純天然腦蛋白水解物原料制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種純天然腦蛋白水解物原料的制備方法,包括如下步驟：a.純化蛋白。取凍存新鮮豬腦，解凍，清洗，勻漿，離心分離，即得沉淀腦蛋白；b.胃蛋白酶酶解。加入胃蛋白酶攪拌，再加入濃鹽酸攪拌，然后離心分離，即得胃酶酶解液；c.酸水解。將胃酶酶解液加入硫酸進行水解，得酸水解液；d.胰蛋白酶酶解。調pH值至7-9，加入豬腦重量0.1-0.4%的胰酶進行水解，再離心分離，即得胰酶酶解液；e.層析。調pH值為6.5-7.5，用氨水解析，即得層析液；f.濃縮。真空濃縮，調pH值至6.5-7.5，然后凍結保存；g.去雜質。將濃縮冰凍液解凍，離心分離，超濾，即得天然腦蛋白水解物原料。
【專利說明】純天然腦蛋白水解物原料制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種純天然腦蛋白水解物原料制備方法。
【背景技術】
[0002] 純天然腦蛋白水解物是用豬腦提取的，無蛋白質，含有多種人體必需氨基酸、非 必需氨基酸、多肽等，具有廣闊的藥用前景。上世紀70年代，腦蛋白水解物最早由奧地利 EBEWE藥廠以Cerebrolysin (施普善)為商品名出售，用于治療小兒發育不全、老年癡呆、腦 血管病后遺癥等多種疾病及輔助治療，并取得良好的效果，得到臨床醫生的肯定。但當時所 有文獻數據中均未披露該制劑的制備方法。1995年，國家衛生部批準生產腦蛋白水解物注 射液。但是，國內制備得到的腦蛋白水解物氮含量偏低，達不到國家規定標準，只能通過"補 力口"外源氨基酸以達到規定標準，其制備方法大致相同，即脫脂、雙酶解、超濾、層析、加氨基 酸。而外源性"補加"氨基酸都是屬于生物發酵氨基酸和部分石油副產品合成氨基酸，與動 物蛋白質的水解氨基酸有很大區別。因此，2008年12月15日，國家藥監辦【2008】734號文 件要求腦蛋白水解物不得補加外源性氨基酸。2012年7月20日國家藥典委員會發布《關于 腦蛋白水解物系列品種質量標準修訂稿征求意見的通知》(國藥典化發2012 [2012]400號)， 所附標準明確規定了腦蛋白水解物系列品種生產過程中不得添加非水解產物如各種氨基 酸，并附腦蛋白水解物溶液質量標準。但是，如果不"補加"氨基酸，則均不能生產出合格的 產品，主要是指紋圖譜相似度均不能達到90%的標準，而且注射液產品在儲存過程中有絮 狀物和酪氨酸沉淀物等致澄清度不合格。
[0003] 因此，尋找一種既不需要外源性"補加"氨基酸又能制備出符合國家標準的純天然 腦蛋白水解物原料的制備方法成為本領域亟待解決的技術問題。
【發明內容】
[0004] 本發明要解決的技術問題就是提供一種既不需要外源性補加氨基酸又能制備出 符合國家標準的純天然腦蛋白水解物原料的制備方法。
[0005] 為了解決上述技術問題，本發明提供的方法包括如下步驟： a. 純化蛋白，取凍存新鮮豬腦，解凍，清洗，勻漿，將漿液加入濃鹽酸攪勻、然后離心分 離，去除上層乳濁液，收集沉淀物，即得沉淀腦蛋白； b. 胃蛋白酶酶解，將經上述步驟得到的沉淀蛋白加水勻漿，然后加入胃蛋白酶攪拌，再 加入濃鹽酸攪拌，然后離心分離，收集上清液，即得胃酶酶解液； c. 酸水解，將經上述步驟所得胃酶酶解液加入硫酸進行水解，得酸水解液； d. 胰蛋白酶酶解，將經上述步驟所得酸水解液調pH值至7-9,加入豬腦重量0. 1-0.4% 的胰酶進行水解，再離心分離，即得胰酶酶解液； e. 層析，將經上述步驟所得胰酶酶解液調pH值為6. 5-7. 5,再用氨水解析，即得層析 液； f. 濃縮，將經上述步驟所得層析液真空濃縮，調pH值至6. 5-7. 5,然后凍結保存； g.去雜質，將經上述步驟所得濃縮冰凍液解凍，然后離心分離，收集上清液，將上清液 超濾，即得天然腦蛋白水解物原料。
[0006] 作為進一步改進，所述純化蛋白步驟，取凍存新鮮豬腦，加水浸泡自然解凍，再用 水清洗，然后加入豬腦重2-4倍重量的純化水用膠體磨勻漿15min，將勻漿所得漿液倒入提 取罐中加熱至70-KKTC后保溫10_30min，再按豬腦重每lkg加入2-5 ml的比例加入濃度 為12mol/L的濃鹽酸攪勻、冷卻至10-50°C，再以3000-4000r/min的速度離心分離，然后去 除上層乳濁液，收集沉淀物，即得沉淀腦蛋白。
[0007] 作為進一步改進，所述胃蛋白酶酶解步驟，將經純化蛋白步驟得到的沉淀蛋白 按豬腦與水的重量比1:1-3的比例加純化水，勻漿15min，倒入提取罐中，加熱升溫至 30-50°C，然后加入豬腦重1-2%的胃蛋白酶攪拌10-15min，再按豬腦重每lkg加7-9 ml的 比例加入濃度為12mol/L的濃鹽酸攪拌1-4小時后靜置保溫1-3小時，然后以3000-4500r/ min的速度離心分離，收集上清液，即得胃酶酶解液。
[0008] 作為進一步改進，所述酸水解步驟，將經胃蛋白酶酶解步驟所得胃酶酶解液加入 濃度為18. 4mol/L的濃硫酸進行水解，酶解液與濃硫酸的體積比為1:62. 5-750,加熱至 80-121°C，水解3-6h，然后冷卻至30-40°C，即得酸水解液。
[0009] 作為進一步改進，所述胰蛋白酶酶解步驟，將經酸水解步驟所得酸水解液加熱至 30-50°C，用6mol/L氫氧化鈉溶液調pH值至7-9,加入豬腦重量0. 1-0. 4%的胰酶進行水解 3-8小時，再加熱至70-100°C，然后保溫10_30min，再冷卻至10-50°C，再用300目濾網過 濾，然后以3000-4500r/min的速度離心分離，即得胰酶酶解液。本步驟胰酶的加入量為豬 腦重量0. 1-0. 4%，超過該范圍將影響除雜效果，優選為0. 1-0. 3%，更優選為0. 1-0. 2%，進一 步優選為〇. 15%。
[0010] 作為進一步改進，所述層析步驟，將經胰蛋白酶酶解步驟所得胰酶酶解液過陽離 子交換柱，然后用純化水沖洗至pH值為6. 5-7. 5,再用1. 8-2mol/L氨水解析，即得層析液。
[0011] 作為進一步改進，所述濃縮步驟，將經上述步驟所得層析液以60-90°C條件下真 空濃縮至豬腦重的30%，然后用6mol/L鹽酸溶液調pH值至6. 5-7. 5，在24小時內冷卻至 0-10°C，然后在_20°C中凍結保存。
[0012] 作為進一步改進，所述去雜質步驟，將經層析步驟所得濃縮冰凍液，自然解凍，然 后以3000-4500r/min的速度離心分離，收集上清液，將上清液用8000道爾頓分子量膜進行 超濾，即得天然腦蛋白水解物原料。本步驟濃縮冰凍液自然解凍后以3000-4500r/min的速 度離心分離，可以進一步提高去雜效果，而且能減少超濾時間，提高效率。
[0013] 采用本發明的方法能夠實現本發明的目的。
[0014] 本發明的方法是 申請人:在對現有技術進行長期深入的研究和反復比較試驗后得 到的。 申請人:在研究中發現，現有技術之所以均不能生產出合格的產品即指紋圖譜相似度 均小于90%、且注射液產品在儲存過程中有絮物狀物和酪氨酸沉淀物致澄清度不合格，主要 原因是因常規方法加入胰蛋白酶量過大，皆為豬腦重量的1-3%，以此量加入胰蛋白酶酶解 后的原液去除酪氨酸沉淀及相關雜質后、指紋圖譜相似度只能達到50-80%，均不符合標準 要求；如果酶解后加熱60-90°C，可以去除部分酪氨酸沉淀及相關雜質，指紋圖譜相似度能 夠達到90%的標準，但是酪氨酸含量會增加，導致后續生產出來的成品有絮物狀物和酪氨 酸沉淀，致使產品澄清度不合格；減少胰蛋白酶加入量，將胰蛋白酶加入量減少為豬腦重量 的0. 1-0. 4%，便能徹底去除酪氨酸沉淀及相關雜質，能夠克服現有技術的腦蛋白水解物成 品含有絮物狀和酪氨酸沉淀物致使澄清度不夠的缺陷。但是，胰蛋白酶加入量減少為豬腦 重量的0. 1-0. 4%時，胰蛋白酶水解又不夠充分，脯氨酸及部分氨基酸量少，致肽含量很高， 肽含量大于60%以上，導致產品中總氨基酸含量大于100%，不符合質量標準要求（國家藥典 委員會規定的質量標準要求是總氨基酸含量為85-100%);在胃蛋白酶酶解和胰蛋白酶酶解 二個步驟之間增加硫酸水解的步驟，就能使胰蛋白酶水解充分，能使產品完全符合質量標 準要求。
[0015] 經采用常規技術手段檢測，采用本發明的方法制備的天然腦蛋白水解物原料 指紋圖譜相似度大于90%、澄清度及相關檢測項目均符合國家藥典委員會（國藥典化發 2012[2012]400號）規定的質量標準，詳見下表和附圖。
[0016] 檢測情況表
【權利要求】
1. 一種純天然腦蛋白水解物原料制備方法，其特征在于包括如下步驟： a. 純化蛋白，取凍存新鮮豬腦，解凍，清洗，勻漿，將漿液加入濃鹽酸攪勻、然后離心分 離，去除上層乳濁液，收集沉淀物，即得沉淀腦蛋白； b. 胃蛋白酶酶解，將經上述步驟得到的沉淀蛋白加水勻漿，然后加入胃蛋白酶攪拌，再 加入濃鹽酸攪拌，然后離心分離，收集上清液，即得胃酶酶解液； c. 酸水解，將經上述步驟所得胃酶酶解液加入硫酸進行水解，得酸水解液； d. 胰蛋白酶酶解，將經上述步驟所得酸水解液調pH值至7-9,加入豬腦重量0. 1-0.4% 的胰酶進行水解，再離心分離，即得胰酶酶解液； e. 層析，將經上述步驟所得胰酶酶解液調pH值為6. 5-7. 5,再用氨水解析，即得層析 液； f. 濃縮，將經上述步驟所得層析液真空濃縮，調pH值至6. 5-7. 5,然后凍結保存； g. 去雜質，將經上述步驟所得濃縮冰凍液解凍，然后離心分離，收集上清液，將上清液 超濾，即得天然腦蛋白水解物原料。
2. 根據權利要求1所述的純天然腦蛋白水解物原料制備方法，其特征在于：所述純 化蛋白步驟，取凍存新鮮豬腦，加水浸泡自然解凍，再用水清洗，然后加入豬腦重2-4倍重 量的純化水用膠體磨勻漿15min，將勻漿所得漿液倒入提取罐中加熱至70-100°C后保溫 10-30min，再按豬腦重每lkg加入2-5 ml的比例加入濃度為12mol/L的濃鹽酸攪勻、冷卻 至10-50°C，再以3000-4000r/min的速度離心分離，然后去除上層乳濁液，收集沉淀物，即 得沉淀腦蛋白。
3. 根據權利要求1所述的純天然腦蛋白水解物原料制備方法，其特征在于：所述胃蛋 白酶酶解步驟，將經純化蛋白步驟得到的沉淀蛋白按豬腦與水的重量比1:1-3的比例加純 化水，勻漿15min，倒入提取罐中，加熱升溫至30-50°C，然后加入豬腦重1-2%的胃蛋白酶攪 拌10-15min，再按豬腦重每lkg加7-9 ml的比例加入濃度為12mol/L的濃鹽酸攪拌1-4小 時后靜置保溫1-3小時，然后以3000-4500r/min的速度離心分離，收集上清液，即得胃酶酶 解液。
4. 根據權利要求1所述的純天然腦蛋白水解物原料制備方法，其特征在于：所述酸 水解步驟，將經胃蛋白酶酶解步驟所得胃酶酶解液加入濃度為18. 4mol/L的濃硫酸進行 水解，酶解液與濃硫酸的體積比為1:62. 5-750,加熱至80-121°C，水解3-6h，然后冷卻至 30-40°C，即得酸水解液。
5. 根據權利要求1所述的純天然腦蛋白水解物原料制備方法，其特征在于：所述胰蛋 白酶酶解步驟，將經酸水解步驟所得酸水解液加熱至30-50°C,用6mol/L氫氧化鈉溶液調 pH值至7-9,加入豬腦重量0. 1-0. 4%的胰酶進行水解3-8小時，再加熱至70-100°C，然后 保溫10-30min，再冷卻至10-50°C，再用300目濾網過濾，然后以3000-4500r/min的速度離 心分離，即得胰酶酶解液。
6. 根據權利要求1所述的純天然腦蛋白水解物原料制備方法，其特征在于：所述層析 步驟，將經胰蛋白酶酶解步驟所得胰酶酶解液過陽離子交換柱，然后用純化水沖洗至pH值 為6. 5-7. 5,再用1. 8-2mol/L氨水解析，即得層析液。
7. 根據權利要求1所述的純天然腦蛋白水解物原料制備方法，其特征在于：所述濃縮 步驟，將經上述步驟所得層析液以60-90°C條件下真空濃縮至豬腦重的30%，然后用6mol/L 鹽酸溶液調pH值至6. 5-7. 5，在24小時內冷卻至0-10°C，然后在-20°C中凍結保存。
8.根據權利要求1所述的純天然腦蛋白水解物原料制備方法，其特征在于：所述去雜 質步驟，將經層析步驟所得濃縮冰凍液，自然解凍，然后以3000-4500r/min的速度離心分 離，收集上清液，將上清液用8000道爾頓分子量膜進行超濾，即得天然腦蛋白水解物原料。
【文檔編號】A61K35/30GK104096215SQ201410319262
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月7日 優先權日:2014年7月7日
【發明者】釧助勝, 宋彥坤, 耿華靖, 彭亞聰, 彭長福 申請人:湖南利諾生物藥業有限公司