一種硫酸脂化聚蔗糖及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種硫酸脂化聚蔗糖的制備工藝及其應用，該硫酸脂化聚蔗糖由以下步驟制備而成：1）制備聚蔗糖溶液、月桂酰氯溶液和氯磺酸溶液；2）將月桂酰氯溶液與聚蔗糖溶液混合，在60~80℃下反應，室溫孵育18h；3）取氯磺酸溶液與步驟2）所得的溶液混合，60~80℃下反應，室溫孵育18h；4）將步驟3）中的反應液用NaOH溶液調pH至中性，蒸餾去除溶劑，洗滌、透析除去雜質，干燥獲得硫酸脂化聚蔗糖；其中，月桂酰氯與聚蔗糖的分子比為：1.2~3.6:1；氯磺酸與聚蔗糖的分子比為：0.5~2.0:1。用硫酸脂化聚蔗糖制備水包油佐劑能顯著增加豬圓環病毒2型特異性抗體IgG、抗體亞類IgG1和IgG2a的濃度，與油佐劑活性大小相當。能有效提高抗原免疫活性，有望作為新型水包油佐劑開發應用。
【專利說明】一種硫酸脂化聚蔗糖及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于水包油佐劑【技術領域】，具體涉及一種硫酸脂化聚蔗糖及其應用。
【背景技術】
[0002] 目前油乳劑疫苗有三種劑型：油包水（W/0)型、水包油包水（W/0/W)型和水包油 (0/W)型。W/0免疫活性最強，但毒副反應大、注射困難；W/0/W免疫活性也較強，但熱穩定 性差、保存期短；0/W毒副作用小甚至沒有、熱穩定性好，但是免疫活性較弱。MF59是首個 實現商品化應用的0/W劑型佐劑，用其制備的人用流感疫苗在歐洲和美國獲得上市。該佐 劑的油為角鯊烯，具有安全、毒副作用極小等優點，表面活性劑為吐溫和司本系列產品。但 是，該佐劑的免疫活性相對較弱，僅能協助誘導微弱弱的免疫應答，尚不能滿足養獸用疫苗 的質量要求。另外，角鯊烯（或其類似物角鯊烷）的價格昂貴，也很難在獸用疫苗產品中廣 泛應用。法國SEPPIC公司用白油替代角鯊烯，用吐溫和司本系列產品作為表面活性劑開發 了一種0/W佐劑（ISA15A VG)，但也因為免疫活性較弱，未能實現商業化應用。
[0003] 多糖的糖殘基上有大量羥基、羧基和氨基等活性基團，方便化學反應進行耦合添 加其它分子物質，制備各種衍生物。研究發現，應用氯磺酸對多糖進行磺化，可以獲得硫酸 化多糖衍生物，修飾后多糖的免疫增強效果明顯提高，并且提高多糖的水溶性，提高生物利 用度。應用酯化反應也能將脂肪鏈耦合到多糖的羥基上，形成含脂肪鏈的酯化多糖衍生物， 提高多糖的脂溶性。Jansze等人運用化學的方法，可以將硫酸基和脂鏈共價耦合到葡聚糖 上，獲得既親水又親油的硫酸脂化葡聚糖衍生物。Hilgers等人將其作為一種表面活性劑， 與其它表面活性劑配伍使用，制備出角鯊烯的水包油乳液，并在以0VA為抗原的小鼠免疫 試驗中，表現出較好的免疫效果。同時還發現硫酸基取代值小、脂化度大的多糖衍生物佐劑 活性較大。提示，經過硫酸化和脂化雙重修飾后的多糖，同時具有親水和親油基團，具備雙 親功能，使有免疫增強活性的多糖同時擁有表面活性劑的雙重功能。
【發明內容】
[0004] 發明目的：針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種硫酸脂化聚蔗 糖，硫酸度低、脂化度高。本發明的另一目的是提供一種上述硫酸脂化聚蔗糖的水包油佐劑 應用。
[0005] 技術方案：為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下：
[0006] -種硫酸脂化聚蔗糖，由以下步驟制備而成：
[0007] 1)取干燥的聚蔗糖溶解于二甲基甲酰胺與吡啶的混合溶劑中，獲得聚蔗糖溶液； 取月桂酰氯溶解于二甲基甲酰胺與吡啶的混合溶劑中，獲得月桂酰氯溶液；取氯磺酸溶解 于二甲基甲酰胺與吡啶的混合溶劑中，獲得氯磺酸溶液；
[0008] 2)將月桂酰氯溶液與聚蔗糖溶液混合，先在60?80°C下反應，然后室溫孵育；
[0009] 3)取氯磺酸溶液與步驟2)所得的溶液混合，先在60?80°C下反應，然后室溫孵 育；
[0010] 4)將步驟3)中的反應液用NaOH溶液調pH至中性，蒸餾去除溶劑，洗滌、透析除去 雜質，干燥獲得硫酸脂化聚蔗糖；
[0011] 其中，月桂酰氯與聚蔗糖的分子比為：1.2?3.6:1 ;氯磺酸與聚蔗糖的分子比為： 0· 5 ?2. 0:1 〇
[0012] 所述的月桂酰氯與聚蔗糖的分子比為3.6:1，氯磺酸與聚蔗糖的分子比為1:1。
[0013] 步驟2)和步驟3)的反應溫度均為60°C。
[0014] 所述的硫酸脂化聚蔗糖的脂化度和硫酸取代度分別為1. 70和1. 32。
[0015] 所述的硫酸脂化聚蔗糖在制備水包油佐劑中的應用。
[0016] 本發明的硫酸脂化聚蔗糖一種應用方法是：取1. 〇g的硫酸脂化聚蔗糖，溶于2. 0g 的Tween80中，制備成硫酸脂化聚鹿糖的Tween80溶液；緩慢加入80mL的注射用水，制成硫 酸脂化環糊精TWeen80水溶液；加入8. 0g白油。高壓均質機乳化，400bar，溫度30?40°C， 10個循環以上，過濾除菌而成。
[0017] 本發明利用月桂酰氯、氯磺酸等化學試劑，先脂化再硫酸化，建立一種聚蔗糖的硫 酸脂化衍生物的制備方法。并通過0/W乳液熱穩定性、離心穩定性和免疫生物活性的比較 研究，對硫酸脂化聚蔗糖制備過程中試劑的比例、溫度等合成條件參數進一步優化，成功的 建立了一種活性最佳的硫酸脂化聚蔗糖制備方法。并且將該硫酸脂化聚蔗糖與吐溫80配 伍，以白油為油相，通過高壓均質法制備出熱穩定性和離心穩定性均合格0/W乳液。同時以 豬圓環病毒2型（PCV-2)為模式抗原，通過體內免疫試驗測評，該佐劑的免疫增強活性顯著 優于進口產品ISA15A VG。成功地解決了 0/W劑型佐劑免疫活性較弱、不能滿足獸用疫苗質 量要求的難題，可以用于PCV-2等獸用疫苗的生產。
[0018] 有益效果：與現有技術相比，本發明的硫酸脂化聚蔗糖及其應用，當月桂酰氯與聚 蔗糖的分子比為3. 6、氯磺酸與聚蔗糖的分子比為1. 0和反應溫度為60°C時，所制備硫酸脂 化聚蔗糖的脂化度和硫酸取代度，分別為1. 70和1. 32。通過體內免疫實驗證明，該硫酸脂 化聚蔗糖0/W佐劑能顯著增加豬圓環病毒2型特異性抗體IgG、抗體亞類IgGl和IgG2a的 濃度，免疫活性與W/0佐劑活性大小相當。可見硫酸脂化聚蔗糖水包油佐劑能有效提高抗 原免疫活性，有望作為新型0/W佐劑開發應用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019] 圖1是聚蔗糖的標準曲線圖；
[0020] 圖2是硫酸鈉的標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0021] 下面結合具體實施例對本發明做進一步的說明，但本發明不受這些實施例子的限 制。
[0022] 實施例1硫酸脂化聚蔗糖的制備
[0023] (1)材料與儀器
[0024] 試驗藥物：聚蔗糖400 (分子量為400000,上海索萊寶生物科技有限公司，批號 R)118) ;N，N-二甲基甲酰胺、吡啶、硫酸、鹽酸、氯磺酸、氨水（分析純，南京化學試劑有限公 司）；月桂酰氯（aladdin industrial corporation,批號F1228036);鉻酸鉀、氯化鈉、無水 硫酸鈉（西隴化工股份有限公司）。
[0025] 主要儀器設備：DZF-6051真空干燥箱（上海齊欣科學儀器有限公司）；SHI-82A恒 溫水浴振蕩器（常州國華電器有限公司）；旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-III 循環水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；KH-500DE數控超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器 廠）；754紫外分光光度計（上海菁華科技有限公司）；LGJ-18冷凍干燥機（北京松源華興 科技發展有限公司）。
[0026] (2)糖含量、硫酸度、脂化度的測定方法
[0027] 將待測樣品放入真空干燥箱中進行干燥，50°C至恒重（6h以上）。
[0028] 游離脂肪酸的測定：取一定質量（Ag)的樣品用溶于4. Omol/L的HC1溶液中，用 等體積的氯仿進行抽提、萃取，過濾后，干燥沉淀（Bg)，游離脂肪酸的比例（g/Kg) = (A - B) +AX1000。
[0029] 硫酸度的測定：取一定質量（Ag)的樣品溶于4. Omol/L的HC1溶液中，100°C作用 6h。然后用超聲酸性鉻酸鋇分光光度法法測定[6]。以無水硫酸鈉為標準品，用分光光度計 測定各樣品在375nm處的吸光度值（A375值），根據回歸方程計算出S0/+的質量（Cg)。
[0030] 糖含量測定：取一定質量（Ag)的樣品溶于4. Omol/L的HC1溶液中，100°C作用6h。 用硫酸苯酚法測定。以聚蔗糖400為標準品，用分光光度計測定各樣品在490nm處的吸光 度值（A490值），根據標準曲線和回歸方程計算出糖含量（Dg)。
[0031] 硫酸度（Sulphate/monosaccharide)的比例=C + DX 162 + 96 ;
[0032] 脂化度（Lipid/monosaccharide)的比例=(A - C - D - B) +DX 162 + 200。
[0033] (3)硫酸脂化聚蔗糖的制備
[0034] 1)二甲基甲酰胺與吡啶4:1混合作為混合液備用；
[0035] 2)首先對聚蔗糖進行真空干燥預處理，然后400mg溶于10mL無水二甲基甲酰胺和 批陡混合液中；
[0036] 3)再按表1設定的月桂酰氯與聚蔗糖分子比，將月桂酰氯溶于2mL無水的二甲基 甲酰胺和吡啶混合液中，然后與聚蔗糖溶液混合，按表1設定的溫度水浴搖床6h，室溫孵育 18h ；
[0037] 4)然后按表1設定的氯磺酸與聚蔗糖分子比，將氯磺酸加入2倍的無水的二甲基 甲酰胺和吡啶混合液中，與聚蔗糖溶液混合，按表1設定的溫度再次水浴搖床6h，室溫孵育 18h ；
[0038] 5)最后用NaOH溶液調pH至7. 0±0. 2,通過降壓蒸餾（60°C )去除溶劑，將沉淀用 蒸餾水重懸，至流水中透析（4 °C，7天）除去雜質，真空冷凍干燥獲得硫酸脂化聚蔗糖。
[0039] 表1因素和水平
[0040]
【權利要求】
1. 一種硫酸脂化聚蔗糖，其特征在于，由以下步驟制備而成： 1) 取干燥的聚蔗糖溶解于二甲基甲酰胺與吡啶的混合溶劑中，獲得聚蔗糖溶液；取月 桂酰氯溶解于二甲基甲酰胺與吡啶的混合溶劑中，獲得月桂酰氯溶液；取氯磺酸溶解于二 甲基甲酰胺與吡啶的混合溶劑中，獲得氯磺酸溶液； 2) 將月桂酰氯溶液與聚蔗糖溶液混合，先在6(T80°C下反應，然后室溫孵育； 3) 取氯磺酸溶液與步驟2)所得的溶液混合，先在6(T80°C下反應，然后室溫孵育； 4) 將步驟3)中的反應液用NaOH溶液調pH至中性，蒸餾去除溶劑，洗滌、透析除去雜 質，干燥獲得硫酸脂化聚蔗糖； 其中，月桂酰氯與聚蔗糖的分子比為：1. 2~3. 6:1 ;氯磺酸與聚蔗糖的分子比為： 0· 5?2. 0:1。
2. 根據權利要求1所述的硫酸脂化聚蔗糖，其特征在于：所述的月桂酰氯與聚蔗糖的 分子比為3. 6:1，氯磺酸與聚鹿糖的分子比為1: 1。
3. 根據權利要求2所述的硫酸脂化聚蔗糖，其特征在于：步驟2)和步驟3)的反應溫 度均為60°C。
4. 根據權利要求3所述的硫酸脂化聚蔗糖，其特征在于：所述的硫酸脂化聚蔗糖的脂 化度和硫酸取代度分別為1. 70和1. 32。
5. 權利要求1所述的硫酸脂化聚蔗糖在制備水包油佐劑中的應用。
【文檔編號】A61K9/107GK104151440SQ201410346252
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月18日 優先權日:2014年7月18日
【發明者】王德云, 盧宇, 潘華榮, 趙曉娟, 胡元亮, 侯繼波 申請人:南京農業大學