包含瘧原蟲抗原的疫苗的制作方法

包含瘧原蟲抗原的疫苗的制作方法
【專利摘要】本發明涉及瘧疾抗原免疫對抗瘧疾疾病的新用途。具體地說，本發明涉及子孢子抗原、具體地說為環子孢子(CS)蛋白或其片段免疫對抗嚴重瘧疾疾病的用途。
【專利說明】包含瘧原蟲抗原的疫苗
[0001]本申請是申請日為2005年9月14日，申請號為200580038022.6 (PCT/EP2005/009995)，發明名稱為“包含瘧原蟲抗原的疫苗”的發明專利申請的分案申請。
[0002]本發明涉及瘧疾抗原免疫對抗瘧疾疾病的新用途。具體地說，本發明涉及子孢子抗原、具體地說為環子孢子(CS)蛋白或其片段免疫對抗嚴重瘧疾疾病的用途。
[0003]瘧疾是世界的主要健康問題之一。在20世紀中，經濟和社會發展連同抗瘧疾運動已導致在世界的大部分區域中根除了瘧疾，將世界上受感染區域由50%降至27%。盡管如此，根據預期的人口增長，預計至2010年世界一半人口(接近35億人)將居住在瘧疾傳播區域^現時的估計表明，每年由于瘧疾死亡的人數遠超過I百萬，僅非洲的龐大經濟成本就相當于每年1000億美元2。
[0004]這些數字突顯了全球性的瘧疾危機和向國際衛生機構提出的挑戰。此危機的原因是多方面的，范圍從可獲得的、可承受的和先前高效的藥物的廣泛抗性的出現，到衛生系統的衰弱和不足、資源缺乏。除非發現了控制該病的方法，否則改善健康和幼兒生存、減少貧困、增加安全性和增強最易受攻擊社群的全球性努力將失敗。
[0005]該疾病的一種最急性形式是由原生動物寄生蟲惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)引起的,該寄生蟲是由于痕疾引起的大部分死亡的原因。
[0006]惡性瘧原蟲(P.falciparum)的生活周期復雜，需要人和蚊兩個寄主來完成。人的感染是由被感染蚊子唾液中的子孢子接種啟動的。子孢子遷移到肝臟并在那里感染肝細胞(肝期)，它們在肝細胞中分化，經紅細胞外胞內期(exoerythrocytic intracellularstage)進入裂殖子期，裂 殖子感染紅細胞(RBC)，以啟動無性血液期中的周期性復制。該周期以RBC中的許多裂殖子分化成蚊子攝取的有性期配子體完成，在蚊子中有性期配子體在中央管中經過一系列時期的發育產生子孢子，子孢子遷移到唾液腺。
[0007]子孢子期的惡性瘧原蟲已被鑒定為瘧疾疫苗的一個潛在靶。子孢子的主要表面蛋白質稱為環子孢子蛋白質(CS蛋白質)。已對各種品系該蛋白質進行了克隆、表達和測序，例如 NF54 品系克隆 3D7 (Caspers 等，Mol.B1chem.Parasitol.35，185-190，1989)。品系3D7的該蛋白質的特征是具有中央免疫顯性重復區，該區含有重復40次的四肽Asn-Ala-Asn-Pro,但其中散布了四個次要重復序列Asn-Val-Asp-Pro。在其它品系中，主要和次要重復序列的數目以及它們相對的位置有變化。這一中央部分與N和C末端部分側接，N和C末端部分由非重復的氨基酸序列組成，命名為CS蛋白質的無重復部分。
[0008]GlaxoSmithKline B1logicals 的基于 CS 蛋白的 RTS，S 瘧疾疫苗自 1987 年以來就處于研發中，目前是最先進的在研侯選瘧疾疫苗4。該疫苗特異性靶向紅細胞前期的惡性瘧原蟲，在未感染瘧疾的成年志愿者中賦予對實驗室培育的被感染蚊子傳遞的惡性瘧原蟲子孢子感染的保護，以及賦予半免疫成人抗天然暴露的保護5’6。
[0009]RTS，S/AS02A(RTS，S加佐劑)用于在岡比亞進行的連續I期研究，包含6_11歲和1-5歲的兒童，該研究證實所述疫苗是安全的、良好耐受的和免疫原性的7。隨后，選擇兒科疫苗劑量并在包含1-4歲莫桑比克兒童的I期研究中進行研究，在該研究中發現所述疫苗是安全的、良好耐受的和免疫原性的8。[0010]但是，長期以來人們一直堅持這樣的觀點:為在天然暴露的條件下獲得免于患惡性瘧原蟲引起的臨床疾病的保護作用，應需要一種以上的抗原，并應需要代表所述寄生蟲生命周期的多個時期的多種抗原(第3頁,Webster,Daniel and Hill,Adrian V.S.Progresswith new malaria vaccines.Bull World Health Organ, Dec.2003,81 卷，第 12 章，902-909頁，ISSN0042-9686 ；Hoffman S.Save the children.Nature.2004 年 8 月 19 日；430(7002):940-1)。人們一般還持有這樣的觀點:對提供抗嚴重疾病的保護作用來說，例如來自紅細胞前期寄生蟲的CS的抗原應不是優選抗原，因為嚴重疾病由無性期寄生蟲引起，而紅細胞前期抗原如CS不在無性期寄生蟲上表達。
[0011]現在已在幼年非洲兒童的實驗中用紅細胞前期瘧疾抗原獲得了令人驚訝的結果。業已發現，基于CS蛋白的RTS，S疫苗不僅可賦予抗在天然暴露下感染的保護作用，而且賦予抗惡性瘧原蟲引起的廣譜臨床疾病的保護作用。接受RTS，S疫苗的兒童經歷的嚴重不良事件、住院治療和嚴重的瘧疾并發癥(包括死亡)比對照組少。
[0012]具體地說，此基于CS的疫苗可降低嚴重瘧疾疾病發病率的研究結果是出乎意料和今人驚訝的。嚴重瘧疾疾病描述于WHO臨床實驗規范指南(第3頁:World HealthOrganizat1n.Management of severe malaria,實用手冊，第 2 版，2000.http://mosquit0.wh0.1nt/docs/hbsm.pdf)。遵照基于WHO的嚴重瘧疾定義的兒童分類法鑒別患病非常嚴重的兒童和高危垂死的兒童。高危可用于指約30%或以上的死亡風險。
[0013]而且,抗新感染或臨床發作這二者的RTS, S疫苗效力似乎不衰減,也不緩慢衰減。在實驗中的6個月隨訪結束時，所述疫苗仍有效，盡管在感染發病率方面有顯著差異。這與先前在未感染瘧疾的志愿者或網比亞成人中進行的實驗形成強烈反差，所述實驗提示疫苗效力是短期的6’23。 [0014]因此，本發明提供瘧原蟲(Plasmodium)抗原在藥物生產中的用途，所述瘧原蟲抗原在紅細胞前期表達，優選為子孢子抗原，所述藥物用于抗嚴重瘧疾疾病的接種，所述瘧原蟲抗原與藥物可接受的佐劑或載體組合。
[0015]本發明尤其涉及降低嚴重惡性瘧原蟲疾病的發病率。
[0016]此疫苗的優選目標群是兒童，具體地說是5歲以下的兒童，尤其是1-4歲的兒童。
[0017]優選地，所述瘧原蟲抗原為惡性瘧原蟲抗原。
[0018]所述抗原可選自在子孢子或其它紅細胞前期(例如肝期)寄生蟲上表達的任意抗原。優選地，所述抗原選自環子孢子(CS)蛋白、肝期抗原-1(1^^-1)、肝期抗原-3(1^^-3)、血小板反應蛋白相關性未名蛋白(TRAP)以及最近已表明在肝期(以及紅細胞期)存在的頂端裂殖子抗原-1 (AMA-1)。所有這些抗原在本領域都是周知的。所述抗原可為完整蛋白或其免疫原性片段。瘧疾抗原的免疫原性片段是眾所周知的，例如AMA-1的胞外結構域。
[0019]優選地,所述痕原蟲抗原融合至乙肝表面抗原(HBsAg)。
[0020]用于本發明的優選抗原衍生自環子孢子(CS)蛋白，優選為與HbsAg的雜合蛋白形式。所述抗原可為完整的CS蛋白或其部分，包括CS蛋白的一個或多個片段，所述多個片段
可融合在一起。
[0021 ] 優選地，基于CS蛋白的抗原為雜合蛋白形式，其含有基本上全部的瘧原蟲CS蛋白的C端部分、4個或更多個串聯重復的CS蛋白免疫顯性區以及乙肝表面抗原(HBsAg)。優選地，所述雜合蛋白包含含有與CS蛋白C端部分基本同源的至少160個氨基酸的序列。具體地說，“基本全部的”CS蛋白的C末端部分包括沒有疏水錨區序列的C末端。CS蛋白可沒有C末端的最后12個氣基酸。
[0022]最優選地，用于本發明的雜合蛋白是含惡性瘧原蟲CS蛋白部分的蛋白，該CS蛋白基本對應于品系NF54來源的惡性瘧原蟲3D7克隆(Caspers等，出處同上)的氨基酸207-395,由線性接頭按照讀框融合至HbsAg的N末端。所述接頭可包含HbsAg的preS2的一部分。
[0023]用于本發明的優選CS構建物概述于W093/10152。最優選的是稱為RTS的雜合蛋白，其描述于W093/10152(其中將其稱為RTS*)和W098/05355，這兩個專利的公開內容通過引用結合到本文中。
[0024]特別優選的雜合蛋白是稱為RTS的雜合蛋白，其由以下組成:
[0025]?甲硫氨酸殘基，由核苷酸1059-1061編碼，來源于釀酒酵母TDH3基因序列。(Musti A.m.等，Genel983 25 133-143)。
[0026].3個氨基酸Met Ala Pro,來源于通過用于構建雜合基因的克隆方法建立的核苷酸序列(1062-1070)。
[0027]?一段189個氨基酸的序列，由代表惡性瘧原蟲品系3D7 (Caspers等，出處同上)的環子孢子蛋白(CSP)的氨基酸207-395的核苷酸1071-1637編碼。
[0028]?由核苷酸1638-1640編碼的氨基酸(Gly)，通過用于構建雜合基因的克隆方法建立。
[0029].4個氨基酸Pro Val Thr Asn,由核苷酸1641-1652編碼，代表乙肝病毒(旦也血清型)preS2蛋白(Nature280 =815-819,1979)的4個羧基末端殘基。
[0030].一段226個氨基酸的序列，由核苷酸1653-2330編碼,表不乙肝病毒(adw血清型)的S蛋白。
[0031]優選地，所述RTS為混合顆粒RTS，S形式。
[0032]優選的RTS，S構建物包含兩種多肽RTS和S，其同時被合成，并在純化過程中自發形成復合顆粒結構(RTS，S)。
[0033]RTS蛋白優選在酵母中表達,最優選在釀酒酵母(S.cerevisiae)中表達。在該宿主中，RTS將作為脂蛋白顆粒表達。優選的受者酵母菌株優選地已在其基因組中攜帶若干乙肝病毒S表達盒的整合拷貝。獲得的菌株由此合成兩種多肽S和RTS，其自發地共組裝成混合的(RTS，S)脂蛋白顆粒。這些顆粒有利地在其表面存在所述雜合體的CSP序列。有利地，這些混合顆粒中的RTS: S比率為1: 4。
[0034]本發明允許在疫苗中使用單一瘧疾抗原，與先前認為產生保護作用(特別是抗嚴重疾病的保護作用)應需要的相反。因此，按照本發明，RTS或其它抗原優選為疫苗中的唯
一痕疾抗原。
[0035]另一方面，本發明提供來自單一瘧疾蛋白的抗原在制備用于接種對抗嚴重瘧疾的藥物中的用途。所述瘧疾蛋白可為本文描述的任何蛋白，包括CS蛋白、AMA-1、TRAP、LSA-1和LSA-3。最優選地其為本文所述雜合形式的CS蛋白。
[0036]本發明還提供預防或減少嚴重瘧疾的方法，該方法包括給予對象含在紅細胞前期表達的瘧疾抗原和佐劑的組合物。所述抗原和佐劑如本文所述。優選的對象是兒童，優選在本文所述年齡范圍內。[0037]適用于本發明的接種流程包括以I個月的間隔給予3劑疫苗。
[0038]嚴重瘧疾可按照WHO臨床實驗規范指南(出處同上)定義。在本文所述研究中，用于定義嚴重拒疾的標準源自WHO臨床實驗規范指南，并在下表中給出。
[0039]作為主要終點，在所述研究中定義的瘧疾臨床發作要求存在在Giemsa染色的厚血涂片上> 15000/μ I的惡性瘧原蟲無性寄生蟲血癥，并出現≥37.5°C的發熱(腋下體溫≥ 37.5 0C )。
[0040]嚴重瘧疾的定義是另外存在以下一種或多種:嚴重瘧疾貧血(PCV < 15% )、腦型 (Blantyre昏迷記分< 2)或其它人體系統的嚴重疾病，所述疾病可包括多次癲癇發作
(在之前的24小時中有兩次或多次全身性抽搐)、虛脫(定義為不能獨立地坐)、低血糖(< 2.2臟01/<11^或< 40mg/dL)、臨床可疑的酸中毒或循環裳竭。這些在下表1中給出。
[0041]嚴重瘧疾病例定義
[0042]
【權利要求】
1.瘧原蟲ipiasmodium)抗原在生產藥物中的用途，所述瘧原蟲抗原在紅細胞前期表達，所述藥物用于降低惡性瘧原蟲引起的嚴重瘧疾疾病的發病率，所述瘧原蟲抗原與藥物可接受的佐劑或載體組合，其中所述瘧原蟲抗原為環子孢子蛋白(CS)或對應于惡性瘧原蟲NF54品系3D7克隆的氨基酸207-395的惡性瘧原蟲CS蛋白序列， 其中所述抗原與佐劑組合使用，所述佐劑為Thl細胞應答的優選刺激劑并且包含脂質體以及3D-MPL、QS21或3D-MPL與QS21的組合，并且其中所述藥物的目標群體為1_4歲的兒童。
2.權利要求1的用途，其中所述環子孢子蛋白抗原或其免疫原性片段融合至乙肝表面抗原(HBsAg)。
3.權利要求2的用途，其中所述CS蛋白或片段為雜合蛋白形式，所述雜合蛋白含全部的瘧原蟲{Plasmodium) CS蛋白的C端部分、4個或更多個串聯重復的CS蛋白免疫顯性區以及乙肝表面抗原(HBsAg)。
4.權利要求3的用途，其中所述雜合蛋白包含對應于惡性瘧原蟲仍falciparum)NF54品系3D7克隆CS蛋白的氨基酸207-395的惡性瘧原蟲ip.falciparum) CS蛋白序列，所述CS蛋白序列經線性接頭按照讀框融合至HBsAg的N末端。
5.權利要求4的用途，其中所述雜合蛋白為RTS。
6.權利要求5的用途，其中所述RTS為混合顆粒RTS，S形式。
7.權利要求6的用途，其中RTS，S的量為每劑25μ g。
【文檔編號】A61K39/015GK104027795SQ201410301031
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2005年9月14日 優先權日:2004年9月16日
【發明者】J.D.科亨, N.G.托爾尼波特 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司