一種提取銀杏葉有效成分總黃酮和萜內酯的方法

一種提取銀杏葉有效成分總黃酮和萜內酯的方法
【專利摘要】本發明公開了一種提取銀杏葉有效成分總黃酮和萜內酯的方法。本發明方法包括如下步驟：將銀杏葉粉末溶于70％乙醇中，于70℃恒溫水浴中提取6h，離心取上清得到銀杏葉提取液；用大孔吸附樹脂制備吸附柱，將銀杏葉提取液裝入柱吸附中，充分吸附后，讓其自然流下，收集洗脫液，得到低濃度銀杏酸的銀杏葉提取液。通過本發明方法得到的提取液中總黃酮含量為24.36％，萜內酯含量為6.01％；經過洗脫后銀杏酸的濃度降為0.051mg/mL。本發明在保證總黃酮和萜內酯高提取量的情況下，使銀杏酸的含量也大幅度降低。本發明方法成本較低，提取時間較短，并且操作簡便，不污染環境，值得推廣。
【專利說明】一種提取銀杏葉有效成分總黃酮和萜內酯的方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及銀杏葉的提取，具體涉及一種提取銀杏葉有效成分總黃酮和萜內酯的 方法。

【背景技術】
[0002] 銀杏科銀杏屬植物銀杏Ginkgo biloba L.的葉，在治療心腦血管疾病、增加冠狀 動脈血流量以及治療腦缺血、腦老化、老年癡呆癥、哮喘方面等有很好的療效。早在宋朝我 國民間就使用銀杏葉治療哮喘和支氣管炎。當前隨著藥物提取工藝標準化和藥理活性研 究的深入，世界各地特別是法國、德國、日本、意大利、比利時、南韓、美國等國相繼研制銀杏 葉提取物的各種制劑，成為歐洲和其它地區老年病用藥暢銷藥品。我國的銀杏制劑市場在 1997?2000年曾經快速增長，片劑、注射劑成為制劑市場的主導劑型膠囊、滴劑也展示了 良好的發展潛力。在中國生產銷售銀杏制劑的企業30余家，如北京雙鶴制藥股份有限公司 (舒血寧注射液）、浙江康恩貝制藥股份有限公司（天保寧）、三九制藥股份有限公司（999 銀杏葉片）、山西傅山制藥股份有限公司（絡欣通）、上海杏靈制藥股份有限公司（杏靈） 等。目前的我國市場現狀僅處在一個剛認識、剛開發的階段，銀杏葉的綜合開發剛剛開始， 中國的市場空間巨大的，前景廣闊。
[0003] 銀杏葉提取物中的有效成分主要為黃酮類化合物和萜內酯等。
[0004] (1)總黃酮：目前，從銀杏葉中提取黃酮的方法很多，通常可分為傳統方法和新興 方法兩種。傳統方法主要有：浸漬法、滲漉法、煎煮法、回流提取法等。其中又以回流提取 法在銀杏葉提取黃酮的研究中用的多，其大致可分為兩步：首先是用水或有機溶劑萃取銀 杏葉，制備銀杏葉提取物。然后在前一步的基礎上進行精加工，采用樹脂法、溶劑法精制銀 杏葉提取物，得到較純品。有機溶劑萃取法是目前國內外普遍采用的方法。這種方法影響 有效成分產率主要因素是有機溶劑的選取，研究表明用不同的有機溶劑提取對黃酮產率的 影響各不相同。以60%丙酮為溶劑，黃酮得率為18. llmg/g ;以乙醇為溶劑，不同濃度乙醇 對黃酮得率有一定影響，最佳萃取條件以70%乙醇為溶劑，溫度控制在70°C，黃酮得率為 17.8711^/^。以90 (%乙醇為溶劑，溫度控制在501：，黃酮得率為16.791^/^;研究發現丙酮 提取效果最好，但丙酮成本較高；70 %乙醇成本低，提取液黃酮含量較高，且蛋白質含量少 (即純度高），是較好的提取溶劑，值得推廣。國內外對其提取工藝作了大量研究，采用的溶 劑主要是乙醇-水和丙酮-水。由于采用丙酮-水作溶劑的成本及設備要求高，因而選擇 乙醇-水為溶劑進行回流提取。
[0005] (2)萜內酯：銀杏葉中萜內酯的含量很低，目前，其主要的提取方法有：乙醇提取、 回流提取、溶劑萃取、柱層析溶劑萃取、柱層析及超臨界流體提取，以及閃式提取。從天然 植物中提取的方法有乙醇提取法、柱層析法及超臨界流體提取法，以及閃式提取法等，其中 目前只有乙醇提取法適合于工業生產，其他幾種方法雖然提取率高，但是由于成本昂貴等 原因，目前只能用于實驗室研究。銀杏內酯易被極性及中等極性的溶劑溶解，如四氫呋喃 (THF)、丙酮和乙酸乙酯。資料顯示，大部分GA(銀杏內酯A)和GB (銀杏內酯B)可熱溶于乙 酸乙酯，極性較強的甲醇和乙醇這4種萜內酯都有出色的溶解性；丙酮的極性雖強于乙酸 乙酯，室溫下可快速溶解GA，但極性較大的BB (白果內酯），GC (銀杏內酯C)和GB則溶解較 慢。弱極性的乙醚和石油醚幾乎不能溶解萜內酯，故目前經常采用乙酸乙酯萃取。國外對萜 內酯的提取方法與國內有一定差別，一般采用有機溶劑多級萃取與硅藻土、硅膠吸附-洗 脫或活性炭吸附-洗脫與醋酸沉淀法相結合的提取方法。其實銀杏葉中萜內酯的含量本身 就較低，再通過硅膠或活性炭等吸附時萜內酯的含量會更低，所以這些方法有一定的局限 性，只是有時要消除一些雜質對萜內酯的干擾，因此要通過這些方法去除雜質。在內酯類的 測定中，有資料表明，采用示查折光檢測器要比紫外分光光度計更適合于內酯成分的測定。 如張鑒等（張鑒，潘見，謝惠明，等.反相高效液相色譜法測定銀杏葉提取物中5種銀杏內 酯的含量[J].分析化學，2000, 28(1) :53.)采用示差折光檢測器測定，因為銀杏中黃酮類 及其他成分的紫外吸收遠大于銀杏內酯，提取內酯成分時有少量黃酮，在提取液中，紫外檢 測會造成結果不準確，而示差折光檢測器對黃酮類成分影響低，適合內酯類成分的測定。
[0006] (3)銀杏酸：目前，國內外對銀杏酸分離除雜多采用化學提純手段，有報道采取有 機溶劑萃取法、二氧化碳超臨界萃取、柱層析分離、大孔吸附樹脂富集等方法。但過高的工 藝成本，使某些銀杏葉提取物原料的生產企業難以承受。這也是國內銀杏葉制劑質量不及 國外，難與國際市場競爭的緣由。銀杏酸為6-烷基或烯基水楊酸，其結構中雖有芳羥基和 羧基等極性基團，但因6位上的側鏈是碳數為13至17的長鏈（雙鍵數為0至3)，使銀杏酸 為脂溶性成分，顯弱極性，可溶于非極性的超臨界C0 2中。普通的實驗室中，一般用甲醇、石 油醚等有機溶劑提取銀杏酸，同時由于銀杏酸具有致敏性、胚胎毒性、細胞毒性及免疫毒性 等作用，其食用安全性也已引起人們的高度重視，歐洲EGb761質量標準規定在食品、制藥、 飲料、化妝品中銀杏酸含量必須小于lOug/g。而銀杏葉中銀杏酸含量高達1?2%。銀杏 酸的測定方法方面，近兩年有關其分析方法的報道較以前增加，但大多是高效液相色譜法， 未見有分光光度測定法的報道，但因分光光度儀價格低，經濟實用，易推廣使用。
[0007] 采用有機溶劑提取法提取銀杏葉中的活性成分是國內外最常用的方法。國內一般 采用60?70 %的乙醇水溶液，經多次回流萃取獲得初提物。液-液萃取在國外已經有了很 成熟的工藝，國內也有采用此分離方法的。但由于液-液萃取選擇性高、收率高、設備簡單， 但成本較高，有機溶劑殘留，污染環境。


【發明內容】

[0008] 本發明的目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種提取銀杏葉有效成分總 黃酮和萜內酯的方法。
[0009] 本發明的目的通過下述技術方案實現：
[0010] 一種提取銀杏葉有效成分總黃酮和萜內酯的方法，包括如下步驟：將銀杏葉粉末 溶于70%乙醇中，于70°C恒溫水浴中提取6h，離心取上清得到銀杏葉提取液；用大孔吸附 樹脂制備吸附柱，將銀杏葉提取液裝入柱吸附中，充分吸附6h后，讓其自然流下，收集洗脫 液，得到低濃度銀杏酸的銀杏葉提取液。
[0011] 所述的方法還包括通過紫外分光光度法對所得提取液中總黃酮、銀杏酸和萜內酯 的含量的進行測定；總黃酮、銀杏酸和萜內酯分別在250nm、310nm、210nm測吸光度測，標準 曲線方程分別為：y = 3· 1095X-0. 0022, y = 9· 08χ+0· 031，y = 1. 9316X+0. 0129。
[0012] 所述的銀杏葉粉末與70%乙醇的質量體積比優選為lg/50mL。
[0013] 所述的離心的條件優選為8000r/min離心7min。
[0014] 所述的大孔吸附樹脂制備吸附柱的方法優選為：選取D101大孔吸附樹脂，先用蒸 餾水洗去樹脂中的細小樹脂及破碎樹脂，然后用95% vol乙醇浸泡24h后洗滌，至洗滌液 加水稀釋不渾濁，水洗至無醇味，然后用5% HC1溶液浸泡5h后水洗至中性，再用2% NaOH 溶液浸泡5h后水洗至中性，用蒸餾水浸泡；取已處理好的樹脂，抽濾并晾干其表面水分，在 80°C干燥至恒重，裝柱。
[0015] 本發明相對于現有技術具有如下優點和效果：通過本發明方法得到的銀杏葉提 取液中總黃酮濃度為2. 391mg/mL、含量為24. 36% (提取的總黃酮的質量/銀杏葉的質 量），銀杏酸的濃度為0.303311^/1^、含量為7.44(%，萜內酯的濃度為2.4481^/1^、含量為 6. 01% ;經過洗脫后銀杏酸的濃度由0. 3033mg/mL降為0. 051mg/mL。本發明在保證總黃酮 和萜內酯高提取量的情況下，使銀杏酸的含量也大幅度降低。本發明方法成本較低，提取時 間較短，并且操作簡便，不污染環境，值得推廣。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1是蘆丁溶液的標準曲線圖。
[0017] 圖2是銀杏酸的標準曲線圖。
[0018] 圖3是萜內酯的標準曲線圖。

【具體實施方式】
[0019] 下面結合實施例對本發明做進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。
[0020] 實施例1總黃酮、銀杏酸、萜內酯標準曲線的制備
[0021] (1)總黃酮標準曲線的制備
[0022] 銀杏葉提取物中黃酮類化合物的含量測定采用紫外分光光度法。以蘆丁 (C120801，山西云鵬制藥有限公司）為標準品，精密分別稱量0· 2、0· 4、0· 6、0· 8、L 0g，于 251111^的稱量瓶中，用30(%乙醇定容至251]11^，分別得到811^/1]1]^、1611^/1]1]^、2411^/1]1]^、3211^/1]1]^、 40mg/mL濃度的蘆丁溶液，12min后，于波長250nm處進行比色測定，30%乙醇為空白參比。 采用二元線性回歸法得到以下吸光度（X)與蘆丁濃度（y)之間的回歸方程（OltiCtN?t 件處理）：y = 3. 1095x-0.0022(R2 = 1)，標準曲線見圖1。
[0023] (2)銀杏酸標準曲線的制備
[0024] 銀杏葉提取物中銀杏酸的含量測定采用紫外分光光度法。準確稱取銀杏酸（上海 寶曼生物科技有限公司）5mg，取5mL容量瓶，用無水甲醇溶解、定容至刻度，得銀杏酸對照 品。分別準確吸取以上溶液〇. 25、0. 5、1. 0、1. 5、2. 0、2. 5mL置于5mL容量瓶中，用甲醇定容 至刻度，搖勻。在310nm處測吸光度。以銀杏酸濃度C為橫坐標，吸光度A為縱坐標作圖， 得回歸標準曲線方程，方程為：y = 9. 08x+0. 031 (R2 = 1)，標準曲線見圖2。
[0025] (3)萜內酯標準曲線的制備
[0026] 銀杏葉提取物中萜內酯的含量測定采用紫外分光光度法。銀杏內酯B對照品溶液 的制備：精密稱取銀杏內酯B(中國藥品生物制品檢定所，批號110842-200403)對照品適 量，加甲醇溶解制成每lmL含銀杏內酯BO. 926mg的溶液，即得對照品溶液。分別準確吸取 以上溶液0. l、〇. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6mL置于5mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。在 210nm處測吸光度。以萜內酯的濃度C為橫坐標，吸光度A為縱坐標作圖，得回歸標準曲線 方程，方程為：y = 1.9316x+0. 0129(R2 = 1)，標準曲線見圖3。
[0027] 實施例2銀杏提取物的提取及總黃酮、銀杏酸、萜內酯含量的測定
[0028] 乙醇的提取效率較高，并且沒有毒性，因此本試驗采用50%和70%的乙醇水溶液 提取所測樣品中的總黃酮、萜內酯及銀杏酸。
[0029] (1)用電子天平取6份銀杏葉（臨沂銀杏葉）粉末，每份5克，取6個500mL圓底 燒瓶，編號分別為1、2、3、4、5、6。于6個圓底燒瓶中分別加入稱好的銀杏葉粉末5g，于1、2、 3號中分別加入70%的乙醇溶液250mL，4、5、6號中分別加入50%的乙醇250mL。
[0030] (2)將6個圓底燒瓶分別放入70°C的恒溫水浴中，1、4號提取2h，2、5號提取4h， 3、6號提取6h。
[0031] (3)提取后趁熱分別將6個圓底燒瓶中的提取液于高速臺式離心機中以8000r/ min離心7min，并記下離心后三份提取液（即上清液）的體積。
[0032] (4)分別取一定體積的6份提取液于250nm、310nm、210nm處測定此時提取液中總 黃酮、銀杏酸、萜內酯的吸光度，根據實施例1的標準曲線計算總黃酮、銀杏酸、萜內酯的濃 度。
[0033] (5)選取D101大孔吸附樹脂，先用蒸餾水洗去樹脂中的細小樹脂及破碎樹脂，然 后用95% vol乙醇浸泡24h后洗漆，至洗漆液加水稀釋不渾濁，水洗至無醇味,然后用5% HC1溶液浸泡5h后水洗至中性，再用2 % NaOH溶液浸泡5h后水洗至中性，用蒸餾水浸泡備 用。
[0034] (6)取一定量已處理好的樹脂，抽濾并晾干其表面水分，在80°C干燥至恒重，裝 柱。將剩余的提取液裝入柱中，充分吸附6h后，讓其自然流下，收集洗脫液，在310nm處測 定洗脫液中銀杏酸的吸光度。
[0035] (7)根據公式分別計算總黃酮、萜內酯及銀杏酸的含量：
[0036] 總黃酮/萜內酯/銀杏酸含量=提取液中總黃酮/銀杏酸/萜內酯總含量（mg)/ 鮮銀杏葉重量（mg) X 100%得出三種物質的含量。
[0037] 試驗影響因素如表1 :
[0038] 表1試驗影響因素
[0039]

【權利要求】
1. 一種提取銀杏葉有效成分總黃酮和萜內酯的方法，其特征在于包括如下步驟：將銀 杏葉粉末溶于70%乙醇中，于70°C恒溫水浴中提取6h，離心取上清得到銀杏葉提取液；用 大孔吸附樹脂制備吸附柱，將銀杏葉提取液裝入柱吸附中，充分吸附6h后，讓其自然流下， 收集洗脫液，得到低濃度銀杏酸的銀杏葉提取液。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：還包括通過紫外分光光度法對所得提取 液中總黃酮、銀杏酸和萜內酯的含量的進行測定；總黃酮、銀杏酸和萜內酯分別在250nm、 310nm、210nm 測吸光度測，標準曲線方程分別為：y = 3. 1095x-0. 0022, y = 9. 08x+0. 031， y = 1. 9316x+0. 0129。
3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述的銀杏葉粉末與70 %乙醇的質量體 積比為lg/50mL。
4. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述的離心的條件為8000r/min離心 7min。
5. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述的吸附柱的制備方法為：選取D101 大孔吸附樹脂，先用蒸餾水洗去樹脂中的細小樹脂及破碎樹脂，然后用95% vol乙醇浸泡 24h后洗漆，至洗漆液加水稀釋不渾濁，水洗至無醇味,然后用5% HC1溶液浸泡5h后水洗 至中性，再用2% NaOH溶液浸泡5h后水洗至中性，用蒸餾水浸泡；取已處理好的樹脂，抽濾 并晾干其表面水分，在80°C干燥至恒重，裝柱。
【文檔編號】A61K36/16GK104116764SQ201410293642
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年6月27日 優先權日:2014年6月27日
【發明者】黃霄, 單玉軍 申請人:黃霄, 單玉軍