一種用于個性化的骨修復材料和其制備方法

一種用于個性化的骨修復材料和其制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種用于個性化的骨修復材料及其制備方法，骨修復材料包括質量比為0.1-0.6∶1的有機材料和無機材料，以及包裹了蛋白質的脂質微球粉末。該骨修復材料可用于個性化的骨修復，其具有生物相容性且可降解，具有生物骨材料所需要的安全、立體網狀結構、平衡降解的特點。
【專利說明】一種用于個性化的骨修復材料和其制備方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物工程領域，具體涉及一種生物修復材料。
[0002] 本發明還涉及所述生物修復材料的制備方法。

【背景技術】
[0003] 骨組織損傷是人類健康面臨的一大難題。隨著醫學科學的發展，人工骨移植技術 已經較為廣泛地應用于臨床，但至今人工骨移植仍存在一些問題，其中最嚴重的是骨組織 短缺，供體不足，同時，人工骨移植治療方案最終仍難以修復受到損傷的骨組織或使之功能 得到長期恢復。生物制造工程是一種重要的潛在替代治療措施，有望最終解決這個問題。當 個體骨組織損傷或缺失時，生物制造技術采用植入器官代用品的方式進行個性化治療，這 種方式可以在植入初期已經具有組織或器官的全部功能，并在體內生長的過程中逐步具有 需要的組織或器官的功能。另外骨組織在人體內是一個立體組織，內部有血管、神經、骨細 胞、骨髓等多種復雜的生物組成，設計三維的立體和制造其內部的通道也是需要必須解決 的問題。
[0004] 組織工程支架材料的目的是為構建組織的細胞提供一個三維支架，有利于細胞的 黏附、增殖乃至分化，為細胞生長提供合適的外環境。生物可降解材料在組織工程研究中起 著非常重要的作用，它是組織工程實現產業化的關鍵。
[0005] 除了符合一般生物醫學材料的要求外，組織工程學所需的理想生物材料還需滿足 如下要求：具備良好的生物相容性，不會因鄰近組織的排異反應而影響新組織的功能；具 有可降解性及適宜的降解速率，當移植的細胞或組織在受體內存活時，支架材料可自行降 解；具有符合細胞、組織器官要求的生物力學強度；具有良好的細胞界面關系，能相互作用 以保存和促進細胞功能；易于塑型，便于加工成理想的二維或三維結構，而且移植到體內后 能保持原有形狀；可以和其他活性分子復合，促進種子細胞的增殖與分化；易消毒性。
[0006] 目前計算機輔助技術的加入，醫學影像技術及材料制作加工技術的進步又為組織 工程的個性化治療創造了新的契機。如用非侵入計算機斷層掃描（CT)和核磁共振成像 (MRI)進行三維重建，指導組織分類或創傷鑒別。目前計算機輔助設計和制作（CAD/CAM)以 及快速成型技術（RP)制作硬組織模型、組織支架和定制型假體，3D打印技術的應用將近一 步推動了 CAD技術，可以用醫療影像數據建立個性化損傷或替代部位的數據庫，得到精準 的體積和尺寸以及內部空隙等骨組織個體化模塊。
[0007] 組織工程的最終目的是讓細胞在體外生長、分化為功能組織和器官。細胞的來源 可大致分為成熟的細胞和干細胞，成熟的細胞又可分為自體和異體兩個不同的來源。自體 細胞來源應該是最理想的細胞來源。所要通過的步驟基本上包括收取少量的自體細胞然后 在體外培養增殖。之后這些組織可以用于組織工程或直接用于自體的治療。現在已經知 道，不僅骨髓組織中存在的間質干細胞（MSCs)在一定條件下，可向成骨細胞、軟骨細胞、成 肌細胞、脂肪細胞、成纖維細胞等分化，而且在其他組織如皮膚、肝、神經等也存在干細胞， 這些干細胞還存在相互轉化的現象。研究表明，組織特異干細胞有可能作為組織工程的種 子細胞來源，其中自體MSCs與支架材料復合構建的組織工程骨已有臨床應用的個案報道， 顯示了臨床應用的良好前景。MSCs還易于實現外源基因的導入和表達，為基因治療開創了 應用前景。人骨髓間充質干細胞（human marrow mesenchymal stem cells, hMSCs)由于獲 取途徑較為方便，擴增表型穩定，同時避免了醫學倫理爭議，因而成為理想的組織工程骨 種子細胞，用于向成軟骨細胞方向誘導以構建組織工程骨.Tali等研究采用hMSCs構建軟 骨，體外接種生物活性材料并植入裸鼠體內，其成軟骨效果理想。
[0008] 成熟細胞體外培養仍然是個值得研究的課題，因為如何有效地提高細胞在體外的 增殖能力將對組織工程有直接影響，特別是病人急需這種細胞或自體細胞形成的組織或器 官。生物反應器是安裝了將營養物、氣體（如氧氣和二氧化碳）和廢物控制在適當數量水 平的攪拌器和傳感器的培養室。隨著組織在生物反應器中的生長，使其機械特性達到最佳 將是極為關鍵的問題，因為許多組織在受到擴展、拉動或壓縮作用時會做出反應，進行重構 或改變它們的總體結構。


【發明內容】

[0009] 本發明的一個目的在于提供一種骨修復材料，該骨修復材料可用于個性化的骨修 復，其具有生物相容性且可降解，具有生物骨材料所需要的安全、立體網狀結構、平衡降解 的特點。
[0010] 本發明的再一個目的是提供所述骨修復材料的制備方法，通過將生物相容可降解 有機材料，經過適當的溶劑溶解后，與無機磷酸鈣鹽混合后，加入包裹有蛋白質的脂質微球 粉末混勻，根據CT掃描獲得的數據設計的3D模型數據程序，打印出適合特異個體治療的骨 修復3D材料，材料經過真空干燥除去殘余的溶劑，接種骨髓間質干細胞，在自動化控制的 生物反應器中進行立體培養，獲得個性化的骨修復材料，最后植入到人體內病變待修復部 位。
[0011] 根據本發明的一個方面，一種用于個性化的骨修復材料，包括
[0012] 質量比為0. l-o. 6:1的有機材料和無機材料，以及
[0013] 包裹了蛋白質的脂質微球粉末；其中：
[0014] 所述有機材料選自 PLGA，PLA 和 PGA，所述 PLGA 中 PLA :PGA = 5 % -95 % : 95%-5%，分子量范圍為8000-250000 ;所述PLA分子量范圍為8000-250000，；所述PGA分 子量范圍為8000-250000 ;
[0015] 所述無機材料為選自磷酸三鈣，α-磷酸三鈣，羥基磷灰石和磷酸四鈣中的一 種或多種的磷酸類鈣鹽；
[0016] 所述包裹于脂質微球中的蛋白質選自神經細胞生長因子，類胰島素生長因子，重 組人β干擾素，紅細胞生成素，轉化生長因子_β3,骨形態發生蛋白的一種或者幾種，每 份脂質微球粉末中蛋白質的含量為；神經細胞生長因子50?200ng/份，類胰島素生長因 子50?200ng/份，紅細胞生成素5?20IU/份，重組人干擾素50?200ng/份，轉化生長 因子-0 35〇-12〇ng/份，骨形態發生蛋白BMP-250-100ng/份，骨形態發生蛋白BMP-7為 50-100ng/ 份；
[0017] 優選的蛋白質為重組人干擾素 IFN-β，IFN-β的含量為100ng/ml ;更優選的蛋白 質為IFN-β與TGF-β 3的組合。
[0018] 根據本發明的另一方面，制備個性化的骨修復材料的方法，包括下述步驟：
[0019] 1)按照預定的比例以有機溶劑混勻所述有機材料和無機材料，加入包裹了蛋白質 的凍干脂質微球粉末，制備骨修復材料；
[0020] 2)將步驟1)的骨修復材料轉入3D打印機，用非侵入計算機斷層掃描和核磁共 振成像進行個體化骨損傷部位三維數據采集，將采集到的斷層圖像切片轉化為三維打印模 型，利用快速成型技術制作骨組織模型和組織支架；
[0021] 3)將步驟2) 3D打印制備的骨組織支架置于細胞瓶中接種成骨細胞，細胞接種濃 度至1 X 105/mL，培養至細胞附著或形成單層細胞后轉移到細胞生物反應器中進行立體培 養；
[0022] 4)獲得可植入骨損傷部位的個性化的骨修復材料。
[0023] 本發明所述的制備方法，其中在打印過程中材料要處于低溫狀態，溫度范圍 為-30°C?-10°C，并且打印的材料要持續給予冷風使其固定成型；打印完的骨組織支架要 進行真空冷凍干燥。
[0024] 所述骨組織支架在接種細胞前需要進行無菌處理，可以以Y射線照射，或者環氧 乙烷熏蒸。并且將所述支架經培養液浸泡。
[0025] 接種細胞到生物支架，在培養瓶中培養2天待生物骨支架上的細胞附著或形成單 層后轉移骨組織支架到生物反應器中，立體培養，其中流加培養基的速度為5ml/min-15ml/ min，培養基的成分根據培養時間和生長情況調整。成骨細胞（hMSC)完全培養基包括如下 成分：低糖DMEM88% (v/v),胎牛血清10% (v/v)，L-谷氨酸1% (v/v),青/鏈霉素1% (v/v)。hMSC成軟骨分化培養基包括如下成分：高糖DMEM96. 3% (v/v)，L-谷氨酸1% (v/ '〇，青/鏈霉素1%卜八)，10_31凡抗壞血酸0.5(%〇八)，1_31/1^地塞米松0.01 (%〇/ v)，40 μ g/L L-脯氨酸 0· 1 % (v/v)，1000 μ g/L 丙酮酸鈉 0· 1 % (v/v)，ITS+Premixl % (v/ v),10ng/ml TGF-^3〇
[0026] 本發明的骨組織材料在個性化修復中，可以保持生物材料的降解速度和新生骨組 織的生長速度的平衡，本發明采用了細胞因子和骨蛋白介入技術，尤其是脂質微球的包裹 技術，使個性化骨組織的體外生長和體內生長期內，更好的多元化刺激周圍組織和骨組織 本身的各種相關聯的組織系統的生長。
[0027] 本發明發現了 IFN-β可能作為具有促進hMSCs成軟骨分化的能力，且IFN-β可 以代替TGF-β 3作用，二者聯合使用可以更加促進成軟骨分化。
[0028] 本發明使用有機生物材料，應用先進制造技術和3D打印技術，結合現代個體影像 學技術，使個性化骨的治療更加符合立體尺寸，保證骨組織內部的細胞通道，植入后更快和 自體組織融合，減少異體排斥反應。
[0029] 本發明提供的個性化的骨修復材料和其制備方法得到的骨組織，具有生物骨材料 所需要的安全、立體網狀結構、平衡降解的特點。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030] 圖1為添加不同蛋白質（細胞因子）的阿爾新藍染色結果；
[0031] 圖2為添加各蛋白質（細胞因子）的GAG檢測結果；
[0032] 圖3為添加 IFN- β促進hMSCs成軟骨分化的GAG檢測結果；
[0033] 圖4為添加 IFN- β促進hMSCs成軟骨分化的qRT-PCR結果，顯示成軟骨分化第14 天各組Collagenll表達水平；
[0034] 圖5為添加 IFN- β促進hMSCs成軟骨分化的qRT-PCR結果，顯示成軟骨分化第14 天各組S0X9表達水平；
[0035] 圖6為添加 IFN- β促進hMSCs成軟骨分化的WESTERN BLOT結果；
[0036] 圖7為不同濃度IFN- β誘導成軟骨分化后細胞GAG總含量變化趨勢；
[0037] 圖8為hMSCs在PLGA/TCP材料上的成骨分化的掃描電鏡檢驗結果；
[0038] 圖9為在PLGA/TCP材料上成骨分化的hMSC細胞的ALP酶活性比較；
[0039] 圖10為用于立體培養的生物反應器結構示意圖。

【具體實施方式】
[0040] 材料來源：
[0041] 除特別注明外，所有材料為市售購買；
[0042] hMSC細胞來源：第5代的hMSC細胞株購自廣州賽業公司
[0043] 包裹蛋白質的脂質微球制備：
[0044] 薄膜蒸發法制備脂質微球步驟如下：①成膜：膜材配料：將注射用卵磷脂、膽固醇 和十八胺（或維生素 E)按配料比3?7:1?3:1稱量，然后溶解在終濃度為0. 5?1. 5% 的二氯甲烷或三氯甲烷中，將該液體置于旋轉蒸發儀的茄型瓶中，60°C水浴作為蒸發溫度， 旋轉使溶劑蒸發，最后階段用氮氣吹干溶劑，使脂質體在茄型瓶中成膜。②水化：加入含細 胞因子（例如：重組人IFNi3 la (終濃度為100ng/ml)和骨形態發生蛋白BMP-2(終濃度為 80ng/ml))的水相溶液約50ml (膜材在溶液的濃度為1 % )，加入幾粒小玻璃珠，劇烈震蕩， 待薄膜從瓶壁上完全脫落后，水浴超聲約30min，瓶中液體呈淡云霧狀。③高壓勻漿：將粗 制脂微球用高壓勻漿機在壓力為15Kpa?30Kpa壓力范圍內，通過冷凝水，將勻漿機出口的 溫度控制在30°C?37°C，均質到200?400nm的粒徑。
[0045] 冷凍干燥法（FDM)相結合制備脂質微球，則在上述基礎上增加以下步驟：④冷凍 干燥：將勻漿后的脂質體混合物，震蕩，加入適量的海藻糖使其中終濃度為1.5%，將液體 在壓力下通過孔徑為〇. 45um的板式過濾器，進行無菌處理，同時也可將脂質體的孔徑控制 在450nm以下，還可以進一步的使脂質體的粒徑更為均一，取過濾后的樣品在無菌條件下 分裝，2ml/瓶，分裝在西林瓶中；⑤冷凍，干燥。脂質微球蛋白凍干樣在應用時，可加入一定 體積的PBS或生理鹽水（2ml)，震蕩至淡云霧狀即可。
[0046] 儀器設備：
[0047] 3D打印設備、CT和MRI為通用設備；
[0048] 用于立體培養的生物反應器：結構參見圖10,生物反應器100,包括罐體1，分別位 于罐體兩端的第一罐蓋2A和第二罐蓋2B，第一罐蓋設置有伸向罐體內部的第一夾持部件 3A和用于物質進出的至少一個第一導管4A，第二罐蓋設置有伸向罐體內部的第二夾持部 件3B和用于物質進出的至少一個第二導管4B，第一罐蓋2A和第二罐蓋2B與罐體1之間形 成密封。通過商品化生物反應器，將培養液從本生物反應器下端的導管注入，培養液充滿罐 體1，從罐體頂端的導管流出，返回至商品化生物反應器。通過所述商品化生物反應器自動 控制氣體、液體的溶氧、pH、壓力、溫度以及額外物質的添加，在培養不同時期向立體培養的 生物反應器補充不同的營養成分，實現罐體1內組織塊和生物材料的立體、連續、接近體液 的培養。
[0049] 以下結合具體實施例對本發明進行詳細說明：
[0050] 實施例1.個性化骨組織材料配比
[0051] 稱取lg羥基磷灰石或α-磷酸三鈣或β-磷酸三鈣或磷酸四鈣置于一端密閉的 容器中，加入2ml丙酮后將領一端密閉，振蕩使丙酮浸潤羥基磷灰石。
[0052] 稱取0· 2g，平均分子量為10萬的PLGA (聚（D, L-乳酸-co-乙醇酸），PLA:PGA = 75:25)或PGA(聚乙交酯）或PLA(聚（L-乳酸）），置于一端密閉的容器中，加入體積為 〇. 2ml的丙酮后將另一端密閉，使PLGA完全溶解。
[0053] 將溶解后的有機材料完全加入到無機材料中，振蕩攪拌均勻，密閉。
[0054] 取一份量的包裹有凍干脂質微球粉末，該粉末中同時含有神經細胞生長因子 (NGF)為100ng/份，重組人干擾素（IFN-β)為120ng/份，骨蛋白（BMP-2)為100ng/份。 將其加入上述制備好的材料液體中，迅速混勻。
[0055] 實施例2個性化骨組織材料制備
[0056] 用非侵入計算機斷層掃描（CT)和核磁共振成像（MRI)進行個體化骨損傷部位三 維數據采集，采集到的斷層圖像切片采用mimic或3dMed軟件處理，轉化為三維的空間矢量 數據，再通過三維設計軟件Aut 〇deSk3ds Max，轉化為三維打印模型，編譯為3D打印機識別 文件格式如STL文件。
[0057] 設置立體材料支架的打印參數，層與層之間材料垂直交叉式堆疊，每層內采用平 行式放置，每條之間的間隙為1mm，Z軸方向每次的步進高度為0· 1mm，X軸和Y軸方向的移 動速度為2mm/s，出料口的孔徑控制在0· 5mm-〇. 1mm之間，出料的壓力控制在20psi_60psi 之間。
[0058] 稱取lga -磷酸三鈣置于一端密閉的容器中，加入2ml丙酮后將領一端密閉，振蕩 使丙酮浸潤羥基磷灰石。
[0059] 稱取0. 3g，平均分子量為10萬的PLA，置于一端密閉的容器中，加入體積為0. 2ml 的丙酮后將另一端密閉，使PLA完全溶解。
[0060] 將溶解后的有機材料完全加入到無機材料中，振蕩攪拌均勻，密閉。
[0061] 取一份量的包裹有凍干脂質微球粉末，該份粉末中包括類胰島素生長因子 (IGF-I)為100ng/份，紅細胞生成素（ΕΡ0)為20IU/份，重組人干擾素（IFN-β)為80ng/ 份，骨蛋白（BMP-7)為100ng/份。將其加入上述制備好的材料液體中，迅速混勻。
[0062] 將混合好的材料加入到3D打印機的原料儲存室中，運行程序，按照設定好的程序 打印出所設計的立體材料支架。打印過程維持支架平臺及周圍溫度為_2〇°C，并且持續給予 冷風使固液相分離成型。
[0063] 支架打印后，需將支架進行真空冷凍干燥處理，第一段溫度設為-50°C，真空度設 為20pa，運行4h ;第二段溫度控制在28?32°C，持續時間42小時。
[0064] 實施例3個性化骨組織材料（添加細胞因子IFN- β )誘導hMSC細胞成軟骨分化
[0065] 用非侵入計算機斷層掃描（CT)和核磁共振成像（MRI)進行個體化骨損傷部位三 維數據采集，采集到的斷層圖像切片采用mimic或3dMed軟件處理，轉化為三維的空間矢量 數據，再通過三維設計軟件Aut〇deSk3ds Max，轉化為三維打印模型，編譯為3D打印機識別 文件格式如STL文件。
[0066] 設置立體材料支架的打印參數，層與層之間材料垂直交叉式堆疊，每層內采用平 行式放置，每條之間的間隙為1mm，Z軸方向每次的步進高度為0· 1mm，X軸和Y軸方向的移 動速度為2mm/s，出料口的孔徑控制在0· 5mm-〇. 1mm之間，出料的壓力控制在20psi_60psi 之間。
[0067] 稱取lgi3 -磷酸三鈣置于一端密閉的容器中，加入2ml丙酮后將領一端密閉，振蕩 使丙酮浸潤羥基磷灰石。
[0068] 稱取0. 3g，平均分子量為12萬的PGA，置于一端密閉的容器中，加入體積為0. 2ml 的丙酮后將另一端密閉，使PGA完全溶解。
[0069] 將溶解后的有機材料完全加入到無機材料中，振蕩攪拌均勻，密閉。
[0070] 取一份量的包裹有凍干脂質微球粉末，其中含重組人干擾素（IFN-β )為120ng/ 份。將其加入上述制備好的材料液體中，迅速混勻。
[0071] 將混合好的材料加入到3D打印機的原料儲存室中，運行程序，按照設定好的程序 打印出所設計的立體材料支架。打印過程維持支架平臺及周圍溫度為_2〇°C，并且持續給予 冷風使固液相分離成型。
[0072] 支架打印后，需將支架進行真空冷凍干燥處理，第一段溫度設為-50°C，真空度設 為20pa，運行4h ;第二段溫度控制在28?32°C，持續時間42小時。
[0073] 將三維支架用射線做無菌處理，在無菌條件下，將處于對數分裂期的hMSC細胞， 濃度為5X 105cell/ml，分別取0. 5ml接種于三維支架和6孔細胞板（陰性對照）中，靜置 培養20天，其中每4天更換一次細胞完全培養基。hMSC完全培養基包括如下成分：低糖 DMEM88% (v/v),胎牛血清 10% (v/v)，L-谷氨酸 1% (v/v),青 / 鏈霉素 1% (v/v)。hMSC 成軟骨分化培養基包括如下成分：高糖DMEM96. 3% (v/v)，L-谷氨酸1% (v/v)，青/鏈 霉素1%(丫八），10臟〇1凡抗壞血酸0.5(%(￥八），11111]1〇1凡地塞米松0.01 (%(￥八），40 4區/ L L-脯氨酸 0.1% (v/v)，1000yg/L 丙酮酸鈉 0.1% (v/vhlTS+Premixl% (v/v)，10ng/ml TGF- β 3.
[0074] 于第20天收集實驗組細胞和對照組細胞，進行生化分析檢測。
[0075] 糖胺多糖（GAG)總含量是細胞成軟骨分化水平的重要標志，GAG含量檢測結果顯 示成軟骨實驗組在培養4d后已與空白組有顯著性差異，GAG總含量隨著時間不斷增高.在 整個實驗周期內，實驗組的細胞GAG總含量與對照組細胞相比有顯著性差異。表明該方法 制備的三維支架有可能促進細胞的成軟骨分化。
[0076] 實施例4.添加不同細胞因子的骨組織材料促進hMSCs成軟骨分化
[0077] 實驗方法：
[0078] 添加不同細胞因子IGF-1，NGF，ΕΡ0和IFN- β的分組方法：
[0079] 取對數生長期的第8代hMSCs，以完全培養基重懸，調整細胞濃度至1 X 105/mL. 6 孔板每孔接種200 μ L細胞懸液，補充培養基至2mL.細胞分為空白對照組，成軟骨對照 組，IFN-β組，IGF-1組，NGF組和ΕΡ0組，4d時用完全培養基，成軟骨分化培養基，含 100ng/ml IFN-β的完全培養基，含100ng/ml IGF-1的完全培養基，含100ng/ml NGF的 完全培養基和含l〇IU/ml EP0的完全培養基對應換液，之后每4d換液。
[0080] 阿爾新藍染色檢測方法：
[0081] 分組換液后14d取出6孔板，小心抽去孔里的培養基，加入清理液清洗，酸性液 孵育3min后清洗2次，染色液處理30min，避免光照，清洗2次，核固紅復染后倒置顯微 鏡下觀察拍照，每組3個復孔。
[0082] 實驗結果
[0083] (1)添加不同細胞因子的阿爾新藍染色結果
[0084] 阿爾新藍染色結果顯示（圖1)空白對照組，IGF-1組，NGF組和ΕΡ0組染色后梭型 的細胞形態仍清晰可見，細胞周圍并未見藍色的糖蛋白出現，而成軟骨對照組有明顯的細 胞形態變化，細胞周圍有大量糖蛋白聚集，IFN-β組細胞形態有向軟骨細胞分化的趨勢， 但只有少量糖蛋白可見。
[0085] (2)添加各細胞因子的GAG檢測結果
[0086] 糖胺多糖總含量是細胞成軟骨分化水平的重要標志，GAG總含量檢測結果顯 示（圖2)，成軟骨對照組在換用成軟骨分化培養基后4d已與其他組有顯著性差異 (p〈0. 01)，GAG總含量隨著時間不斷增高.IFN-β組細胞GAG總含量在4d，8d和空白對照組 有顯著性差異（P〈〇. 05)，但后期兩者接近，沒有顯著性差異，其余各組GAG總含量和空白 對照組沒有顯著性差異（P>〇.〇5)，實驗表明IFN-β可能促進hMSCs成軟骨分化。
[0087] 實施例5.添加 IFN- β促進hMSCs成軟骨分化
[0088] 實驗方法：
[0089] 檢驗IFN-β促成軟骨分化效果的分組方法：
[0090] 取對數生長期的第8代hMSCs，以完全培養基重懸，調整細胞濃度至1 X 105/mL. 6 孔板每孔接種200 μ L細胞懸液，補充培養基至2mL.細胞分為空白對照組，成軟骨對照 組，正^0組和正^0+了6?-0 3(轉化生長因子-0 3)組，4(1時用完全培養基、成軟骨分化 培養基、含l〇〇ng/ml IFN-β的成軟骨分化培養基（不含TGF-0 3)和含100ng/ml IFN-β 的成軟骨分化培養基對應換液，之后每4d換液。
[0091] 實驗結果：
[0092] (1)添加 IFN- β促進hMSCs成軟骨分化的GAG檢測結果
[0093] GAG總含量檢測結果顯示（圖3)，成軟骨對照組，IFN- β組和IFN- β +TGF- β 3組 與空白對照組都有顯著性差異（Ρ〈〇. 01)，且GAG總含量隨著時間不斷增高.。IFN-β組細 胞GAG總含量略高于成軟骨對照組，4d和lid有顯著性差異（p〈0. 01)，但7d和14d沒有 顯著性差異（P>〇. 05)，IFN- β +TGF- β 3組細胞GAG總含量遠遠高于成軟骨對照組和IFN- β 組，和成軟骨對照組有顯著性差異（P〈〇.〇l)，實驗表明IFN-β可以代替TGF-0 3作用， 二者聯合使用可以更加促進成軟骨分化。
[0094] (2)添加 IFN- β促進hMSCs成軟骨分化的qRT-PCR結果
[0095] qRT-PCR結果顯示（圖4,5)，14d時IFN-β組細胞Collagen II和S0X9基因相對 表達率要遠遠高于空白對照組（P〈〇.〇l)，和成軟骨對照組較為接近，而IFN-i3+TGF-i3 3 組細胞Collagen II和S0X9基因相對表達率則明顯高于其他各組（p〈0. 01)。
[0096] (3)添加 IFN- β促進hMSCs成軟骨分化的WESTERN BLOT結果
[0097] WESTERN BLOT結果顯示（圖6)，14d各組均有Collagen II和S0X9條帶出現，其 中IFN- β +TGF- β 3組條帶最為明亮.
[0098] 灰度分析值（表1)證明IFN- β +TGF- β 3組Collagen II和S0X9相對表達量較其 他各組都有明顯差異（p〈〇. 01).
[0099] 表1 WESTERN BLOT半定量灰度分析
[0100]

【權利要求】
1. 一種用于個性化的骨修復材料，包括 質量比為0. l-o. 6:1的有機材料和無機材料，以及 包裹了蛋白質的脂質微球粉末；其中： 所述有機材料選自 PLGA，PLA 和 PGA，所述 PLGA 中 PLA :PGA = 5% -95% :95% -5%， 分子量范圍為8000-250000 ;所述PLA分子量范圍為8000-250000,；所述PGA分子量范圍為 8000-250000 ； 所述無機材料為選自磷酸三鈣，磷酸三鈣，羥基磷灰石和磷酸四鈣中的一種或 多種的磷酸類鈣鹽； 所述包裹于脂質微球中的蛋白質選自神經細胞生長因子，類胰島素生長因子，重組人 β干擾素，紅細胞生成素，轉化生長因子，骨形態發生蛋白的一種或者幾種，每份脂質微 球粉末中蛋白質的含量為；神經細胞生長因子50?200ng/份，類胰島素生長因子50? 200ng/份，紅細胞生成素5?20IU/份，重組人干擾素50?200ng/份，轉化生長因子 50-120ng/份，骨形態發生蛋白BMP-2為50-100ng/份，骨形態發生蛋白BMP-7為50-100ng/ 份。
2. 權利要求1所述的個性化的骨修復材料，其中包裹于脂質微球中的蛋白質為重組人 干擾素 IFN-β，IFN-β的含量為100ng/ml。
3. 權利要求1或2所述的個性化的骨修復材料，其中包裹于脂質微球中的蛋白質為重 組人干擾素-β與轉化生長因子-β 3的組合。
4. 制備權利要求1所述的個性化的骨修復材料的方法，包括下述步驟： 1) 按照預定的比例以有機溶劑混勻所述有機材料和無機材料，加入包裹了蛋白質的凍 干脂質微球粉末，制備骨修復材料； 2) 將步驟1)的骨修復材料轉入3D打印機，用非侵入計算機斷層掃描和核磁共振成像 進行個體化骨損傷部位三維數據采集，將采集到的斷層圖像切片轉化為三維打印模型，利 用快速成型技術制作骨組織模型和組織支架； 3) 將步驟2) 3D打印制備的骨組織支架置于細胞瓶中接種成骨細胞，培養至細胞附著 或形成單層細胞后轉移到生物反應器中進行立體培養； 4) 獲得可植入骨損傷部位的個性化的骨修復材料。
5. 權利要求4所述的制備方法，其中步驟2)所述打印過程中材料溫度范圍 為-30°C?-10°C，并且打印的材料持續給予冷風使其固定成型；打印完的骨組織支架進行 真空冷凍干燥。
6. 權利要求4所述的制備方法，其中所述骨組織支架在接種細胞前進行γ射線照射或 環氧乙烷熏蒸的無菌處理，并且將所述支架經培養液浸泡。
7. 權利要求4所述的制備方法，其中步驟3)中，接種細胞到骨組織支架，在培養瓶中培 養2天待骨組織支架上的細胞附著或形成單層后轉移骨組織支架到生物反應器中，立體培 養，其中流加培養基的速度為5ml/min-15ml/min，成骨細胞完全培養基包括如下成分： 低糖DMEM88 % (v/v),胎牛血清10 % (v/v), L-谷氨酸1 % (v/v),青/鏈霉素1 % (v/v)。hMSC成軟骨分化培養基包括如下成分：高糖DMEM96. 3% (v/v)，L-谷氨酸1% (v/ '〇，青/鏈霉素1%卜八)，10_31凡抗壞血酸0.5(%〇八)，1_31/1^地塞米松0.01 (%〇/ v)，40 μ g/L L-脯氨酸 0· 1 % (v/v)，1000 μ g/L 丙酮酸鈉 0· 1 % (v/v)，ITS+Premixl % (v/
【文檔編號】A61L27/22GK104147641SQ201410330587
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月11日 優先權日:2014年7月11日
【發明者】張麗君, 張英, 張登央, 王飛, 王妍 申請人:深圳職業技術學院