一種血瘀證勃起功能障礙動物模型的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種血瘀證勃起功能障礙動物模型的制作方法，包括如下步驟：S1：將大鼠置于電擊設備中，給予持續電刺激；S2：將大鼠置于噪聲設備中，給予高頻噪聲刺激；S3：將大鼠放入冰水混合的游泳設備中，使其冰泳。本發明通過采用電擊、噪音和冰泳的復合因素成功地建立了血瘀證ED大鼠模型，避免了采用一種刺激強度較弱，成模時間延長，成模率低等情況，同時避免了單一較弱刺激動物容易出現適應現象的問題。另外，本發明的復合因素實施較為方便，容易定量，將電流和噪音控制在合適的范圍內，成模率高。
【專利說明】
【技術領域】
[0001] 本發明涉及醫學和動物行為學領域，涉及一種血瘀證勃起功能障礙動物模型的建 立方法。 一種血瘀證勃起功能障礙動物模型的制作方法
【背景技術】
[0002] 勃起功能障礙（erectile dysfunction, ED，中醫稱為"陽痿"）是一種常見的男 性疾病，一直以來是泌尿外科及男科的研究熱點。在中醫病因病機理論中，多認為因情志刺 激影響肝的疏泄功能而使肝郁氣滯，或因縱欲房勞、久病體虛而精血虧虛、耗傷腎氣，致瘀 血阻絡，宗筋氣血循行不暢，而發陽痿，其中肝郁和腎虛是最重要的兩個基礎病機，血瘀則 是陽痿的重要病理因素[李柳驥，嚴季瀾。陽痿病因病機述略。吉林中醫藥，2011,31(9): 819-821.]。由上病機闡述可見，陽痿病人，尤其是病情嚴重或久治不愈的病人，多存在血瘀 證候表現。
[0003] 血瘀證動物模型的相關研究已有多年歷史，但這些模型多以血液循環障礙與微循 環障礙為特征，僅從機體某一局限性生化、病理等指標變化來反映血瘀這一中醫證候，并非 從整體出發，不能反映機體整體情況，模型判斷標準也存在一些問題。一個理想的中醫證候 模型，應該體現中醫學"有諸內必行諸于外"的整體觀念，利用動物的生物體表特征來模擬 人體證候的特征[田金洲，王永炎，時晶，等。證候模型研究的思路。北京中醫藥大學學報， 2005,28(6) :18-21.]。血瘀證在人身上主要以舌暗、有瘀點或瘀斑、舌下靜脈曲張、唇痿舌 青、口燥但欲漱水不欲咽、疼痛夜甚或痛處不移、脈微大來遲或澀等為表現特征[時晶，田 金洲，王永炎，等。血瘀證的生物學基礎研究。中華中醫藥雜志，2006,21(6) :363-364.]，在 動物模型上，則體現在動物的舌象、唇象、耳廓、尾尖、眼球、毛皮以及動物行為等方面，主要 表現為舌質色澤紫暗，舌下脈絡色澤紫暗，脈絡明顯增長、增粗，耳廓等部位脈絡亦出現相 似改變；進食、飲水及活動減少等。此類能夠模擬人體證候特征的動物模型目前有一種報道 [尹軍祥，田金洲，王永炎，等。寒凝血瘀證表征模型的建立。北京中醫藥大學學報，2006， 29 (10) :682-685.]，但無該造模方法導致ED的報道。
[0004] 目前用于ED研究的中醫證候動物模型多為肝郁型ED模型[劉林錫，趙秀珍，劉煜 德。勃起功能障礙的中醫研究概況。亞太傳統醫藥，2010,6(6) :170-171.]及腎陽虛型ED 模型[樊金卿，孫一鳴，趙兵，等。鹿仲溫腎水丸對腎陽虛型勃起功能障礙的研究。中醫藥 信息，2013 (4) :36-37.]，其它證候ED模型建立較少，至今為止未見血瘀型ED動物模型相關 報道。
[0005] ED的西醫治療主要使用磷酸二酯酶-5抑制劑，總體而言能使65% -70%的患者 成功完成性交[McMahon C G. Erectile dysfunction. Internal medicine journal, 2014, 44(1) :18-26.]。但該類藥物的使用存在一些禁忌癥，同時也有不同程度的副作用，甚至可 能導致嚴重的心血管事件發生，且對重度ED合并其它性功能障礙者療效欠佳。而中醫藥對 于"久病成瘀"、"久病入絡"的慢性疾病治療存在優勢，并能從整體上提高性功能，改善全身 健康狀況[劉保興，陳斌，王琦。論西地那非與中醫藥治療勃起功能障礙的優勢與不足。北 京中醫藥大學學報（中醫臨床版），2004, 2 :004.]，能彌補西藥的不足。因此，建立一個合 適、可靠的血瘀證ED模型對于篩選用于血瘀證ED治療的中藥、研究其作用機制及評估其治 療效果有重要意義
[0006] 相應地，動物模型的制作方法千差萬別，動物模型的不同勢必導致制作方法的不 同，而且其間通常不具備借鑒意義。現有的肝郁型ED模型的制作方法，通常使用束縛筒束 縛大鼠進行造模，需時50天，并且需要逐步改變束縛時間及束縛強度，操作較為復雜，且存 在束縛強度難以定量，造模時間較長等問題[張立俠，王慧.肝郁證勃起功能障礙大鼠模 型建立的實驗研究.中國男科學雜志，2007, 20(11) :29-31.]。雖然有血瘀證的動物模型報 道，但尚未有報道血瘀證ED動物模型。現有的外傷血瘀、熱毒血瘀、血虛血瘀等模型多采用 急性造模刺激因素，與ED的慢性發病過程不相符合；氣虛血瘀、寒凝血瘀、痰濁血瘀等慢性 刺激模型存在僅在局部刺激、模型僅有生化指標改變而不能產生動物的血瘀證生物表征、 模型不穩定，易逆轉等缺點[顏琳琳，周利紅，李琦.中醫血瘀證動物模型研究概況.中 醫雜志，2014, 55 (3) : 255-258.]。
【發明內容】
[0007] 為了解決上述現有技術存在的問題，本發明旨在提供一種血瘀證勃起功能障礙動 物模型的制作方法。
[0008] 本發明所述的血瘀證勃起功能障礙動物模型的制作方法，包括如下步驟：S1 :將 大鼠置于電擊設備中，給予持續電刺激；S2 :將大鼠置于噪聲設備中，給予高頻噪聲刺激； S3 :將大鼠放入冰水混合的游泳設備中，使其冰泳。
[0009] 所述步驟S1中的每次電刺激的電流為0. 8-1. 2mA，刺激時間為60-lOOs。
[0010] 所述步驟S1包括每間隔10-20min重復一次電刺激，共刺激6-10次。
[0011] 所述步驟S1包括分別在4-6周的造模周期內的每天的上下午分別進行所述6-10 次電刺激。
[0012] 所述步驟S2中的噪聲頻率為10000-20000HZ，強度為100-150dB，持續時間為 80-160s〇
[0013] 所述步驟S2包括每間隔10-20min重復一次噪聲刺激，共刺激6-10次。
[0014] 所述步驟S2包括分別在4-6周的造模周期內的每天的上下午分別進行所述6-10 次噪聲刺激。
[0015] 所述步驟S3中的冰泳時間為5-10min。
[0016] 所述步驟S3包括分別在4-6周的造模周期內的每天的上下午各進行一次冰泳。
[0017] 在所述步驟S3之前和/或之后，給大鼠注射腎上腺素。
[0018] 本發明通過屬于強烈的情志刺激的電擊，令動物因電擊痛楚產生恐懼、抑郁的情 緒；通過屬于較弱的情志刺激的噪音，令動物因聲音干擾產生煩躁、焦慮的情緒；通過屬于 寒凝刺激的冰泳,使動物氣血行運不暢，同時亦使動物產生恐懼、抑郁的情緒。通過評價，本 發明提供的方法能夠成功地建立了血瘀證ED大鼠模型，通過采用電擊、噪音和冰泳的復合 因素，避免了采用單一刺激強度較弱，成模時間延長，成模率低等情況，同時避免了單一較 弱刺激動物容易出現適應現象的問題。另外，本發明的復合因素實施較為方便，容易定量， 例如將電流和噪音控制在合適的范圍內，成模率高。而且，腎上腺素屬于血管活性藥物，具 有縮血管作用，在冰泳前后應用可使血管收縮，加強寒凝刺激產生的脈絡瘀阻作用。
【具體實施方式】
[0019] 下面給出本發明的較佳實施例，并予以詳細描述。
[0020] 材料與方法
[0021] 實驗動物：Sprague Dawley(SD)大鼠，清潔級，由上海交通大學醫學院實驗動物中 心提供。
[0022] 實驗器材：電刺激設備（電擊箱：Coulbourn Precision Animal Shocker ;型 號：H13-15 ;通電網：Coulbourn Instruments Habitest Operant Cage, Modular Shock Floor ;型號：H10-11R-TC-SF ;美國），噪聲刺激設備（Pyl印rol PT600A Integrated Stereo Amplifier, 300W Powerful Amplifier System, Multi-function Remote Controlled System,型號：PT-600A-0801-0145 ;美國），大鼠游泳桶（高60cm，直徑25cm圓柱形塑料 桶），多道生理信號采集處理系統（冊-6240,成都儀器廠）。
[0023] 實驗試劑：阿撲嗎啡（購自美國Sigma-Aldrich Corporation)，鹽酸腎上腺素注 射液（lml :lmg)。
[0024] 飼養環境：清潔級籠盒中飼養，溫度18°C_22°C，相對濕度55%-65%，光線自動控 制，明（07:00-19:00)暗（19:00-07:00)交替，自由進食、飲水。
[0025] 造模方法：采用電擊+噪音+冰泳復合刺激方法進行血瘀證ED造模，造模周期為 4-6 周。
[0026] 實施例1
[0027] (1)電擊：將大鼠置于鋪有鋼絲網的電擊設備中，給予持續電刺激（電流lmA)80s， 每間隔15min重復一次，共刺激8次。每日上下午各進行一次。
[0028] (2)噪聲：將大鼠置于密閉的噪聲設備中，給予高頻噪聲刺激（100dB，10000Hz)， 持續80s，每間隔15min重復一次，共刺激8次。每日上下午各進行一次。
[0029] ⑶冰泳：刺激前皮下注射0. 1%鹽酸腎上腺素0. 08ml/kg，間隔lh后，將大鼠放 入冰水混合的游泳桶中，游泳桶加水至約桶身2/3高度，并加入約400g碎冰（保持溫度為 〇°C )。進行冰泳5min，結束后迅速用干毛巾擦干，冰泳后lh再進行一次腎上腺素注射，劑 量同前。每日上下午各進行一次。
[0030] 實施例2
[0031] (1)電擊：將大鼠置于鋪有鋼絲網的電擊設備中，給予持續電刺激（電流 0.8mA) 100s，每間隔10min重復一次，共刺激6次。每日上下午各進行一次。
[0032] (2)噪聲：將大鼠置于密閉的噪聲設備中，給予高頻噪聲刺激（100dB，10000Hz)， 持續160s，每間隔10min重復一次，共刺激6次。每日上下午各進行一次。
[0033] (3)冰泳：刺激前皮下注射0· 1 %鹽酸腎上腺素0· 05ml/kg，間隔0· 5h后，將大鼠 放入冰水混合的游泳桶中，游泳桶加水至約桶身2/3高度，并加入約400g碎冰。進行冰泳 10min，結束后迅速用干毛巾擦干，冰泳后0. 5h再進行一次腎上腺素注射，劑量同前。每日 上下午各進行一次。
[0034] 實施例3
[0035] (1)電擊：將大鼠置于鋪有鋼絲網的電擊設備中，給予持續電刺激（電流 1. 2mA) 60s，每間隔20min重復一次，共刺激10次。每日上下午各進行一次。
[0036] (2)噪聲：將大鼠置于密閉的噪聲設備中，給予高頻噪聲刺激（150dB，20000Hz)， 持續80s，每間隔20min重復一次，共刺激10次。每日上下午各進行一次。
[0037] (3)冰泳：刺激前皮下注射0. 1 %鹽酸腎上腺素0. lml/kg，間隔1. 5h后，將大鼠 放入冰水混合的游泳桶中，游泳桶加水至約桶身2/3高度，并加入約400g碎冰。進行冰泳 lOmin，結束后迅速用干毛巾擦干，冰泳后1. 5h再進行一次腎上腺素注射，劑量同前。每日 上下午各進行一次。
[0038] 其中應當注意：電流優選為0. 8-1. 2mA，刺激時間優選為60-lOOs。噪聲頻率優 選為10000-20000HZ，強度優選為100-150dB，持續時間優選為80-160S。冰泳時間優選為 5-10min。其中，電擊需能引起大鼠在電網內跑動及驚叫，強度過大，刺激時間過長可導致 大鼠麻痹，局部肢體損傷，影響大鼠一般健康情況。噪聲頻率需稍低于敏感聽閾，在敏感聽 閾長期刺激可影響大鼠發情及交配行為，刺激強度及時間不足則影響成模率。冰泳時間過 短則寒凝刺激不足，時間過長如大于lOmin易導致部分大鼠溺死或低體溫時間過長，不利 于實驗。電擊和噪聲刺激可交替進行，減少大鼠對刺激的適應。注射腎上腺素可以加強寒 凝刺激產生的脈絡瘀阻作用，其劑量根據需要調整，優選為冰泳前后的0. 5h-l. 5h內，注射 〇· 1%鹽酸腎上腺素〇· 05-0. lml/kg。
[0039] 模型評價方法：造模刺激結束后禁食不禁水24h，進行評估實驗。
[0040] (1)血瘀證生物學表征評估：觀察60min大鼠進食、飲水及活動情況，稱量體重。 用3%戊巴比妥鈉溶液，按0. lml/100g體重劑量腹腔注射麻醉后，觀察舌下脈絡情況，眼結 膜、耳部、唇周、爪部末梢血液循環等其他特征。舌象包括：（1)舌質色澤紫暗，（2)舌下脈絡 色澤紫暗，（3)脈絡明顯增長、增粗。其他特征包括：（1)耳廓、口唇及爪等部位脈絡增粗、增 多或色澤較深，（2)進食、飲水或活動減少，（3)體重減輕。出現2項舌象指標改變，2項其 它特征改變判定為符合血瘀證表征動物。
[0041] (2)勃起功能評估：
[0042] 交配實驗：將雄性大鼠和發情的雌性大鼠放在同一籠內，適應環境lOmin后，觀察 60min內爬背次數、插入次數。
[0043] 阿撲嗎啡陰莖勃起實驗：阿撲嗎啡頸后皮下注射（5ml/kg)后，觀察30min，記錄有 無勃起及陰莖勃起次數。
[0044] 陰莖海綿體測壓實驗：用多通道電生理儀連續監測陰莖海綿體內壓30min，記錄 最大勃起現象，測量海綿體內壓改變。
[0045] 統計學方法：兩組間計量資料比較采用Student's t test方法分析，連續觀察的 計量資料采用paired t test方法分析，p〈0. 05計為有統計學意義，使用SAS軟件進行統 計。
[0046] 通過實現獲得如下數據：
[0047] 表1正常對照組大鼠與造模組大鼠體重變化
[0048]
【權利要求】
1. 一種血瘀證勃起功能障礙動物模型的制作方法，其特征在于，所述制作方法包括如 下步驟： 51 :將大鼠置于電擊設備中，給予持續電刺激； 52 :將大鼠置于噪聲設備中，給予高頻噪聲刺激； 53 :將大鼠放入冰水混合的游泳設備中，使其冰泳。
2. 根據權利要求1所述的制作方法，其特征在于，所述步驟S1中的每次電刺激的電流 為0. 8-1. 2mA，刺激時間為60-100s。
3. 根據權利要求2所述的制作方法，其特征在于，所述步驟S1包括每間隔10-20min重 復一次電刺激，共刺激6-10次。
4. 根據權利要求3所述的制作方法，其特征在于，所述步驟S1包括分別在4-6周的造 模周期內的每天的上下午分別進行所述6-10次電刺激。
5. 根據權利要求1所述的制作方法，其特征在于，所述步驟S2中的噪聲頻率為 10000-20000HZ，強度為 100-150dB，持續時間為 80-160s。
6. 根據權利要求5所述的制作方法，其特征在于，所述步驟S2包括每間隔10-20min重 復一次噪聲刺激，共刺激6-10次。
7. 根據權利要求6所述的制作方法，其特征在于，所述步驟S2包括分別在4-6周的造 模周期內的每天的上下午分別進行所述6-10次噪聲刺激。
8. 根據權利要求1所述的制作方法，其特征在于，所述步驟S3中的冰泳時間為 5_10min〇
9. 根據權利要求8所述的制作方法，其特征在于，所述步驟S3包括分別在4-6周的造 模周期內的每天的上下午各進行一次冰泳。
10. 根據權利要求1所述的制作方法，其特征在于，在所述步驟S3之前和/或之后，給 大鼠注射腎上腺素。
【文檔編號】A61B19/00GK104055579SQ201410320952
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年7月4日 優先權日:2014年7月4日
【發明者】戴繼燦, 陳翔, 胡超, 崔杰峰 申請人:上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院