一種治療ii型糖尿病或代謝綜合征的復方藥物組合物的制作方法
【專利摘要】本發明涉及醫藥領域，具體涉及一種治療II型糖尿病或代謝綜合征的復方藥物組合物，更具體地，公開了一種5-羥色胺2受體拮抗劑沙格雷酯和5-羥色胺合成抑制劑組合的復方藥物組合物，本發明的復方藥物組合物可用于改善胰島素抵抗從而治療II型糖尿病和代謝綜合征。
【專利說明】一種治療11型糖尿病或代謝綜合征的復方藥物組合物
【技術領域】
[0001]本發明涉及醫藥領域，具體涉及5-羥色胺2受體拮抗劑沙格雷酯和5-羥色胺合成抑制劑組合的復方藥物組合物，本發明的復方藥物組合物可用于改善胰島素抵抗從而治療II型糖尿病和代謝綜合征。
【背景技術】
[0002]胰島素抵抗(Insulin resistance, IR)是指“各種原因使胰島素促進細胞攝取和利用葡萄糖的效率下降，機體代償性的分泌過多胰島素產生高胰島素血癥，以維持血糖的穩定”這種現象。一個具有正常代謝的人，胰島素是在進食后由胰腺內的胰島β細胞分泌的，它傳遞信號給體內的胰島素感應組織，使細胞膜表面產生葡萄糖轉運體(Glucosetransporter, GLUT)吸收葡萄糖從而降低血糖濃度。IR的主要發生組織為肝臟、脂肪組織和骨骼肌。細胞發生IR時，正常水平的胰島素無法誘導這些細胞產生足夠的GLUT，從而完成正常的葡萄糖吸收功能。為了對此進行補償，胰島需釋放更多的胰島素，以使足夠的細胞GLUT被激發來吸收葡萄糖。因此IR的主要原因是“細胞對胰島素的敏感性降低，胰島素誘導細胞內GLUT轉運到細胞膜上從而增加葡萄糖吸收的能力下降”。其病變的本質是細胞內的，某種原因使細胞GLUT表達能力下降，GLUT基因或蛋白表達下降，從而降低了細胞在胰島素刺激下吸收利用葡萄糖的能力，從而出現IR。
[0003]多種原因可導致IR，如肥胖、長期高血糖、高游離脂肪酸血癥、高糖皮質素血癥、妊娠和體內胰島素拮抗激素增多等。但公認的，肥胖是導致IR最主要的原因，尤其是向中性肥胖；而高糖皮質素血癥、高游離脂肪酸血癥可能是肥胖導致IR的直接原因。與IR直接相關的疾病主要有兩種:2型糖尿病(Diabetes mellitus type2, DM-1I)和代謝綜合征metabolic syndrome, MS) ? DM-1I占糖尿病患者90%以上,病人的主要表現就是肥胖和IR,機體胰島素相對缺乏，只有病情惡化、后期的DM-1I病人才因為胰島被破壞出現胰島素的絕對缺乏。MS為多種代謝成分異常聚集的病理狀態，是一組復雜的代謝紊亂癥候群，是導致糖尿病、心腦血管疾病(動脈粥樣硬化、中風、冠心病)的危險因素，目前認為其集簇發生的核心是IR。臨床上，診斷MS的主要標準有:腹型肥胖(即向中性肥胖)、IR、高脂血癥(高甘油三酯血癥、高低密度脂蛋白及低高密度脂蛋白血癥)。因此，改善機體對胰島素的敏感性，降低IR成為治療DM-11、MS的首選。雙胍類(如二甲雙胍)和噻唑烷二酮類(如羅格列酮和吡格列酮)是臨床常用的增加胰島素敏感性、改善IR的藥物。
[0004]IR檢測的最常用方法:
[0005]1.HOMA-1R指數HOMA-1R指數全稱為“穩態模型胰島素抵抗指數”，這是衡量機體IR最常用的方法，方法簡單、結論可靠。測量空腹血糖和空腹胰島素濃度，計算HOMA-1R指數(H0MA-1R =空腹血糖X空腹胰島素+22.5)，實驗時通過與正常對照組比較來確定IR ；
[0006] I1.尿糖量測定如果血糖濃度足夠高(超過腎糖閾)，可在尿液中檢測到葡萄糖(這是糖尿病名稱的來由)。單位時間內人或動物排出的尿液中葡萄糖含量的多少，可反映IR及糖尿病的嚴重程度，尿糖量越高表明IR及糖尿病越嚴重。[0007]IR實際上是細胞代謝紊亂的一種表現。IR時，機體細胞的糖代謝、脂代謝都出現紊亂，尤其在脂肪細胞、肝細胞和骨骼肌細胞，這種能量代謝的紊亂特別明顯，導致脂肪細胞分泌一些激素樣因子紊亂(如瘦素、抵抗素分泌增加，脂聯素分泌減少)，肝細胞脂質沉積、炎癥因子產生增加等，骨骼肌細胞對葡萄糖的利用效率降低等。但導致IR的本質原因目前是不清楚的，雖然發現糖皮質素、游離脂肪酸、一些炎癥因子(如腫瘤壞死因子α)可直接導致細胞產生IR、抑制GLUT的細胞內表達，但它們是通過什么途徑、怎樣改變細胞內的代謝通路及信號通路從而導致IR的？是否存在一種共同的作用特點？目前并未弄清。我們的研究發現，糖皮質素、游離脂肪酸導致IR時存在共同的作用特點:引起肝細胞、脂肪細胞及骨骼肌細胞5-羥色胺合成或受體表達發生改變；通過逆轉細胞的5-HT系統改變能夠阻斷這些因素導致的IR。
[0008]5-輕色胺(5-hydroxy tryptamine, 5-HT)也叫血清素,是一種存在于外周和中樞的小分子物質，5-HT的生理功能復雜，至今未完全弄清。
[0009]1.5-HT的合成分兩步，第一步:色氨酸在色氨酸輕化酶(tryptophanhydroxylase, TPH)的催化下轉變為5-羥色氨酸(TPH可分為兩個亞型:TPH1和TPH2，TPH1存在于外周，TPH2存在于中樞)；第二步:5_羥色氨酸在芳香族氨基酸脫羧酶(aromaticaminoacid decarboxylase, AADC)的催化下轉變為5-HT。因此,可分別通過抑制TPH或AADC實現對5-HT合成的抑制。
[0010]對氯苯丙氨酸(parachlorophenylalanine或 p-chlorophenylalanine, pCPA),別名:DL-4-氯苯丙氨酸、DL-對氯苯丙氨酸等，分子式=C9HltlClNO2，是TPH抑制劑，無臨床應用報導。
[0011]卡比多巴(Cabidoba,Q)P),分子式=CltlH14N2O4。
[0012]節絲肼(Benserazide, BSA),別名:三羥基絲氨酰肼、色拉肼、絲氯酰肼、輕節絲肼，分子式:C10H15N3O5ο
[0013]⑶P和BSA都是AADC抑制劑，臨床用于帕金森氏病的輔助治療，它們的共同作用特點是外周脫羧酶抑制劑，不易進入中樞，僅抑制外周左旋多巴轉化為多巴胺，使循環中左旋多巴含量增加，也可抑制5-羥色氨酸轉化為5-HT，使合成5-HT的細胞產生5-HT減少。CDP和BSA也沒有用于改善IR，從而治療DM-1I或MS的研究報導。
[0014]I1.5-HT受體5-HT受體(5-HT receptor, 5-HTR)存在于細胞膜上，屬于膜受體，5-HT受體亞型復雜，現已發現有7大類受體存在，即S-HIV7Rj-HTu5R主要分布在中樞，5_HT2，3，6，7R主要分布在外周。這7類受體又被進一步分為若干個亞型。5-肌21?可被分為5-HT2AR、5-HT2BR和5-HT2eR。外周和中樞均有分布的是5_HT2A，2BR，5-HT2CR主要存在于中樞神經系統，肝臟、骨骼肌、內臟脂肪組織分布有5-HT2A，2BR。具有選擇性阻斷5-HT2R的藥物不多，已知沙格雷酯屬于選擇性5-HT2R拮抗劑。
[0015] 沙格雷酯(Sarpogrelate，SAR)是一種專一性5_HT2R 阻斷劑，分子:C24H31N06。臨床應用中，SAR可抑制由5-HT增強的血小板凝集及抑制血管收縮作用等，臨床用于改善慢性動脈閉塞癥所引起的潰瘍、疼痛以及冷感等缺血性諸癥狀。雖然臨床有SAR治療糖尿病性并發癥下肢動脈硬化閉塞癥的報導，但沒有可以改善IR的研究報導。
【發明內容】
[0016]本發明公開了一種5-羥色胺2受體拮抗劑沙格雷酯和5-羥色胺合成抑制劑組合的復方藥物組合物，該組合物具有協同改善胰島素抵抗從而可用于治療II型糖尿病和代謝綜合征。
[0017]所述的5-羥色胺合成抑制劑優選對氯苯丙氨酸、卡比多巴或芐絲肼。
[0018]沙格雷酯和5-羥色胺合成抑制劑的重量比優選15:1~1:15。
[0019]沙格雷酯和對氯苯丙氨酸的重量比更優選為12:1~1:2。
[0020]沙格雷酯和卡比多巴的重量比更優選為9:1~1:2。
[0021]沙格雷酯和芐絲肼的重量比更優選為8:1~1:3。
[0022]我們在研究中發現:
[0023]1.肝細胞及脂肪細胞均存在5-HT合成系統(TPH1，AADC)。糖皮質激素類藥物一地塞米松(dexamethasone, DEX)或脂肪酸(油酸,oleic acid, 0A)刺激在導致肝細胞產生IR時(GLUT受體表達被下調)，同時也存在5-HT合成系統被上調、細胞內5-HT含量增加^DEX導致大鼠發生IR的實驗中，同時觀察到肝臟及內臟脂肪TPHl、AADC表達被上調、5-HT含量升高，即兩種組織中5-HT合成增加；
[0024]I1.肝細胞、脂肪細胞及骨骼肌細胞均存在5_HT2A，2BR表達，體外培養肝細胞用DEX或OA刺激，或動物實驗用DEX刺激建立IR動物模型時，三種組織5-HT2A，2B受體表達均被明顯上調，并同步地出現IR癥狀。
[0025]II1.體外細胞培養實驗時，用DEX或OA刺激建立肝細胞IR模型，5_HT合成抑制
5-HT2R阻斷劑一SAR均可明顯抑制DEX或OA導致的GLUT基因表達被下調，而SAR與pCPA或CDP或BSA聯用，則使GLUT被進一步上調，顯示出協同效應。
[0026]IV.動物實驗研究時，用DEX刺激建立IR動物模型，用SAR+pCPA、SAR+⑶P、SAR+BSA按兩種藥物不同的重量配比組成不同的復方對模型進行治療。結果表明，DEX導致的IR(高血糖、高血胰島素濃度，HOMA-1R指數升高，明顯的尿糖含量)被明顯逆轉，表現為:血糖、血胰島素濃度降低，HOMA-1R指數減小，尿液中葡萄糖含量減少。并且，SAR+pCPA、SAR+⑶P、SAR+BSA三種復方按藥物一定的重量配比，對治療IR顯示出明顯的協同作用，聯合用藥能明顯提高藥物療效。其中，SAR+pCPA復方產生協同作用療效的藥物重量比為:12:1~1:2時效果更佳；SAR+⑶P復方產生協同作用療效的藥物重量比為:9:1~1:2時效果更佳；SAR+BSA復方產生協同作用療效的藥物重量比為:8:1~1:3時效果更佳。并且，所選SAR+pCPA復方，以重量配比為4:1的復方療效最好；所選SAR+⑶P復方，以重量配比為3:1的復方療效最好；所選SAR+BSA復方，以重量配比為2:1的復方療效最好。
[0027]綜上所述，用沙格雷酯與5-羥色胺合成抑制劑如對氯苯丙氨酸或卡比多巴或芐絲肼在一定的重量比范圍內組成復方，對改善胰島素抵抗有明顯的協同作用，可用于因胰島素抵抗引起的2型糖尿病或代謝綜合征的治療。
[0028]本發明的復方藥物組合物通過添加藥學上可接受的載體制備成適合臨床使用的劑型，如片劑、膠囊、液體制劑等。所述藥學上可接受的載體如崩解劑、稀釋劑、粘合劑、潤滑劑等。
[0029]下面通過實施例對本發明的復方藥物組合物做進一步的藥效學實驗結果的闡述。【專利附圖】
【附圖說明】[0030]圖1是DEX或OA對體外培養肝細胞TPH1、AADC、5-HT2AR、5_HT2BR基因表達的影響(A)及DEX或OA刺激對體外培養肝細胞5-HT含量的影響⑶(χ± SDs N = 3)
[0031]圖2是在DEX導致的體外培養肝細胞GLUT2基因表達下調模型，SAR、pCPA、⑶P、BSA治療可逆轉這種下調，而SAR與pCPA、⑶P、BSA聯合用藥則進一步加大這種逆轉效應
(A)，在OA導致的肝細胞GLUT2基因表達下調模型，這種效應也存在(B) ( J± SD, N = 3)
[0032]圖3是在DEX導致肝細胞5-HT含量升高時，用pCPA、⑶P、BSA治療可明顯抑制這種效應，而SAR沒有抑制作用，且SAR與pCPA、CDP、BSA聯合給藥也沒有協同作用(A)，在OA導致肝細胞5-HT含量升高時，也存在這種效應(B) ( X± SD, N= 3)
[0033]圖4是大鼠連續給DEX15天后肝臟、脂肪組織TPH1、AADC蛋白表達明顯上調(骨骼肌未見TPH1、AADC表達)(A)及大鼠連續給DEX15天后肝臟、脂肪組織5-HT含量明顯升
高，而用pCPA、CDP、BSA治療時則5-HT含量明顯降低⑶(歹± SD9 N = 6)
[0034]圖5是大鼠連續給DEX15天后肝臟、脂肪組織、骨骼肌5-HT2AR、5_HT2BR基因表達明顯上調
[0035]圖6是大鼠連續給DEX15天后肝臟GLUT2、脂肪組織及骨骼肌GLUT4基因表達明顯下調，用SAR、pCPA、CDP、BSA治療明顯上調GLUT2、GLUT4基因表達
【具體實施方式】
[0036]實施例1
[0037]肝細胞體外細胞培養研究
[0038] “肝細胞5-HT合成系統、5-HT2A，2B受體基因表達、GLUT基因表達，在DEX或OA刺激時的改變；及抑制5-HT合成或阻斷5-HT2A，2B受體(5-HT2A，2BR)時對DEX或OA導致的IR的改善作用”研究結果。
[0039]1.1實驗方法
[0040](I)細胞培養
[0041]大鼠BRL-3A肝細胞株體外培養，實驗在細胞傳代之10_20代時完成。細胞培養在37°C、含5% CO2的培養箱中，用含10%胎牛血清的PRM1-1640培養基培養，并用青霉素/蓮霉素聯合抗菌。細胞接種濃度5 X IO5個/瓶，培養24小時后待細胞增殖達到70-80%瓶底面積時可進行給藥。分別用地塞米松(DEX)或油酸(OA)刺激建立IR細胞模型。DEX刺激IR模型給藥分組:對照組一正常培養基培養，DEX刺激模型組一培養基中加入30 μ M/LDEX, pCPA組一培養基中加入30 μ M/L DEX及25 μ M/L pCPA, CDP組-培養基中加入30 μ M/L DEX 及 25 μ M/LCDP，BSA 組-培養基中加入 30 μ M/L DEX 及 25 μ M/L BSA, SAR 治療組一培養基中加入30 μ M/LDEX及25 μ M/L SAR, SAR與pCPA聯合給藥組一培養基中加入30 μ M/LDEX及25 μ M/LSAR+25 μ M/L pCPA, SAR與CDP聯合給藥組一培養基中加入30 μ M/L DEX及25 μ M/LSAR+25 μ M/L CDP，SAR 與 BSA 聯合給藥組一培養基中加入 30 μ M/L DEX 及 25 μ M/LSAR+25 μ M/L BSA ；0Α刺激IR模型給藥分組:對照組一正常培養基培養，OA刺激模型組一培養基中加入200 μ M/L 0A, pCPA組—培養基中加入200 μ M/L OA及25 μ M/L pCPA, CDP組-培養基中加入200 μ M/L OA及25 μ M/L CDP，BSA組-培養基中加入200 μ M/L OA及25 μ M/LBSA, SAR 治療組—培養基中加入 200 μ M/L OA 及 25 μ M/L SAR, SAR 與 pCPA 聯合給藥組一培養基中加入200 μ M/L OA及25 μ M/L SAR+25 μ M/L pCPA, SAR與CDP聯合給藥組一培養基中加入200 μ M/L OA及25 μ M/L SAR+25 μ M/L CDP，SAR與BSA聯合給藥組一培養基中加入200 μ M/L OA及25 μ M/L SAR+25 μ M/L BSA。所有實驗組培養48小時后用裂解液裂解細胞，所得溶液可進行進一步實驗，用于細胞內物質含量檢測及PCR試驗。
[0042](2)給藥劑量
[0043]地塞米松(DEX)—30 μ M/L
[0044]對氯苯丙氨酸(pCPA)—25 μ M/L
[0045]卡比多巴(CDP)—25 μ M/L
[0046]芐絲肼(BSA)—25 μ M/L
[0047]沙格雷酯(SAR)—25 μ M/L
[0048]油酸(OA)—200 μ M/L
[0049]1.2實驗指標檢測方法
[0050](I)細胞5-HT含量檢測
[0051]酶聯免疫法(ELISA)檢測5-HT含量。
[0052](2) TPH1、AADC、5-HT2A，2B 受體、GLUT2 基因表達檢測
[0053]肝細胞相關因子基因表達:逆轉錄PCR技術檢測TPHl、AADC、5-HT2A，2B受體(5-HT2AR，5-HT2BR)、GLUT2 基因(mRNA)表達。其中，肝細胞 GLUT 為 GLUT2。引物:
[0054]THPI 上游引物 5’ ACTGCGACATCAACCGAGAA3’
[0055]下游引物5’ GGCTAACCCTGACAGGAAAT3’
[0056]AADC 上游引物 5 ’ AGAACTGACCTAACCGAAGC3 ’
[0057]下游引物5 ’ CAGACCAACCCGAGGATGAC3，
[0058]5-HT2AR 上游引物 5’ GGATTTACCTGGATGTGC3’
[0059]下游引物5’ TGGATGGACCGTTGGAAG3’
[0060]5-HT2BR 上游引物 5，CAGCAGCAGAGGAAATGA3，
[0061]下游引物5’ ATCCAGGGAAATGGCACA3’
[0062]GLUT2 上游引物 5’ GGTGTTGCTGGATAAGTTCA3’
[0063]下游引物5’ AGGATTCGAGTTAAGAGGGA3’
[0064]內參GAPDH 上游引物 5’ TATCGGACGCCTGGTTAC3’
[0065]下游引物5’TGCTGACAATCTTGAGGGA3’ ；
[0066]1.3實驗結果
[0067]所有數據統計學檢測用組間Student-t檢測，p〈0.05表示有明顯統計學差異，p〈0.01表示有非常明顯統計學差異。下列所有圖中數據用均值土標準差(I士 SD)表示，N=3 ;*ρ〈0.05，**ρ〈0.01與對照組比較；$ρ<0.05，$$ρ〈0.01與DEX或OA刺激模型組比較；#p<0.05, ##p<0.01聯合用藥與SAR單用藥比較；&ρ〈(λ 05，&&ρ〈(λ OI聯合用藥與pCPC或CDP或BSA單用藥比較。
[0068](I) DEX刺激或OA刺激導致肝細胞IR時存在明顯的5-HT合成增加及5-HT2A，2BR表達上調
[0069]結果見圖1。可見，正常肝細胞存在5-HT合成酶TPHl、AADC基因表達，并且檢測到5-HT含量，還檢測到5-HT2A，2BR基因表達；DEX刺激或OA刺激后，肝細胞5-HT合成增加一5-HT含量增加、TPHU AADC、5-HT2A，2BR基因表達被上調。提示肝細胞在DEX或OA刺激時，5-HT合成系統被激活、5-HT2A，2BR被上調。
[0070](2) SAR與pCPA、⑶P、BSA聯用對改善DEX或OA導致的肝細胞IR具有協同作用
[0071]SAR、pCPA、CDP、BSA單獨給藥均可明顯逆轉DEX或OA刺激導致的肝細胞GLUT2基因表達下調；SAR與pCPAXDP、BSA聯合用藥的療效更加明顯，顯示出明顯的協同增效作用，GLUT2的基因表達相對量已接近對照組。結果見圖2。
[0072]對DEX或OA導致的肝細胞5_HT含量升高，pCPA、⑶P、BSA均有抑制作用，使肝細胞內5-HT含量下降。SAR沒有這種作用，且SAR與pCPA、⑶P、BSA聯合給藥也沒有協同作用。結果見圖3。
[0073]結果表明，肝細胞5-HT合成增加及5_HT2A，2BR表達上調是DEX或OA導致肝細胞IR時的共同特點，可能是導致IR的共同原因；通過抑制細胞的5-HT合成，或通過阻斷5-HT2A，2B受體，可獨立地改善DEX或OA導致的肝細胞IR ;當同時抑制5-HT合成及阻斷_HT2A，2B受體時，則對DEX或OA導致的肝細胞IR的改善效應有協同作用。
[0074]實施例2
[0075]動物實驗研究一DEX導致的大鼠IR及糖尿病模型
[0076]比較SAR與pCPA、⑶P、BSA聯合給藥，及各自單獨給藥對DEX致大鼠IR及糖尿病模型的治療作用，從而驗證SAR與pCPA、CDP、BSA聯合給藥對IR及糖尿病治療的協同效應。
[0077]2.1實驗方法
[0078](I)動 物處理
[0079]108只雄性Wistar大鼠隨機分為18組(每組6只):對照組，IR模型組，IR模型SAR治療組，IR模型SAR+pCPA復方治療組(SAR:pCPA按不同重量配比的4種復方)，IR模型pCPA治療組，IR模型SAR+⑶P復方治療組(SARfDP按不同重量配比的4種復方)，IR模型⑶P治療組，IR模型SAR+BSA復方治療組(SAR:BSA按不同重量配比的4種復方)，IR模型BSA治療組。動物籠養于普通鼠籠，保持室溫24±2°C、光照控制保證12h明、暗條件，普通水喂養,連續給藥15天。
[0080]實驗中，SAR+pCPA復方按不同重量配比的四種復方為:
[0081]SAR+pCPA-1—SAR:pCPA = 12:1 ； SAR+pCPA-2— SAR:pCPA = 4:1;
[0082]SAR+pCPA-3— SAR: pCPA =1:1; SAR+pCPA-4— SAR: pCPA =1:2。
[0083]實驗中，SAR+⑶P復方按不同重量配比的四種復方為:
[0084]SAR+CDP-1—SAR:CDP = 9:1; SAR+CDP-2 — SAR: CDP = 3:1;
[0085]SAR+CDP-3 — SAR: CDP = 1:1 ; SAR+CDP-4— SAR: CDP = 1:2。
[0086]實驗中，SAR+BSA復方按不同重量配比的四種復方為:
[0087]SAR+BSA-1—SAR:BSA = 8:1; SAR+BSA-2—SAR:BSA = 2:1;
[0088]SAR+BSA-3— SAR: BSA = 1:1 ; SAR+BSA-4— SAR: BSA = 1:3。
[0089](2)給藥劑量
[0090]對照組一皮下注射(s.c.)生理鹽水0.50ml/kg/次，并經口給藥(p.0.)0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液5.0ml/kg/次；
[0091]IR 模型組一s.c.DEX0.75mg/kg/ 次，并同時 p.0.CMC_Na5.0ml/kg/ 次；
[0092]IR模型藥物治療組一s.c.DEX0.75mg/kg/次，并同時ρ.ο.各組藥物，所有給藥組給藥劑量均相同為:20.0mg/kg/次。
[0093]各藥物用0.5 % CMC-Na混懸，濃度相同均為:4.0mg/ml ；DEX s.c.給藥容積為
0.50ml/kg/次,各組藥物p.ο.給藥容積為5.0ml/kg/次；每天給藥兩次,上下午各給藥一次。
[0094](3) HOMA-1R 指數計算
[0095]連續給藥第15天，各組動物首先禁食(不禁水)12小時，然后取血，測空腹血糖、空腹胰島素濃度，計算HOMA-1R指數(H0MA-1R =空腹血糖X空腹胰島素+22.5)。
[0096](4)尿糖含量檢測
[0097]連續給藥第15天，最后一次給藥前禁食約7小時，然后各組按要求分別給以DEX及相應藥物，給藥后迅速將動物放入代謝籠中，自由飲水，收集給藥后5小時內尿量，測量尿液中葡萄糖濃度，計算5小時內尿液中葡萄糖含量。
[0098]連續給藥15天后動物禁食12小時，麻醉，取血、取肝臟、取內臟脂肪組織及取大腿部骨骼肌，以檢測血清及組織相關生化指標。
[0099]2.2實驗指標檢測方法
[0100](I)血清及組織生化指標檢測
[0101]ELISA法檢測血清、肝臟、脂肪組織5-HT水平，ELISA法檢測血清胰島素濃度，分光光度法檢測血糖濃度、尿糖含量。
[0102] (2) GLUT2、GLUT4、5-HT2A, 2B 受體基因表達檢測
[0103]肝臟、脂肪組織及骨骼肌相關因子基因表達:逆轉錄PCR技術檢測GLUT2、GLUT4基因(mRNA)表達。其中，GLUT2存在于肝細胞，GLUT4存在于脂肪細胞及骨骼肌。5_HT2AR、
5-HT2BR、GLUT2、內參GAPDH引物物同細胞實驗，GLUT4引物如下:
[0104]GLUT4 上游引物 5’ TCCAGGATGAAGGAAACAGC3’
[0105]下游引物5’ GCGAGGCAAGGCTAGAITTT3’。
[0106](3) TPHl、AADC蛋白表達檢測
[0107]肝臟、脂肪組織及骨骼肌TPHl、AADC蛋白表達檢測=Western blot法。采用細胞膜蛋白抽提試劑盒提取細胞膜蛋白，通過SDS-PAGE凝膠電泳對不同分子量大小的蛋白進行分離后，電轉將所需分子量的蛋白轉移到PVDF膜上，轉膜結束后對膜進行封閉2小時。取出PVDF膜，分別用TPH1、AADC、ATP1A1蛋白抗體(一抗)孵育PVDF膜，于4°C過夜；再用對應的辣根酶標記二抗對PVDF膜進行孵育2小時。加入化學發光液反應后，將PVDF膜放入Tanon5200成像系統進行曝光顯影檢測。
[0108]2.3實驗結果
[0109]所有數據統計學檢測用組間Student-t檢測，p〈0.05表示有明顯統計學差異，p〈0.01表示有非常明顯統計學差異。下列所有圖中數據用均值土標準差(歹士 Sm表示，N = 6 ;*ρ〈0.05，**ρ〈0.01 與對照組比較；$ρ<0.05，$$ρ〈0.01 與 DEX 模型組比較;#ρ<0.05，##ρ<0.01聯合用藥與SAR單用藥比較；&ρ〈0.05，&&p〈0.01聯合用藥與pCPC或CDP或BSA單用藥比較。
[0110](I) DEX致大鼠IR模型中，肝臟、內臟脂肪及骨骼肌5-HT合成系統一TPHl ,AADC蛋白表達的改變
[0111]結果見圖4。可見，正常大鼠肝臟、內臟脂肪存在TPHUAADC蛋白表達，但骨骼肌未見表達；在DEX導致大鼠IR及糖尿病時，肝臟及脂肪組織兩種酶的蛋白表達明顯上調。相應地檢測到兩種組織中5-HT含量明顯升高，用pCPA或CDP或BSA抑制5-HT合成后5-HT含量明顯降低。
[0112](2) DEX致大鼠IR模型中，肝臟、內臟脂肪及骨骼肌5_HT2A，2BR基因表達的改變
[0113]結果見圖5。正常大鼠肝臟、內臟脂肪及骨骼肌存在5_HT2A，2BR基因表達；在DEX導致大鼠IR時，三種組織5-HT2A，2BR基因表達明顯上調。
[0114](3)抑制5-HT合成或阻斷5-HT2A，2BR,對DEX致大鼠IR模型肝臟、內臟脂肪及骨骼肌GLUT基因表達的影響
[0115]結果見圖6。在DEX致大鼠IR模型中，肝臟GLUT2，內臟脂肪及骨骼肌GLUT4基因表達明顯下調；用SAR、pCPA、CDP、BSA治療明顯上調GLUT2、GLUT4。
[0116](4) SAR+pCPA復方對DEX導致的IR的治療作用研究結果
[0117]結果見表1。DEX致IR模型中，動物空腹血糖濃度、空腹血胰島素濃度均明顯升高，HOMA-1R指數明顯升高，且收集5小時內排出的尿液可檢測到大量葡萄糖含量，提示出現嚴重的IR及糖尿病癥狀。用相同給藥劑量的SAR，pCPA，SAR+pCPA四種復方:SAR+pCPA_l、SAR+pCPA-2、SAR+pCPA-3、SAR+pCPA-4對DEX導致的IR進行治療，均能明顯降低血糖濃度、血胰島素濃度及HOMA-1R指數，并且明顯減少5小時內排出的尿糖量；復方SAR+pCPA-2、SAR+pCPA-3治療均顯示其降血糖、降血胰島素、減小HOMA-1R指數及減少尿糖量作用明顯好于SAR或pCPA單獨治療，提示產生明顯的協同效應；復方SAR+pCPA-Ι治療的降血糖、降血胰島素、減小HOMA-1R指數及減少尿糖量作用明顯好于pCPA治療，與SAR治療比較雖然沒有差異但也有更好的療效趨勢；復方SAR+pCPA-4治療的降血胰島素及減少尿糖量作用明顯好于PCPA治療，降血糖、減小HOMA-1R指數作用也顯示出比pCPA治療有更好的療效趨勢，且其療效與SAR治療相當。結果提示，SAR與pCPA組成一定比例的復方，對治療IR有明顯的協同作用，按重量配比，SAR:pCPA的比例范圍為:12:1~1:2，本實驗中以4:1復方(SAR+pCPA-2)療效最好。
[0118]表1大鼠連續給DEX15天后，以及用SAR、SAR+pCPA四種復方、pCPA治療后，空腹血糖濃度、空腹胰島素濃度、HOMA-1R指數及5小時內尿糖量檢測結果
[0119]
【權利要求】
1.一種復方藥物組合物，含有藥物活性成分和藥學上可接受的載體，其中藥物活性成分由沙格雷酯和5-羥色胺合成抑制劑組成。
2.權利要求1的復方藥物組合物，其中5-羥色胺合成抑制劑為對氯苯丙氨酸、卡比多巴或芐絲肼。
3.權利要求1的復方藥物組合物，其中沙格雷酯和5-羥色胺合成抑制劑的重量比為15:1 ~1:15。
4.權利要求2的復方藥物組合物，其中沙格雷酯和對氯苯丙氨酸的重量比為12:1~1:2。
5.權利要求4的復方藥物組合物，其中沙格雷酯和對氯苯丙氨酸的重量比為4:1。
6.權利要求2的復方藥物組合物，其中沙格雷酯和卡比多巴的重量比為9:1~1:2。
7.權利要求6的復方藥物組合物，其中沙格雷酯和卡比多巴的重量比為3:1。
8.權利要求2的復方藥物組合物，其中沙格雷酯和芐絲肼的重量比為8:1~1:3。
9.權利要求8的復方藥物組合物，其中沙格雷酯和芐絲肼的重量比為2:1。
10.權利要求1至9中任一項的復方藥物組合物用于制備治療II型糖尿病或代謝綜合征的藥物的用途。
【文檔編號】A61K31/225GK104001177SQ201410271356
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月17日 優先權日:2014年6月17日
【發明者】傅繼華, 李濤, 郭可可, 曲偉, 李鑫, 安閃閃, 馬少欣 申請人:中國藥科大學