功能化的基于樹狀大分子的spect-ct雙模態成像造影劑及其制備方法

功能化的基于樹狀大分子的spect-ct雙模態成像造影劑及其制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種功能化的基于樹狀大分子的SPECT-CT雙模態成像造影劑及其制備方法，以聚乙二醇化修飾的第五代聚酰胺-胺樹狀大分子作為高分子載體材料，通過共價接枝將二乙三胺五乙酸連接在樹狀大分子表面，通過原位合成的方法包裹金納米顆粒，并將表面剩余氨基進行乙酰化或者羥基化，標記99mTc，即得。本發明具有良好的SPECT/CT成像效果，實現了小鼠的體內不同組織部位SPECT/CT成像，為多功能組織特異性造影劑的開發打下了良好的基礎，應用前景廣闊。
【專利說明】功能化的基于樹狀大分子的SPECT-CT雙模態成像造影劑及其制備方法

【技術領域】
[0001]本發明屬于造影劑領域，特別涉及一種功能化的基于樹狀大分子的SPECT-CT雙模態成像造影劑及其制備方法。

【背景技術】
[0002]核醫學影像利用放射性核素標記的化學物質作為顯像劑或放射性藥物引入生物體內，進而顯示體內的生理、生化過程。通過核醫學SPECT或PET顯像設備接收放射性核素發出的射線，可以清晰地觀察到造影劑參與生物體內各種生理生化甚至代謝方面的功能信息，獲得定性、定量及定位的臨床疾病診治結果。核醫學放射性核素顯像的最突出的優點是其功能顯像，由于其獨特的功能成像特性，與形態學成像方法(X射線攝片、B超、CT、MRI)相比，可以反映臟器或組織的血流變化、受體密度及活性改變、代謝及功能變化，成為臨床診治疾病的最先進技術之一。然而核醫學成像存在空間分辨率低，無法明確定位影像解剖學位置的缺點。隨著技術的不斷進步，PET/CT及SPECT/CT的出現成功地解決了這一問題。通過SPECT/CT檢查，能同時獲得體內SPECT的功能代謝信息和CT的解剖診斷信息的圖像融合與診斷效能倍增(王榮福，李險峰，王強.SPECT/CT的最新應用進展[J].CT理論與應用研究，2012，21 (3): 577-582.)。因此，與單獨的SPECT或CT相比，SPECT/CT在診斷疾病以及評價預后等方面都更加具有臨床應用意義。
[0003]雖然SPECT/CT雙模態影像設備已經在臨床上有了極大的推廣，但是相應的SPECT/CT雙模態成像造影劑的研制開發還沒有得到足夠的重視。雖然多種CT或SPECT成像造影劑可以完成各種相應的造影成像，但是兩種造影劑的使用，不僅給臨床操作造成了不便，也會增加造影劑對患者的毒副作用，同時還存在造影劑之間難以協調，體內分別存在差異的現象。因此，一種多功能的造影劑體系，能夠完成SPECT/CT雙模態成像造影診斷，將會極大地提高診斷的靈敏度與準確度，并減輕對患者造成的痛苦和潛在的毒副作用，在臨床中將具有極大應用價值。
[0004]聚酰胺胺(polyamidoamine, PAMAM)樹狀大分子是一類高度支化結構的大分子，通過支化單元結構逐步重復反應而成。PAMAM具有高度單分散性和高度支化的特性，并擁有可控和規則的結構。其不僅表面擁有眾多的可修飾性氨基，而且內部具有獨特的空腔結構。因為PAMAM可以作為多能載體材料，在表面修飾功能化基團，而以內部空腔包裹藥物或者無機納米顆粒，實現多功能的整合，形成多功能納米探針，滿足臨床應用的要求。例如(WenS，Li K，Cai H，et al.Multifunct1nal dendrimer—entrapped gold nanoparticles fordual mode CT/MR imaging applicat1ns[J].B1materials, 2013, 34(5):1570-1580.)利用修飾有釓離子螯合劑的第五代PAMAM樹狀大分子為模板原位還原制備了金納米顆粒，并螯合釓離子制備得到的CT/MR雙模態成像造影劑，得到了較好的體內外雙模態成像效果。因此利用樹狀大分子為載體制備SPECT/CT雙模態造影劑將可以滿足臨床應用的需求，同時根據樹狀大分子表面的可修飾性，進行不同表面修飾實現不同的體內組織器官成像也將成為可能。
[0005]檢索國內外有關SPECT/CT雙模態造影劑方面的文獻和專利結果表明:目前，還沒有發現基于樹狀大分子的包裹金納米粒子螯合"mTc的SPECT/CT造影劑的制備與應用方面的報道。


【發明內容】

[0006]本發明所要解決的技術問題是提供一種功能化的基于樹狀大分子的SPECT-CT雙模態成像造影劑及其制備方法，該造影劑具有良好的SPECT/CT成像效果，為多功能造影劑的開發打下了良好的基礎。
[0007]本發明的一種功能化的基于樹狀大分子的SPECT-CT雙模態成像造影劑，以聚乙二醇化修飾的第五代聚酰胺-胺樹狀大分子作為高分子載體材料，通過共價接枝將二乙三胺五乙酸連接在樹狀大分子表面，通過原位合成的方法包裹金納米顆粒，并將表面剩余氨基進行乙酰化或者羥基化，標記"mTc，即得。
[0008]本發明的一種功能化的基于樹狀大分子的SPECT-CT雙模態成像造影劑的制備方法，包括:
[0009](I)將G5.NH2 (購于Dendritech公司)溶解在水中，并加入二乙三胺五乙酸環酸酐cDTPAA (購于Sigma Aldrich)的水溶液，在室溫下攪拌反應8_12h得到G5-DTPA，再加入EDC(購于Sigma Aldrich)活化后的mPEG-COOH(購于上海炎怡生物科技有限公司)，攪拌反應l-3d，得到功能化樹狀大分子G5-DTPA-mPEG溶液；
[0010](2)在G5-DTPA1PEG溶液中加入氯金酸溶液攪拌20_40min，再加入硼氫化鈉溶液，攪拌反應l_4h ；
[0011](3)乙酰化:加入三乙胺攪拌20-40min，隨后加入乙酸酐，攪拌反應12_24h ；
[0012]或者羥基化:加入縮水甘油，攪拌反應12_24h ;將反應液透析，最后將產物的水溶液冷凍干燥得到Au-Ac DENPs或Au-Gly DENPs ；
[0013](4)將上述Au-Ac DENPs或Au-Gly DENPs溶解在磷酸鹽緩沖液中，加入SnCl2，然后再加入無菌放射性高鍀酸鹽溶液并混合，柱層析分離，即得螯合核素99mTc包裹金納米粒子的功能化樹狀大分子 99niTc-Au-Ac DENPs 或 99niTc-Au-Gly DENPs。
[0014]所述步驟(I)中G5.NH2和cDTPAA的摩爾比為1:5-10 ；mPEG-COOH和EDC的摩爾比為1:8-15，活化時間為2-4小時；G5-DTPA和mPEG-COOH的摩爾比為1:15-25。
[0015]所述步驟(I)中的mPEG-COOH的分子量為5000。
[0016]所述步驟⑴-⑷中反應除了可以在純水中進行外，還可以在PBS緩沖液，二甲基亞砜，二甲基甲酰胺，二甲基乙酰胺等極性溶劑中反應。
[0017]所述步驟(2)中G5-DTPA1PEG和氯金酸的摩爾比為1:150-250 ；G5-DTPA-mPEG和硼氫化鈉的摩爾比為1:750-1250。
[0018]所述步驟(3)中G5-DTPA-mPEG和三乙胺的摩爾比為1:400-800 ;G5-DTPA_mPEG和乙酸酐的摩爾比為1:350-750 ;G5-DTPA-mPEG和縮水甘油的摩爾比為1:500-1000。
[0019]所述步驟(3)中的透析的具體工藝為:采用透析袋先在pH為7.4的PBS緩沖液中透析，再在蒸餾水中透析，透析袋為纖維素透析膜，截留分子量為8000-14000。
[0020]所述步驟⑷中的Au-Ac DENPs和SnCl2的質量比為1:0.1-0.5 ;Au_Ac DENPs和放射性高鍀酸鹽的比例為Img:1850-3700mBq ;Au_Gly DENPs和SnCl2的質量比為1: 0.1-0.5 ；Au-Gly DENPs和放射性高鍀酸鹽的比例為Img:1850-3700mBq。
[0021]所述步驟(4)中的磷酸鹽緩沖液的pH = 7.2-7.4。
[0022]所述步驟(4)中柱層析分離的具體工藝為:采用PD-10脫鹽色譜柱純化目標產物，除去游離99mTc和未反應物質。
[0023]本發明中將99mTc螯合劑cDTPAA接枝到末端為氨基的第五代聚酰胺-胺樹狀大分子表面，cDTPAA采用在快速攪拌下逐滴滴加的方式加入到樹狀大分子溶液中，以保證樹狀大分子接枝DTPA的均一性。
[0024]本發明中使用5-20倍量EDC活化mPEG-COOH的羧基，增強與樹狀大分子反應的活性，活化的mPEG-COOH也采用逐滴滴加的方式加入到樹狀大分子溶液中，以保證樹狀大分子接枝PEG的均一性。同時PEG的加入可以增加該材料的體內循環時間，并增加后續包裹納米金的量，達到更加靈敏的CT造影效果。
[0025]本發明中氯金酸溶液加入后，攪拌20_40min，使氯金酸分子與樹狀大分子充分混合，利用AuC14_與樹狀大分子氨基的親和力使得其進入樹狀大分子內部空腔，再以強還原劑NaBH4快速還原，得到樹狀大分子包裹的金納米顆粒，很好地防止了金納米顆粒的聚集。
[0026]本發明中分別以乙酰化和羥基化修飾樹狀大分子表面剩余的氨基，以降低其表面電勢，提高材料的生物相容性，并賦予其不同的表面基團，以實現其在體內不同的組織成像性能。
[0027]使用1H NMR (核磁共振波普)、UV-Vis (紫外可見光譜)、TEM (透射電子顯微鏡)、MTT測試(細胞活力分析)，以及體內SPECT/CT成像表征本發明獲得的具有雙模態造影功能的樹狀大分子，結果分別如下:
[0028](I)1H NMR 測試結果
[0029]1H NMR測試結果表明:本發明中制備得到的SPECT/CT雙模態造影劑顆粒Au-AcDENPs和Au-Gly DENPs均在3.5ppm處有PEG的特征吸收峰，參見圖2。同時G5的特征峰出現在2.1-3.3ppm之間，而且乙酰化修飾后在1.8ppm出現乙酰基的特征吸收。
[0030](2) UV-Vis 測試結果
[0031]UV-Vis測試結果表明:本發明中制備得到的SPECT/CT雙模態造影劑顆粒Au-AcDENPs和Au-Gly DENPs的表面等離子體共振(SPR)峰分別位于530和510nm，參見圖3。這表明本發明中制備得到了金納米顆粒，而且不同的表面修飾有不同的SPR峰位置。
[0032](3) TEM測試結果
[0033]--Μ測試結果顯示了兩種金納米顆粒的尺寸及尺寸分布，參見圖4。兩種金納米顆粒大小相似，平均直徑分別為3.3nm和3.2nm，且其尺寸分布較窄，具有良好的分散性。
[0034](4) MTT測試結果
[0035]用SK-0V-3細胞來研究Au-Ac DENPs和Au-Gly DENPs的細胞相容性。將不同Au濃度(0,2.5, 5,10, 20,40,80 μ M)的 Au-Ac DENPs和 Au-Gly DENPs 與 KB細胞共培養24h后，用MTT法檢測細胞的活力，參見圖5。從圖中可以看出，相對于用PBS處理的對照SK-0V-3細胞，Au-Ac DENPs和Au-Gly DENPs復合物在Au濃度高達80 μ M時仍對細胞生長沒有任何的影響，表現出良好的細胞相容性。
[0036](5) 99mTc-Au-Ac DENPs 小鼠體內 micro-SPECT/CT 成像
[0037]將200 μ L99niTc-Au-Ac DENPs ([99mTc] = 370MBq/mL, [Au] = 0.08M)尾部靜脈注射進體重為22g的小鼠體內，通過micro-SPECT/CT小動物成像儀掃描檢測得到的SPECT/CT圖片(圖6，圖8)。從圖中可以看出乙酰化表面處理的99mTc-Au-Ac DENPs材料可以實現小鼠的肺部特異性成像，其亮度明顯高于肝臟等其他主要器官，并同時可以看到肝臟，腎臟，脾臟以及膀胱的信號增強，而且成像時間可以持續至少2小時，并逐漸代謝信號減弱(圖6)。證明本方法合成的99mTc-Au-Ac DENPs具有較好的SPECT/CT雙模態成像效果。
[0038](6) 99mTc-Au-Gly DENPs 小鼠體內 micro-CT 成像
[0039]將200 μ L99niTc-Au-Gly DENPs ([99mTc] = 370MBq/mL, [Au] = 0.08M)尾部靜脈注射進體重為22g的小鼠體內，通過micro-SPECT/CT小動物成像儀掃描檢測得到小鼠CT圖片(圖7，圖9)。羥基化表面處理的99mTc-Au-Gly DENPs材料可以在血液中停留較長的時間，完成心臟，腎臟，腹主動脈等血池造影，隨著時間的延長，材料可以代謝進入脾臟，膀胱和肝臟(圖7)。證明本方法合成的99mTc-Au-Gly DENPs具有較好的SPECT/CT雙模態成像效果。兩種材料的體內成像結果表明所合成的不同表面修飾的造影劑具有顯著不同的體內代謝分布行為，可以完成不同的組織器官特異性造影功能。
[0040]本發明制備的螯合鍀包裹金納米粒子的功能化樹狀大分子材料，其金納米顆粒尺寸分布較窄，具有良好的分散性。體外具有良好的細胞相容性，體內試驗也表明其良好的SPECT/CT雙模態成像性能。
[0041]以表面具有大量氨基，內部具有大量空腔和結構精確可控的聚酰胺-胺樹狀大分子為模板和穩定劑，制備了功能化的基于樹狀大分子的SPECT/CT雙模態成像造影劑，本發明涉及了五個基本原理:
[0042](I)充分利用聚酰胺-胺樹狀大分子的表面大量的可修飾化氨基，接枝99mTc螯合劑DTPA和mPEG-COOH，既修飾了 SPECT造影劑99mTc螯合劑DTPA，又提高了該造影劑的血液循環時間和生物相容性。
[0043](2)充分利用聚酰胺-胺樹狀大分子的內部空腔包裹穩定納米金顆粒。采用強還原劑NaBH4對金屬離子進行快速還原，在樹狀大分子內部產生穩定的金納米顆粒。
[0044](3)金納米顆粒對X-射線有良好的衰減能力。小鼠活體CT成像測試說明樹狀大分子包裹金納米顆粒的造影劑可以作為一種充滿希望的CT造影劑。
[0045](4) 99mTc對SPECT成像有很好的造影效果。SPECT測試結果表明，該材料有較好的SPECT成像對比度。說明樹狀大分子-99mTc成像造影劑可以作為一種充滿希望的SPECT造影劑。
[0046](5)利用聚酰胺-胺樹狀大分子的表面大量的可修飾化氨基進行不同表面修飾和官能化，實現不同的體內成像特性，完成不同的體內造影功能，以利于臨床特異性組織器官檢查。
[0047]制備SPECT/CT雙模態造影劑的關鍵要素就是找到一個合適的載體平臺以負載不同的造影元素，形成多功能造影劑復合體。PAMAM是一類高度支化結構的大分子，通過支化單元結構逐步重復反應而成的樹狀大分子。它具有高度單分散性和高度支化的特性，并擁有可控和規則的結構。其不僅表面擁有眾多的可修飾性氨基，而且內部具有獨特的空腔結構。因為PAMAM可以作為多能載體材料，在表面修飾功能化基團，而以內部空腔包裹藥物或者無機納米顆粒，實現多功能的整合，形成多功能納米探針，滿足臨床應用的要求。利用樹狀大分子所具備的優異的單分散性、表面大量官能團的可修飾性、內部空腔結構所具有的載藥性和經修飾后具備的良好的生物相容性，通過樹狀大分子對無機納米顆粒進行修飾、組裝及生物功能化，以及各種小分子造影劑的接枝，制備出優良的多功能分子影像學造影劑用于SPECT/CT雙模態成像，以期望應用于疾病的早期診斷。
[0048]本發明利用樹狀大分子的特定結構和性質，將99mTc螯合劑DTPA接枝在樹狀大分子表面以螯合"mTc實現SPECT成像，然后將EDC活化的mPEG-COOH接枝在樹狀大分子表面以增加其血液循環時間，并提高生物相容性，最后在樹狀大分子內部包裹納米金顆粒用于CT成像，并乙酰化或者羥基化樹狀大分子表面剩余氨基降低表面正電荷性，以降低其毒性，制備出優良的SPECT/CT雙模態造影劑，實現不同的成像需求。
[0049]有益.效果
[0050](I)本發明的SPECT/CT雙模態成像造影劑具有良好的SPECT/CT成像效果，為多功能造影劑的開發打下了良好的基礎；
[0051](2)本發明的制備過程簡單，實驗條件為常溫常壓，易于操作，所采用的制備程序可用于制備其它功能化樹狀大分子的制備，以及SPECT和CT造影劑用于SPECT/CT雙模態成像，具有很好的使用價值；
[0052](3)本發明制備的不同表面基團的雙模態造影劑具有不同的體內特性，可以完成不同的組織器官造影，具有很好的臨床應用價值，并為不同表面修飾實現不同組織器官造影打下了良好的基礎；
[0053](4)本發明所采用的制備工藝可用于制備具有靶向性的SPECT和CT造影劑用于SPECT/CT靶向雙模態成像，具有很好的使用價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0054]圖1為本發明反應方程式簡圖。
[0055]圖2 為本發明制備的 Au-Ac DENPs (a)和 Au-Gly DENPs (b)的 1H NMR 譜圖。
[0056]圖3為本發明制備的Au-Ac DENPs (a)和Au-Gly DENPs (b)的紫外吸收光譜圖。
[0057]圖4 為本發明制備的 Au-Ac DENPs (a, b)和 Au-Gly DENPs (c，d)的 TEM 圖片(a,c)和粒徑分布直方圖(b，d)。
[0058]圖5為本發明制備的Au-Ac DENPs和Au-Gly DENPs在不同Au濃度處理的SK-0V-3細胞活力的MTT分析。
[0059]圖6 為 200 μ L 的 99niTc-Au-Ac DENPs ([99mTc] = 370MBq/mL)尾部靜脈注射進小鼠體內，通過micro-SPECT/CT掃描檢測得到的小鼠肺部，肝臟，腎臟，脾臟以及膀胱(如箭頭所示)的SPECT/CT圖片，從上至下依次為注射后30min(a)，60min(b)，120min(c)。圖7為200 μ L的99mTc-Au-Gly DENPs ([99mTc] = 370MBq/mL)尾部靜脈注射進小鼠體內，通過micro-SPECT/CT掃描檢測得到的小鼠心臟，下腔靜脈，肝臟，腎臟，脾臟以及膀胱(如箭頭所示)的SPECT/CT圖片，從上至下依次為注射后30min(a)，60min(b)，120min(c)。
[0060]圖8為200 μ L的99niTc-Au-Ac DENPs ([Au] = 0.08Μ)尾部靜脈注射進小鼠體內，通過micro-CT掃描檢測得到的小鼠肺部，心臟，肝臟，腎臟和膀胱(如箭頭所示)的CT圖片，依次為注射前(a),注射后 30min(b), 60min(c)，120min(d)。
[0061]圖9 為 200μ L 的 99niTc-Au-Gly DENPs ([Au] = 0.08Μ)尾部靜脈注射進小鼠體內，通過micro-CT掃描檢測得到的小鼠心臟，肝臟，腎臟以及膀胱(如箭頭所示)的CT圖片，依次為注射前(a),注射后 30min(b), 60min(c)，120min(d)。

【具體實施方式】
[0062]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
[0063]實施例1
[0064]如圖1 所示，制備 99niTc-Au-Ac DENPs0
[0065](I)將20.0mg第五代聚酰胺胺樹狀大分子(G5.NH2,購于Dendritech公司)溶解在15mL水中，并逐滴加入2mL 二乙三胺五乙酸環酸酐(cDTPAA,購于Sigma Aldrich)的水溶液(1.lmg/mL)，在室溫下攪拌反應8h得到G5-DTPA ;同時，在1mL mPEG-COOH的水溶液(7.69mg/mL)中加入5mLl_乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC，購于SigmaAldrich)的水溶液(7.69mg/mL)并攪拌2h，然后將EDC活化后的mPEG-COOH(購于上海炎怡生物科技有限公司)加入G5-DTPA溶液中，攪拌反應l-3d，得到功能化樹狀大分子(G5-DTPA-mPEG)溶液；
[0066](2)在⑴中得到的G5-DTPA-mPEG溶液中加入2.1mL氯金酸溶液(30mg/mL)攪拌30min,溶液變成淺黃色，再加入2.8mL硼氫化鈉水溶液(10mg/mL)，溶液瞬間變成深紅色，攪拌反應l_4h。然后加入78 μ L三乙胺攪拌30min，最后加入42 μ L乙酸酐，攪拌反應15h。最后將反應產物用纖維素透析膜(MWC0 = 14000)逐次在磷酸鹽緩沖溶液2LX3和蒸餾水2LX3中透析3天，最后將純化后的產物冷凍干燥得到Au-Ac DENPs ；
[0067](3)將0.2mg步驟(2)中制備的Au-Ac DENPs溶解在0.25mL磷酸鹽緩沖液中(PBS, pH = 7.2-7.4)，加入0.05mg SnCl2，然后再加入1.5mL無菌放射性高鍀酸鹽(放射性99mTc濃度為370MBq/mL)溶液并迅速混合反應30min，采用TO-1O脫鹽色譜柱純化分離，即得螯合核素99mTc包裹金納米粒子的功能化樹狀大分子(99mTc-Au-Ac DENPs)；
[0068]合成過程中對樹狀大分子表面修飾用核磁進行表征如圖2a，對各個峰進行積分計算可知:樹狀大分子載體表面修飾了 17.6個mPEG分子。對得到的產品Au-Ac DENPs進行紫外吸收表征如圖3a，納米金顆粒的表面等離子體共振(SPR)峰在530nm，證明了金納米顆粒的形成，TEM圖片(圖4a和4b)表明金納米顆粒直徑約3.3nm，尺寸分布較窄，具有良好的分散性。進一步以電感耦合等離子體發射光譜儀(ICP)測定產物中Au的含量，結果表明平均每個樹狀大分子的載金量為198.0個金原子。利用快速薄層層析法測試99mTc-Au-AcDENPs放射性純度高達95%，并在生理鹽水和血漿中可以穩定6h以上。這些測試結果表明已成功制備了設計合成的功能化的樹狀大分子99mTc-Au-Ac DENPs0
[0069]實施例2
[0070]如圖1 所示，制備 99niTc-Au-Gly DENPs0
[0071](I)將20.0mg G5.NH2溶解在15mL水中，并逐滴加入2mL cDTPAA的水溶液(1.1mg/mL)，在室溫下攪拌反應8h得到G5-DTPA ;同時，在1mL mPEG-COOH的水溶液(7.69mg/mL)中加入5mL EDC的水溶液(7.69mg/mL)并攪拌2h，然后將EDC活化后的mPEG-COOH加入G5-DTPA溶液中，攪拌反應l-3d，得到功能化樹狀大分子(G5-DTPA-mPEG)溶液；
[0072](2)在⑴中得到的G5-DTPA-mPEG溶液中加入2.1mL氯金酸溶液(30mg/mL)攪拌30min,溶液變成淺黃色，再加入2.8mL硼氫化鈉水溶液(10mg/mL)，溶液瞬間變成深紅色，攪拌反應l_4h。然后加入84 μ L縮水甘油攪拌反應24h。最后將反應產物用纖維素透析膜(MWCO = 14000)逐次在磷酸鹽緩沖溶液2LX3和蒸餾水2LX3中透析3天，最后將純化后的產物冷凍干燥得到Au-Gly DENPs ；
[0073](3)將0.2mg步驟⑵中制備的Au-Gly DENPs溶解在0.25mL PBS中，加入
0.05mgSnCl2,然后再加入1.5mL無菌放射性高鍀酸鹽(放射性99mTc濃度為370MBq/mL)溶液并迅速混合反應30min，采用PD-1O脫鹽色譜柱純化分離，即得螯合核素99mTc包裹金納米粒子的功能化樹狀大分子(99mTc-Au-Gly DENPs)；
[0074]合成過程中對樹狀大分子表面修飾用核磁進行表征如附圖2b，對各個峰進行積分計算可知:樹狀大分子載體表面修飾了 17.6個mPEG分子。對得到的產品Au-Gly DENPs進行紫外吸收表征如圖3b，納米金顆粒的表面等離子體共振(SPR)峰在510nm，證明了金納米顆粒的形成，TEM圖片(圖4c和4d)表明金納米顆粒直徑約3.2nm，尺寸分布較窄，具有良好的分散性。進一步以電感耦合等離子體發射光譜儀(ICP)測定產物中Au的含量，結果表明平均每個樹狀大分子的載金量為198.0個金原子。利用快速薄層層析法測試99mTc-Au-GlyDENPs放射性純度高達95%，并在生理鹽水和血漿中可以穩定6h以上。這些測試結果表明已成功制備了設計合成的功能化的樹狀大分子99mTc-Au-Gly DENPs0
[0075]實施例3
[0076]用MTT實驗來研究所制備的Au-Ac DENPs和Au-Gly DENPs的細胞毒性。
[0077]收集對數期人卵巢癌細胞株(SK-0V-3細胞)，加入到96孔細胞培養板中，每孔加入200 μ L含細胞的RPMI1640培養基使細胞密度至8000/孔；然后在細胞培養箱(5%CO2, 37 0C )中孵育24小時，倒掉培養基并加入180μ L新鮮培養基，再加入含有不同濃度的Au-Ac DENPs和Au-Gly DENPs的20 μ L PBS緩沖液(金終濃度分別為O，2.5，5，10，20，40，80 μ Μ)，以驗證材料對SK-0V-3細胞生長的影響。所有的試驗組均設5個孔為一個平行組；在培養箱中孵育24h后，每孔加入20 μ L的MTT溶液(5mg/mL)，培養4h后，小心吸去孔內培養液，在每孔加入200 μ L DMS0，置搖床上避光振蕩15min，然后在酶聯免疫檢測儀570nm處測量各孔的MTT甲臜溶液吸光值。分析結果以細胞存活率來顯示Au-Ac DENPs和Au-Gly DENPs對細胞的毒性作用。MTT法檢測處理后細胞的活力，參見圖5。從圖中可以看出，相對于未處理的SK-0V-3細胞，Au-Ac DENPs和Au-Gly DENPs在金濃度高達80 μ M時對細胞都不產生毒性，表現出良好的生物相容性。
[0078]實施例4
[0079]將200 μ L 實施例1 或 3 中得到的 99mTc-Au-Ac DENPs ([99mTc] = 370MBq/mL, [Au]=0.08M)尾部靜脈注射進體重為22g的小鼠體內，用藥前5min對其通過CT掃描檢測得到對照CT圖片(圖8)，并于用藥后30min，60min，120min再分別通過SPECT/CT掃描得到小鼠膀胱和腎的CT圖片。通過micro-SPECT/CT小動物成像儀掃描檢測得到的SPECT/CT圖片(圖6，圖8)。從圖中可以看出乙酰化表面處理的99mTc-Au-Ac DENPs材料可以實現小鼠的肺部特異性成像，其亮度明顯高于肝臟等其他主要器官，并同時可以看到肝臟，腎臟，脾臟以及膀胱的信號增強，而且成像時間可以持續至少2小時，并逐漸代謝信號減弱(圖6)。證明本方法合成的99mTc-Au-Ac DENPs具有較好的SPECT/CT雙模態成像效果。
[0080] 實施例5
[0081 ]將 200 μ L 實施例1 或 3 中得到的 99niTc-Au-Gly DENPs ([99mTc] = 370MBq/mL, [Au]=0.08M)尾部靜脈注射進體重為22g的小鼠體內，用藥前5min對其通過CT掃描檢測得到對照CT圖片(圖9)，并于用藥后30min，60min, 120min再分別通過SPECT/CT掃描得到小鼠膀胱和腎的CT圖片。通過micro-SPECT/CT小動物成像儀掃描檢測得到的SPECT/CT圖片(圖7，圖9)。從圖中可以看出羥基化表面處理的99mTc-Au-Gly DENPs材料可以在血液中停留較長的時間，完成心臟，腎臟，腹主動脈等血池造影，隨著時間的延長，材料可以代謝進入脾臟，膀胱和肝臟(圖7)。證明本方法合成的99mTc-Au-Gly DENPs具有較好的SPECT/CT雙模態成像效果。兩種材料的體內成像結果表明所合成的不同表面修飾的造影劑具有顯著不同的體內代謝分布行為，可以完成不同的組織器官特異性造影功能。
【權利要求】
1.一種功能化的基于樹狀大分子的SPECT-CT雙模態成像造影劑，其特征在于:以聚乙二醇化修飾的第五代聚酰胺-胺樹狀大分子作為高分子載體材料，通過共價接枝將二乙三胺五乙酸連接在樹狀大分子表面，通過原位合成的方法包裹金納米顆粒，并將表面剩余氨基進行乙酰化或者羥基化，標記"mTc，即得。
2.一種功能化的基于樹狀大分子的SPECT-CT雙模態成像造影劑的制備方法，包括: (1)將G5.NH2溶解在水中，并加入二乙三胺五乙酸環酸酐cDTPAA的水溶液，在室溫下攪拌反應8-12h得到G5-DTPA，再加入EDC活化后的mPEG_COOH，攪拌反應l_3d，得到功能化樹狀大分子G5-DTPA-mPEG溶液； (2)在G5-DTPA-mPEG溶液中加入氯金酸溶液攪拌20_40min，再加入硼氫化鈉溶液，攪拌反應l_4h ； (3)加入三乙胺攪拌20-40min，隨后加入乙酸酐，攪拌反應12_24h或者加入縮水甘油，攪拌反應12_24h ;將反應液透析，最后將產物的水溶液冷凍干燥得到Au-Ac DENPs或Au-Gly DENPs ； (4)將上述Au-AcDENPs或Au-Gly DENPs溶解在磷酸鹽緩沖液中，加入SnCl2，然后再加入無菌放射性高鍀酸鹽溶液并混合，柱層析分離，即得螯合核素99mTc包裹金納米粒子的功能化樹狀大分子 99niTc-Au-Ac DENPs 或 99niTc-Au-Gly DENPs。
3.根據權利要求2所述的一種功能化的基于樹狀大分子的SPECT-CT雙模態成像造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(I)中65.見12和cDTPAA的摩爾比為1:5-10 ；mPEG-COOH和EDC的摩爾比為1:8-15，活化時間為2-4小時；G5_DTPA和mPEG-COOH的摩爾比為 1:15-25。
4.根據權利要求2所述的一種功能化的基于樹狀大分子的SPECT-CT雙模態成像造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(I)中的mPEG-COOH的分子量為5000。
5.根據權利要求2所述的一種功能化的基于樹狀大分子的SPECT-CT雙模態成像造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中G5-DTPA-mPEG和氯金酸的摩爾比為1:150-250 ；G5-DTPA-mPEG 和硼氫化鈉的摩爾比為 1:750-1250。
6.根據權利要求2所述的一種功能化的基于樹狀大分子的SPECT-CT雙模態成像造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中G5-DTPA-mPEG和三乙胺的摩爾比為1:400-800 ;G5-DTPA-mPEG和乙酸酐的摩爾比為1:350-750 ;G5-DTPA_mPEG和縮水甘油的摩爾比為 1:500-1000。
7.根據權利要求2所述的一種功能化的基于樹狀大分子的SPECT-CT雙模態成像造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中的透析的具體工藝為:采用透析袋先在PH為7.4的PBS緩沖液中透析，再在蒸餾水中透析，透析袋為纖維素透析膜，截留分子量為8000-14000。
8.根據權利要求2所述的一種功能化的基于樹狀大分子的SPECT-CT雙模態成像造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟⑷中的Au-Ac DENPs和SnCl2的質量比% 1:0.1-0.5 -M-Kc DENPs 和放射性高鍀酸鹽的比例為 Img: 1850_3700mBq ；Au-GlyDENPs和SnCl2的質量比為1:0.1-0.5 ;Au_Gly DENPs和放射性高鍀酸鹽的比例為Img:1850_3700mBqo
9.根據權利要求2所述的一種功能化的基于樹狀大分子的SPECT-CT雙模態成像造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(4)中的磷酸鹽緩沖液的pH = 7.2-7.4。
10.根據權利要求2所述的一種功能化的基于樹狀大分子的SPECT-CT雙模態成像造影劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(4)中柱層析分離的具體工藝為:采用ro-1o脫鹽色譜柱純化目標產物，除去游離99mTc和未反應物質。
【文檔編號】A61K51/06GK104162175SQ201410271238
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年6月18日 優先權日:2014年6月18日
【發明者】史向陽, 溫詩輝, 趙晉華, 趙凌舟 申請人:東華大學, 上海市第一人民醫院