一種功能化納米羥基磷灰石的基因導入材料及其制備方法和應用的制作方法

一種功能化納米羥基磷灰石的基因導入材料及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及基因導入材料【技術領域】，具體涉及一種功能化納米羥基磷灰石的基因導入材料及其制備方法和應用。一種功能化納米羥基磷灰石的基因導入材料的制備方法，包括：步驟一，針狀羥基磷灰石的制備；步驟二，吸附順鉑，得到納米羥基磷灰石的基因導入材料。本發明制得的納米羥基磷灰石的基因導入材料為一種平均直徑為100nm左右的納米針狀材料，該納米羥基磷灰石的基因導入材料與綠色熒光蛋白質粒基因pGFP結合，用于轉染，具有轉染效率高、細胞相容性好、細胞生存率高的優點；在人乳腺癌細胞中，該針狀納米羥基磷灰石的基因導入材料和pEGFP-C1的聯合體的轉染效率達到40%左右。
【專利說明】
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因導入材料【技術領域】，具體涉及一種功能化納米羥基磷灰石的基因 導入材料及其制備方法和應用。 一種功能化納米羥基磷灰石的基因導入材料及其制備方法 和應用

【背景技術】
[0002] 基因導入方法可以分為兩類：第一類是病毒型基因導入方法，是以逆轉錄病毒、腺 病毒、腺相關病毒為載體；第二類是非病毒型基因導入方法，如顯微注射、基因槍、磷酸鈣共 沉淀、陽離子脂質體法、以及利用新興的納米基因導入材料進行基因轉染。
[0003] 病毒型基因導入方法存在許多嚴重的不足，例如病毒轉染時有可能激活原癌基 因。因此，非病毒型基因導入方法是目前的研究熱點，但是，上述所述的非病毒型基因導入 方法均存在不足：顯微注射一次只能處理一個細胞，其轉染效率非常低；基因槍的穿透力 十分有限；磷酸鈣共沉淀法的轉染效率受溫度、濃度、操作環境等眾多因素影響，轉染結果 很不穩定；陽離子脂質體法雖然表現出良好的轉染效率，但是陽離子脂質體因毒性高，使得 陽離子脂質體法的應用受到了限制；現有技術中的納米基因導入材料存在生產成本高、制 備用原料不易得、難以普及推廣應用的缺點。


【發明內容】

[0004] 本發明的目的之一在于針對現有技術的不足，提供一種功能化納米羥基磷灰石的 基因導入材料的制備方法。
[0005] 本發明的目的之二在于針對現有技術的不足，提供一種利用功能化納米羥基磷灰 石的基因導入材料的制備方法制得的功能化納米羥基磷灰石的基因導入材料。
[0006] 本發明的目的之三在于針對現有技術的不足，提供一種功能化納米羥基磷灰石的 基因導入材料用于制作抗腫瘤藥物的應用。
[0007] 為了實現上述目的之一，本發明采用如下技術方案： 一種功能化納米羥基磷灰石的基因導入材料的制備方法，它包括以下步驟： 步驟一，針狀羥基磷灰石的制備：將氫氧化鈣的水溶液緩慢加入到稀磷酸的水溶液中， 并在一定溫度下攪拌一定時間，然后靜置一定時間后進行過濾，得到顆粒物，然后將顆粒物 進行水洗并真空干燥后，得到針狀羥基磷灰石； 步驟二，吸附順鉬：將順式二氨基二氯絡鉬溶解于超純水中，然后超聲振蕩一定時間 后，加入步驟一制得的針狀羥基磷灰石，并在一定溫度下攪拌一定時間后，進行離心并水 洗，得到納米羥基磷灰石的基因導入材料。
[0008] 上述技術方案中，步驟一中，所述氫氧化鈣的水溶液中的氫氧化鈣和所述稀磷酸 的水溶液中的磷酸的摩爾比為4~6 :2~4。
[0009] 上述技術方案中，步驟一中，所述氫氧化鈣的水溶液中，所述氫氧化鈣的摩爾濃度 為 0· lmol/L?0· 3 mol/L。
[0010] 上述技術方案中，步驟一中，所述稀磷酸的水溶液中，所述稀磷酸的摩爾濃度為 0· lmol/L?0· 3 mol/L。
[0011] 上述技術方案中，步驟一中，所述攪拌溫度為33°C~40°C，所述攪拌時間為22小時 ?26小時；所述靜置時間為1. 5小時~2. 5小時。
[0012] 上述技術方案中，步驟二中，所述針狀羥基磷灰石與所述順式二氨基二氯絡鉬的 質量比為4(Γ60 :1?5。
[0013] 上述技術方案中，步驟二中，所述順式二氨基二氯絡鉬溶解于超純水的質量-體 積濃度為 〇· 2mg/mL?0· 6 mg/mL。
[0014] 上述技術方案中，步驟二中，所述超聲振蕩的時間為20分鐘~40分鐘；所述攪拌溫 度為33°C?40°C，所述攪拌時間為45小時?50小時。
[0015] 為了實現上述目的之二，本發明采用如下技術方案： 利用上述所述的一種功能化納米羥基磷灰石的基因導入材料的制備方法制得的功能 化納米羥基磷灰石的基因導入材料，所述納米羥基磷灰石的基因導入材料為一種平均直徑 為80nnTl00nm的納米針狀材料。
[0016] 為了實現上述目的之三，本發明采用如下技術方案： 上述所述的一種功能化納米羥基磷灰石的基因導入材料的制備方法所制得的功能化 納米羥基磷灰石的基因導入材料用于制作抗腫瘤藥物的應用。
[0017] 本發明與現有技術相比較，有益效果在于： 本發明提供的一種功能化納米羥基磷灰石的基因導入材料的制備方法所制得的納米 羥基磷灰石的基因導入材料為一種平均直徑為80nnTl00nm左右的納米針狀材料，且該納 米針狀材料的粒徑能夠通過反應時間的控制進而控制納米顆粒的粒徑，從而擴大了粒徑的 選擇范圍。該納米羥基磷灰石的基因導入材料能和綠色熒光蛋白質粒基因 PGFP以非共價 方式結合，形成無機納米基因導入系統，用于基因轉染。該納米羥基磷灰石的基因導入材料 與綠色熒光蛋白質粒基因 pGFP結合后再與DNA中的氫氧化鈣和磷酸離子的正電性根發生 作用，能夠達到穩定的轉染效率，并且能夠降低高濃度鈣離子可能導致的活性，從而使得本 發明所制得的納米羥基磷灰石的基因導入材料能夠在人體內得到進一步應用。與現有技術 相比，本發明所述制得的納米羥基磷灰石的基因導入材料具有以下優點： (1) 具有較高的轉染效率，在人乳腺癌細胞中可以達到40%左右； (2) 低毒性，因針狀的納米羥基磷灰石的基因導入材料具有良好的生物相容性，細胞生 存率很高； (3) 該納米羥基磷灰石的基因導入材料的分散性良好，符合對轉染的要求； (4) 制備成本極低，因該納米羥基磷灰石的基因導入材料提取的主要活性成分--多 酚類化合物的價格低廉；且反應用試劑都是常見易得的化學藥品，如氫氧化鈣和磷酸都是 廉價試劑； (5) 材料制備反應簡單，容易操作，可重復性好； (6) 應用前景良好，可以應用于制備抗腫瘤藥物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1是本發明的一種功能化納米羥基磷灰石的基因導入材料的制備方法的實施 例1所制得的納米羥基磷灰石的基因導入材料的掃描電鏡圖。
[0019] 圖2是本發明在轉染實驗中的納米羥基磷灰石的基因導入材料和pEGFP-Cl的聯 合體在轉染后的倒置熒光顯微鏡下的熒光圖。
[0020] 圖3是本發明在轉染實驗中的納米羥基磷灰石的基因導入材料和pEGFP-Cl的聯 合體在轉染后的細胞存活率圖。
[0021] 圖4是本發明在轉染實驗中的納米羥基磷灰石的基因導入材料和pEGFP-Cl的聯 合體的轉染效率圖。
[0022] 其中，在圖3至圖4中，cell viability (%)代表細胞存活率，transfection efficiency(%)代表轉染效率。

【具體實施方式】
[0023] 下面結合實施例對本發明作進一步的說明。
[0024] 實施例1。
[0025] 一種功能化納米羥基磷灰石的基因導入材料的制備方法，它包括以下步驟： 步驟一，針狀羥基磷灰石的制備：將氫氧化鈣的水溶液緩慢加入到稀磷酸的水溶液中， 并在37°C的溫度下攪拌24小時，然后靜置2小時后進行過濾，得到顆粒物，然后將顆粒物進 行水洗并真空干燥后，得到針狀羥基磷灰石。
[0026] 其中，步驟一中，氫氧化鈣的水溶液中的氫氧化鈣和稀磷酸的水溶液中的磷酸的 摩爾比為5 :3。其中，氫氧化鈣的水溶液中，氫氧化鈣的摩爾濃度為0. 17mol/L。稀磷酸的 水溶液中，稀磷酸的摩爾濃度為〇. 15mol/L。
[0027] 步驟二，吸附順鉬：將順式二氨基二氯絡鉬溶解于超純水中，然后超聲振蕩30分 鐘后，加入步驟一制得的針狀羥基磷灰石，并在37°C的溫度下攪拌48小時后，進行離心并 水洗，得到納米羥基磷灰石的基因導入材料。
[0028] 其中，步驟二中的針狀羥基磷灰石與順式二氨基二氯絡鉬的質量比為50 :3。其 中，順式二氨基二氯絡鉬溶解于超純水的質量-體積濃度為〇. 4mg/mL。
[0029] 利用本實施例1 一種功能化納米羥基磷灰石的基因導入材料的制備方法制得的 功能化納米羥基磷灰石的基因導入材料，該納米羥基磷灰石的基因導入材料為一種平均直 徑為100nm的納米針狀材料。
[0030] 本實施例1的一種功能化納米羥基磷灰石的基因導入材料的制備方法所制得的 功能化納米羥基磷灰石的基因導入材料用于制作抗腫瘤藥物的應用，具有低毒性、良好的 分散性、以及具有較高的轉染效率，在人乳腺癌細胞中可以達到40%左右。
[0031] 實施例2。
[0032] 一種功能化納米羥基磷灰石的基因導入材料的制備方法，它包括以下步驟： 步驟一，針狀羥基磷灰石的制備：將氫氧化鈣的水溶液緩慢加入到稀磷酸的水溶液中， 并在33°C的溫度下攪拌26小時，然后靜置1. 5小時后進行過濾，得到顆粒物，然后將顆粒物 進行水洗并真空干燥后，得到針狀羥基磷灰石。
[0033] 其中，步驟一中，氫氧化鈣的水溶液中的氫氧化鈣和稀磷酸的水溶液中的磷酸的 摩爾比為4 :2。其中，氫氧化鈣的水溶液中，氫氧化鈣的摩爾濃度為0. lmol/L。稀磷酸的水 溶液中，稀磷酸的摩爾濃度為〇. lmol/L。
[0034] 步驟二，吸附順鉬：將順式二氨基二氯絡鉬溶解于超純水中，然后超聲振蕩20分 鐘后，加入步驟一制得的針狀羥基磷灰石，并在33°C的溫度下攪拌50小時后，進行離心并 水洗，得到納米羥基磷灰石的基因導入材料。
[0035] 其中，步驟二中的針狀羥基磷灰石與順式二氨基二氯絡鉬的質量比為40 :1。其 中，順式二氨基二氯絡鉬溶解于超純水的質量-體積濃度為〇. 2mg/mL。
[0036] 利用本實施例2 -種功能化納米羥基磷灰石的基因導入材料的制備方法制得的 功能化納米羥基磷灰石的基因導入材料，該納米羥基磷灰石的基因導入材料為一種平均直 徑為80nm的納米針狀材料。
[0037] 本實施例2的一種功能化納米羥基磷灰石的基因導入材料的制備方法所制得的 功能化納米羥基磷灰石的基因導入材料用于制作抗腫瘤藥物的應用，具有低毒性、良好的 分散性、以及具有較高的轉染效率，在人乳腺癌細胞中可以達到40%左右。
[0038] 實施例3。
[0039] 一種功能化納米羥基磷灰石的基因導入材料的制備方法，它包括以下步驟： 步驟一，針狀羥基磷灰石的制備：將氫氧化鈣的水溶液緩慢加入到稀磷酸的水溶液中， 并在40°C的溫度下攪拌22小時，然后靜置2. 5小時后進行過濾，得到顆粒物，然后將顆粒物 進行水洗并真空干燥后，得到針狀羥基磷灰石。
[0040] 其中，步驟一中，氫氧化鈣的水溶液中的氫氧化鈣和稀磷酸的水溶液中的磷酸的 摩爾比為6 :4。其中，氫氧化鈣的水溶液中，氫氧化鈣的摩爾濃度為0.3mol/L。稀磷酸的水 溶液中，稀磷酸的摩爾濃度為〇. 3mol/L。
[0041] 步驟二，吸附順鉬：將順式二氨基二氯絡鉬溶解于超純水中，然后超聲振蕩40分 鐘后，加入步驟一制得的針狀羥基磷灰石，并在40°C的溫度下攪拌45小時后，進行離心并 水洗，得到納米羥基磷灰石的基因導入材料。
[0042] 其中，步驟二中的針狀羥基磷灰石與順式二氨基二氯絡鉬的質量比為60 :5。其 中，順式二氨基二氯絡鉬溶解于超純水的質量-體積濃度為〇. 6mg/mL。
[0043] 利用本實施例3 -種功能化納米羥基磷灰石的基因導入材料的制備方法制得的 功能化納米羥基磷灰石的基因導入材料，該納米羥基磷灰石的基因導入材料為一種平均直 徑為90nm的納米針狀材料。
[0044] 本實施例3的一種功能化納米羥基磷灰石的基因導入材料的制備方法所制得的 功能化納米羥基磷灰石的基因導入材料用于制作抗腫瘤藥物的應用，具有低毒性、良好的 分散性、以及具有較高的轉染效率，在人乳腺癌細胞中可以達到40%左右。
[0045] 將上述實施例1制得的納米羥基磷灰石的基因導入材料用于以下實驗。
[0046] 結合性能的測定 1、主要材料 實施例1制得的納米羥基磷灰石的基因導入材料(見圖1);綠色熒光蛋白質粒 (pEGFP-Cl) ;HEPES平衡鹽溶液（自配）；電泳緩沖液（0. 5XTBE，自配）；DNA上樣緩沖液；溴 化乙啶（EB)。
[0047] 2、主要方法 1 μ L針狀納米羥基磷灰石的基因導入材料的溶液（5mg針狀納米羥基磷灰石的基因 導入材料溶解在500 μ L雙蒸水中）與1 μ LpEGFP-Cl水溶液（0. 1 mg /mL)以及8 ml雙蒸 水（pH=7. 4)在1. 5mL離心管中混合，置于室溫下30分鐘讓其充分結合。針狀納米羥基磷 灰石的基因導入材料和pEGFP-Cl的質量比分別為100:l，50:l，30:l，10 :l，5:l，l:l。在 5000rpm的速度下離心5min，得到沉淀物。將沉淀物加載到1%的瓊脂糖（ΕΒ0. 1 mg/mL)中， 并在TAE的緩沖下，在100V電壓下跑40min，然后在320nm處觀察條帶。
[0048] 3、結果 結果觀察，有多種條帶出現，這是因為PEGFP-C1有多種構型所致。在質量比30:1， 10:1，5:1，1:1處條帶清晰明顯，說明在這些質量比之下，DNA和納米羥基磷灰石的基因導 入材料顆粒結合不是很好，到了 1〇〇: 1，50:1條帶消失，說明DNA和納米羥基磷灰石的基因 導入材料顆粒結合完全了。
[0049] 上述結果表明：帶正電荷的pEGFP-Cl和納米羥基磷灰石的基因導入材料存在一 個最佳的結合比，當納米羥基磷灰石的基因導入材料和PEGFP-C1的質量比大于50:1，繼 續添加納米羥基磷灰石的基因導入材料，綠色熒光蛋白質粒也不會再與多余的納米羥基磷 灰石的基因導入材料結合，因此，本實驗結果得出，以納米羥基磷灰石的基因導入材料和 pEGFP-Cl的質量比為50:1的結合比進行轉染。
[0050] 轉染實驗 1、主要材料 人乳腺癌細胞；針狀納米羥基磷灰石的基因導入材料和pEGFP-Cl聯合體(上述制備）； DMEM培養基；胎牛血清FBS ;6孔培養板。
[0051] 2、主要方法 (1)細胞的培養：將人乳腺癌細胞用胰蛋白酶-EDTA消化下來，計數后加入到6孔板中 (5 X 106/孔)，用含FBS10%的DMEM溶液并加轉染優化試劑培養至細胞密度為60%?70%的 融合度。
[0052] (2)細胞轉染實驗：將培養好的細胞上清除去，并換上新的培養液，然后分成三份， 分別為第一樣品、第二樣品和第三樣品，第一樣品中不添加任何其它物質，往第二樣品中加 入質量比為50:1的針狀納米羥基磷灰石的基因導入材料和pEGFP-Cl的聯合體，往第三樣 品中加入脂質體2000和pEGFP-Cl的聯合體，然后對第一樣品、第二樣品和第三樣品分別 培養48小時，然后對第二樣品進行熒光測定(見圖2)，并對第一樣品、第二樣品和第三樣品 分別進行細胞存活率測定(見圖3)、轉染效率測定(見圖4)。其中，細胞存活率測定時，是用 碘化吡啶進行標識，并使用流式細胞儀進行檢測。轉染效率測定是使用流式細胞儀進行檢 測。
[0053] 3、結果分析 從圖2中的熒光圖可以看出有明顯的綠色熒光，并且綠色熒光的覆蓋面較大，說明針 狀納米羥基磷灰石的基因導入材料和pEGFP-Cl的聯合體在人乳腺癌細胞中轉染成功。
[0054] 圖3的細胞存活率圖片中，由左到右分別代表第一樣品（control)、第二樣品 (nano)和第三樣品（lipofectamine 2000)的存活率，其中，第一樣品的存活率為98%，第二 樣品的存活率約為87%，第三樣品的存活率為75%。因此，從圖3中可以看到，質量比為50:1 的針狀納米羥基磷灰石的基因導入材料和pEGFP-Cl的聯合體對人乳腺癌細胞的存活率的 影響是很小的，相比之下，脂質體2000和pEGFP-Cl的聯合體對人乳腺癌細胞的存活率的 影響較大。
[0055] 圖4的轉染效率圖片中，由左到右分別代表第一樣品（control)、第二樣品（nano) 和第三樣品（lipofectamine 2000)的轉染效率。由圖4中可以看到，針狀納米輕基磷灰石 的基因導入材料和PEGFP-C1的聯合體可以達到約40%的轉染效率，這是在保證了人乳腺癌 細胞存活率約為87%的前提下達到的轉染效率。雖然針狀納米羥基磷灰石的基因導入材料 和pEGFP-Cl的聯合體的轉染效率不及脂質體2000的轉染效率高，但是，針狀納米羥基磷灰 石的基因導入材料和PEGFP-C1的聯合體的高細胞相容性是脂質體2000所無法比擬的。
[0056] 終上所述，由上述實驗結果和分析可知，針狀納米羥基磷灰石的基因導入材料作 為轉染試劑具有巨大的潛力。
[〇〇57] 最后應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對本發明保 護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細地說明，本領域的普通技術人員應 當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實 質和范圍。
【權利要求】
1. 一種功能化納米羥基磷灰石的基因導入材料的制備方法，其特征在于：它包括以下 步驟： 步驟一，針狀羥基磷灰石的制備：將氫氧化鈣的水溶液緩慢加入到稀磷酸的水溶液中， 并在一定溫度下攪拌一定時間，然后靜置一定時間后進行過濾，得到顆粒物，然后將顆粒物 進行水洗并真空干燥后，得到針狀羥基磷灰石； 步驟二，吸附順鉬：將順式二氨基二氯絡鉬溶解于超純水中，然后超聲振蕩一定時間 后，加入步驟一制得的針狀羥基磷灰石，并在一定溫度下攪拌一定時間后，進行離心并水 洗，得到納米羥基磷灰石的基因導入材料。
2. 根據權利要求1所述的一種功能化納米羥基磷灰石的基因導入材料的制備方法，其 特征在于：步驟一中，所述氫氧化鈣的水溶液中的氫氧化鈣和所述稀磷酸的水溶液中的磷 酸的摩爾比為4飛：2?4。
3. 根據權利要求1所述的一種功能化納米羥基磷灰石的基因導入材料的制備方法，其 特征在于：步驟一中，所述氫氧化鈣的水溶液中，所述氫氧化鈣的摩爾濃度為0. Imol/L~0. 3 mol/L〇
4. 根據權利要求1所述的一種功能化納米羥基磷灰石的基因導入材料的制備方法， 其特征在于：步驟一中，所述稀磷酸的水溶液中，所述稀磷酸的摩爾濃度為0. Imol/L~0. 3 mol/L〇
5. 根據權利要求1所述的一種功能化納米羥基磷灰石的基因導入材料的制備方法，其 特征在于：步驟一中，所述攪拌溫度為33°C ~40°C，所述攪拌時間為22小時~26小時；所述 靜置時間為1. 5小時~2. 5小時。
6. 根據權利要求1所述的一種功能化納米羥基磷灰石的基因導入材料的制備方法，其 特征在于：步驟二中，所述針狀羥基磷灰石與所述順式二氨基二氯絡鉬的質量比為4(Γ60 : 1?5。
7. 根據權利要求1所述的一種功能化納米羥基磷灰石的基因導入材料的制備方法，其 特征在于：步驟二中，所述順式二氨基二氯絡鉬溶解于超純水的質量-體積濃度為0. 2mg/ πιΤΛΟ. 6 mg/mL〇
8. 根據權利要求1所述的一種功能化納米羥基磷灰石的基因導入材料的制備方 法，其特征在于：步驟二中，所述超聲振蕩的時間為20分鐘~40分鐘；所述攪拌溫度為 33°C?40°C，所述攪拌時間為45小時?50小時。
9. 利用權利要求1一8任意一項所述的一種功能化納米羥基磷灰石的基因導入材料的 制備方法制得的功能化納米羥基磷灰石的基因導入材料，其特征在于：所述納米羥基磷灰 石的基因導入材料為一種平均直徑為SOnnTlOOnm的納米針狀材料。
10. 權利要求1至8任意一項所述的一種功能化納米羥基磷灰石的基因導入材料的制 備方法所制得的功能化納米羥基磷灰石的基因導入材料用于制作抗腫瘤藥物的應用。
【文檔編號】A61P35/00GK104109684SQ201410274374
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2014年6月19日 優先權日:2014年6月19日
【發明者】王深明, 林穎, 張德元, 常光其, 周鴻雁, 李梓倫, 邵楠 申請人:中山大學附屬第一醫院