans等（2006)的發明（US Patent7067122)公開了一種基因修飾的遲緩愛德華氏菌的活疫苗，王啟要等（2010)的發 明（201010541646.2)公開了一株遲緩愛德華氏菌基因缺失弱毒活疫苗。這些專利說明減 毒疫苗在愛德華氏菌疫苗研究中得到了更多的重視。減毒疫苗雖然能保證愛德華氏菌疫苗 的免疫保護率，但由于減毒疫苗仍然存在一定的生物安全風險，在安全性評價上需要更為 謹慎，使得這種疫苗研制和實現商業化的周期長，代價高。另外由于不同疫苗都存在一定的 特異性，一旦有不同種或不同血清型的愛德華氏菌的威脅，這種減毒疫苗可能就不再發揮 免疫保護作用。愛德華氏菌的其他類新型疫苗，如DNA疫苗、亞單位疫苗和菌蛻疫苗等，雖 然也具有一定的免疫效果，但考慮到生產工藝，成本，安全性等問題，上述疫苗目前也難以 投入到實際應用中。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種愛德華氏菌滅活方法及其應用，采用該方法可制備有效 維持愛德華氏菌抗原免疫原性的滅活疫苗，以克服現有技術的不足。
[0006] 本發明所述的愛德華氏菌滅活劑，即采用酸性試劑對愛德華氏菌進行滅活處理。
[0007] 優選的，對愛德華氏菌采用最低滅活強度進行滅活處理，最低滅活強度指使愛德 華氏菌得以完全滅活的最低滅活劑濃度、滅活溫度和滅活時間這三種條件的組合，且三者 之間互為負相關。
[0008] 最低滅活強度為使愛德華氏菌完全滅活的最小劑量，使用最低滅活強度的目的是 滅活愛德華氏菌的同時盡可能的維持抗原的免疫原性。經上述最低滅活劑濃度、滅活溫度 和滅活時間這三種條件的組合滅活處理的愛德華氏菌，經將滅活劑去除，并能使100%的處 理后的愛德華氏菌在TSB液體培養基中完全失去生長繁殖的能力，而且也無法在體內恢復 生長繁殖的能力，則視為完全滅活。這三種條件的組合關系是三者互為負相關性，形成在由 這三種條件組成的三維坐標系中的連續的近倒數關系的曲面，曲面上的具體點的確定是在 特定溫度和特定時間下測定使愛德華氏菌完全滅活的最低滅活劑濃度，或特定濃度的滅活 劑在特定溫度下測定使愛德華氏菌完全滅活的最短時間。本發明證實采用不同劑量的同種 滅活劑制備完全滅活疫苗的時間是不同的，兩者的關系呈現負相關。
[0009] 優選的，所述酸性滅活劑為室溫下H+濃度為的KTmol/L - lmol/L的酸性溶液；滅 活溫度范圍在〇°C - 100°C ;滅活時間范圍是lOmin - 48h。
[0010] 優選地，所述滅活劑采用的滅活條件為，H+濃度為的l(T2m〇l/L的酸性溶液、滅 活溫度為4°C、滅活時間為24h，或H+濃度為的ΙθΛιοΙ/L的酸性溶液、滅活溫度為16°C、 滅活時間為36h，或H+濃度為的KTmol/L的酸性溶液、滅活溫度為50°C、滅活時間為 20min，上述滅活方法所制備的疫苗對受試魚可提供相對保護率（RPS)分別為62. 8%、 63. 4% -65. 7%和60. 3% -61. 2%的免疫保護效果。
[0011] 優選地，對上述滅活處理后愛德華氏菌，進行細菌是否已完全滅活檢測。由于細 菌的滅活中，一些物理因素的影響，如可能存在著一些可影響滅活劑與作用效果等的可能 因子，例如滅活時不同的細菌濃度、培養基成分等可能消耗一些滅活劑的滅活效應等，因 此在實際應用中，特別是商業化大規模生產的條件下，可能會導致滅活不完全的問題從而 影響疫苗產品的質量穩定性及安全性，也因此，實際應用中有必要通過實際滅活效果的檢 測（如疫苗的安全性、穩定性及應用免疫效果等），制定針對上述因素在滅活工藝的相應標 準。
[0012] 本發明證實滅活條件對愛德華氏菌滅活疫苗的免疫原性有重要影響，對愛德華氏 菌的核酸和蛋白分析表明，不同滅活條件處理對滅活疫苗的核酸完整性及蛋白結構存在有 明顯的影響。以斑馬魚為模式動物進行愛德華氏菌滅活疫苗的應用試驗結果，證實采用最 低滅活劑量的不同滅活劑制備的滅活疫苗能在魚體內誘導不同抗體水平，產生不同的免疫 效果。因此，對于改變具體滅活條件制備的愛德華氏菌滅活疫苗，只要遵循最低滅活強度的 原則進行滅活疫苗的制備，并取得有效免疫保護的愛德華氏菌滅活疫苗，就仍然受到本專 利的保護。
[0013] 上述滅活方法制備滅活疫苗的免疫保護力評估可以采用以下方式，即1次免疫注 射受試魚4周后，再用10倍半致死劑量（LD 5CI)的活的愛德華氏菌對受試魚注射感染，較未 經滅活疫苗免疫接種的對照魚，計算免疫組的相對保護率（RPS)。
[0014] 本發明還包括所制得的愛德華氏菌滅活疫苗在魚類疾病防治中的應用。
[0015] 優選地，上述滅活方法所獲得的滅活疫苗在使用中也可以與佐劑聯合應用以達到 更好的免疫保護效果。其中，佐劑的作用是通過免疫調節、參與抗原遞呈、誘導免疫應答、抗 原貯存等方式提高抗原的免疫原性和免疫反應的可持續性。可選用的常用佐劑主要有不溶 性鋁鹽類膠體、油水乳劑、微生物成分、核酸及其類似物、多糖類物質、細胞因子、脂質體、免 疫刺激復合物、蜂膠、中草藥成分等。
[0016] 與現有技術相比，本發明的有益效果是：本發明制作的愛德華菌滅活疫苗是采用 最低滅活強度對愛德華氏菌進行完全滅活，能有效維持愛德華氏菌抗原的免疫保護力。初 步的應用試驗結果表明該方法制備的愛德華氏菌滅活疫苗的免疫效果較好，其RPS可以達 到60%以上的效果，這一結果要明顯高于使用常規滅活劑處理所得的愛德華氏菌疫苗的免 疫保護率。本發明所述的愛德華氏菌滅活疫苗符合商業化疫苗的安全、有效、實用和成本低 的要求，具有進行商業銷售或直接對商業化養殖的魚類實施免疫接種開發價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017] 圖1為不同滅活劑處理對E. tarda細菌基因組DNA的影響的電泳圖譜；
[0018] 其中：泳道1-來蘇水；泳道2-硫酸銅；泳道3-丙酮；泳道4-戊二醛；泳道5-低 pH (pH值為2);泳道6-PBS (對照）。
[0019] 圖2不同滅活劑處理對E. tarda細菌蛋白的影響的電泳圖譜；
[0020] 其中，Marker為分子量標記；泳道1-丙酮；泳道2-低pH (pH值為2);泳道3-來 蘇水；泳道4-硫酸銅；泳道5-PBS (對照）；泳道6-戊二醛。
【具體實施方式】
[0021] 下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。
[0022] 實施例1 :滅活劑最低滅活劑量的確定
[0023] 遲緩愛德華氏菌可培養于LB培養基（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCllOg， 去離子水定容至lL，pH7.0)或胰蛋白胨大豆肉湯（TSB，胰蛋白胨17g，植物蛋白胨3g，葡萄 糖2. 5g，NaC15. 0g，Κ2ΗΡ042· 5g，去離子水定容至1L，ρΗ7· 3)或2216E培養基中（根據培養 基成分中海水的有無，可分為兩種，其一：酵母提取物lg，胰化蛋白胨5g，FeP040. lg，海水定 容至1L，pH7. 6 - 7. 8 ;其二：酵母提取物lg，胰化蛋白胨5g，FeP040. lg，NaC134g，去離子水 定容至1L，pH7. 6 -7. 8)。將對數生長期的遲緩愛德華菌以1 :100的比例接種至上述一種 培養基中，28°C恒溫培養箱，180rpm振蕩培養5h，6000rpm，4°C離心lOmin收集菌體，以無菌 磷酸鹽緩沖液（PBS)洗滌菌體三次，并用PBS重懸菌體，制成1 X 109CFU/mL菌懸液。
[0024] 實驗室滅活劑量篩選中，取96孔細胞培養板，每孔中加入200 μ L制備好的遲緩 愛德華氏菌懸液。選用的滅活劑分別為來蘇水（10% )、丙酮（AR)、戊二醛（25% )、硫酸銅 (AR)和濃鹽酸（36% -38% )，采用的劑量梯度如表1所示，其中，來蘇水和丙酮按體積分 數計，戊二醛和硫酸銅分別按其終濃度計，濃鹽酸按pH值計，4°C靜置（期間多次重懸），24h 后，各孔取菌液20 μ L轉接至另一 96孔細胞培養板（各孔加有新鮮200 μ L TSB培養基） 的相應孔中，28°C振蕩培養過夜，以檢查滅活情況。觀察各孔中菌體實際生長情況（PBS組 作為對照），如原最低滅活劑濃度末能達到完全滅活的效果，則對原不同梯度中的滅活劑濃 度進行相應添加，重新進行最低滅活劑濃度的確定試驗，方法同上；反之，則可依據本次試 驗的結果，確定滅活劑對遲緩愛德華氏菌的最低滅活濃度。
[0025] 表1不同滅活劑使用濃度的篩選
[0026]
【權利要求】
1. 一種愛德華氏菌滅活方法，其特征在于，采用酸性試劑對愛德華氏菌進行滅活處理， 可維持愛德華氏菌抗原免疫原性。
2. 根據權利要求1所述的愛德華氏菌滅活方法，其特征在于，對愛德華氏菌采用最低 滅活強度進行滅活處理，所述最低滅活強度即為最低濃度的酸性滅活劑、最低滅活溫度和 最短滅活時間之間組合，且三者之間互為負相關。
3. 如權利要求2所述的愛德華氏菌滅活方法，其特征在于，所述酸性滅活劑為室溫下 H+濃度為KTmol/L - lmol/L的酸性溶液。
4. 根據權利要求3所述的愛德華氏菌滅活方法，其特征在于，所述滅活溫度為0? 100。。。
5. 根據權利要求3所述的愛德華氏菌滅活方法，其特征在于，所述滅活時間為lOmin? 48h。
6. 根據權利要求1所述的愛德華氏菌的滅活方法，其特征在于，所述滅活劑為H+濃度 為l(T2m〇l/L的酸性溶液、滅活溫度為4°C、滅活時間為24h，或H+濃度為l(T 4m〇l/L的酸性 溶液、滅活溫度為16°C、滅活時間為36h，或H+濃度為lO^iol/L的酸性溶液、滅活溫度為 50°C、滅活時間為20min。
7. 根據權利要求1-6任一項所述的愛德華氏菌的滅活方法，其特征在于，對愛德華氏 菌進行滅活處理后檢測愛德華氏菌是否已完全滅活。
8. 根據權利要求1-6任一項所述的愛德華氏菌的滅活方法所制得的滅活疫苗在魚類 疾病防治中的應用。
9. 根據權利要求8所述的愛德華氏菌滅活疫苗，其特征在于，所述滅活疫苗可以與一 種或多種佐劑聯合使用。
10. 根據權利要求9所述的愛德華氏菌滅活疫苗，其特征在于，所述佐劑為不溶性鋁鹽 類膠體、油水乳劑、微生物成分、核酸及其類似物、多糖類物質、細胞因子、脂質體、免疫刺激 復合物、蜂膠或中草藥成分。
【文檔編號】A61P31/04GK104140940SQ201410350754
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2014年7月22日 優先權日:2014年7月22日
【發明者】黃倢, 隋虎辰, 謝國駟, 王秀華, 杜迎彬, 史成銀 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所