一種脫細胞角膜基質及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種脫細胞角膜基質及其制備方法，所述脫細胞角膜基質的制備方法包括以下步驟：A、將摘取的動物角膜放入水中，振蕩處理，以使上皮層脫落；B、將水更換為脫細胞試劑，振蕩處理，期間，所述脫細胞試劑和水交替使用，以使基質細胞和內皮細胞脫落；C、加入脫水劑，靜置或振蕩處理，得到脫細胞角膜；D、將所述脫細胞角膜進行削切，得到脫細胞角膜基質，所述脫細胞角膜基質只含有前彈力層和基質層；其中，所述脫細胞試劑含有NaCl和EDTA，所述脫水劑含有甘油。本發明提供的脫細胞角膜基質的制備方法，能有效的去除容易引起免疫反應的角膜細胞成分和可溶性蛋白，得到完好的只含有前彈力層和基質層的脫細胞角膜基質。
【專利說明】一種脫細胞角膜基質及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及醫療器械領域，尤其涉及一種脫細胞角膜基質及其制備方法。
【背景技術】
[0002]角膜病是全球范圍內第二致盲眼病，并且以每年150~200萬病例的速度遞增。角膜移植是目前治療角膜盲唯一有效的方法，但供體角膜來源的極端匱乏制約著角膜移植的開展。角膜基質如動物等動物的角膜基質具有與人角膜基質類似的組織結構、生物物理特性和光學特性，但異種移植后強烈的排斥反應阻礙了異種角膜在臨床上的應用。近年來的研究發現，角膜基質內的基質細胞是引起基質型排斥反應的主要抗原，而作為角膜基質架構的膠原纖維在種系間高度保守，抗原性很低，無細胞的異種角膜移植后不產生排斥反應。因此，將動物的基質細胞完全脫去，使之成為無細胞的角膜基質可能是人角膜基質的理想替代物。
[0003]但現有技術生產的無細胞角膜基質在脫細胞過程中，采用的是胰酶、EDTA(乙二胺四乙酸)等溶液以及Triton-XlOO (聚乙二醇辛基苯基醚)、脫氧膽酸鈉、SDS (十二烷基磺酸鈉)等表面活性劑，此類方法雖然能去除細胞成分，但反應劇烈，對角膜基質破壞嚴重，不能達到良好的生物相容性。此外，現有技術生產的脫細胞角膜基質為全層角膜，臨床使用前需根據創面大小以及深度進行處理后才能使用，在操作過程中材料被污染的幾率增大，基質層容易被破壞，且處理后的角膜基質層表面不平整，不利于創面愈合。
【發明內容】
[0004]本發明的主要目的在于提供一種脫細胞角膜基質的制備方法，旨在快速而溫和地去除角膜中免疫原細胞成分和可溶性蛋白，從而得到只含有前彈力層和基質層的脫細胞角月吳基質。
[0005]為了實現上述目的，本發明提供一種脫細胞角膜基質的制備方法，包括以下步驟:
[0006]A、將摘取的動物角膜放入水中，振蕩處理，以使上皮層脫落；
[0007]B、將水更換為脫細胞試劑，振蕩處理，期間，所述脫細胞試劑和水交替使用，以使基質細胞和內皮細胞脫落；
[0008]C、加入脫水劑，靜置或振蕩處理，得到脫細胞角膜；
[0009]D、將所述脫細胞角膜進行削切，得到脫細胞角膜基質，所述脫細胞角膜基質只含有iu彈力層和基質層；
[0010]其中，所述脫細胞試劑含有NaCl和EDTA，所述脫水劑含有甘油。
[0011]優選地，所述脫細胞試劑為:濃度為2~5mol/L的NaCl溶液與濃度為0.5~5g/L的EDTA溶液的混合液。
[0012] 優選地，所述脫細胞試劑的pH值為7.0~7.4 ;所述脫細胞試劑和/或水的溫度均為2~37°C。[0013]優選地，所述A步驟的振蕩時間為5~10h，期間，每隔I~a更換一次水；所述8步驟的振蕩時間為40~70h，期間，每隔I~2h交替更換一次脫細胞試劑或水。
[0014]優選地，所述脫水劑中甘油的體積比為50~90%。
[0015]優選地，在所述C步驟之后、D步驟之前還包括以下步驟:
[0016]X、使用濃度為2~5g/L碳酸氫鈉溶液清洗所述動物角膜2~lOmin。
[0017]優選地，在所述A步驟之后、B步驟之前還包括以下步驟:
[0018]Y、將水更換成濃度為0.02~2%。的次氯酸鈉溶液，靜置10~60min。
[0019]優選地，在所述D步驟之后，還包括以下步驟:
[0020]Z、將所述脫細胞角膜基質用鈷-60輻照。
[0021]此外，為實現上述目的，本發明還提供一種脫細胞角膜基質，由前述制備方法制備得到。
[0022]優選地，所述脫細胞角膜基質的厚度為150~550 μ m,直徑為0.5~L 2mm。
[0023]本發明通過脫細胞試劑和水的交替使用，反復改變組織滲透壓的方法，能逐步去除角膜基質中免疫原細 胞成分和可溶性蛋白，從而得到完好的脫細胞角膜基質。此外，通過削切處理，可制備出只含有前彈力層和基質層的脫細胞角膜基質，臨床使用前只需醫生根據患者創面大小和深度選擇對應的規格型號，環鉆取得合適的直徑大小的脫細胞角膜基質即可使用。這樣，不僅操作簡單，又能避免污染。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024]圖1為本發明的脫細胞角膜基質一實施例的脫細胞處理前和脫細胞處理后的蘇木精-伊紅(HE)染色照片對比圖，其中，IA為脫細胞處理前的蘇木精-伊紅(HE)染色照片圖，IB為脫細胞處理后的蘇木精-伊紅(HE)染色照片圖；
[0025]圖2為本發明的脫細胞角膜基質一實施例的脫細胞處理前和脫細胞處理后的透射電鏡照片對比圖，其中，2A為脫細胞處理前的透射電鏡照片圖，2B為脫細胞處理后的透射電鏡照片圖。
[0026]本發明目的的實現、功能特點及優點將結合實施例，參照附圖做進一步說明。【具體實施方式】
[0027]應當理解，此處所描述的【具體實施方式】為實現本發明目的的最佳實施方式，其僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0028]本發明提供了一種脫細胞角膜基質的制備方法，在第一實施例中，所述脫細胞角膜基質的制備方法包括以下步驟:
[0029]A、將摘取的動物角膜，放入裝有水的試劑瓶中，然后在恒溫振蕩器中以200rpm(轉/每分鐘)的轉速振蕩處理5h(小時)，期間，每隔Ih換一次水，以使上皮層脫落。所述動物包括豬、牛、羊等動物，所用的水包括注射水、純水、生理鹽水等。在振蕩處理過程中，角膜基質的膠原蛋白吸水蓬松，角膜逐漸吸水變厚，所述角膜基質細胞和內皮細胞逐漸破裂，角膜上皮層逐漸脫落。在振蕩處理結束時，所述角膜呈飛碟狀，所述角膜上皮層全部脫落。
[0030]將水更換成濃度為0.02%。的次氯酸鈉溶液進行滅病毒處理，靜置60min后倒去次氯酸鈉溶液，再用水洗去殘留的次氯酸鈉。
[0031]B、在裝有所述動物角膜的試劑瓶內加入含有濃度為5mol/L的NaCl和5g/L的EDTA的脫細胞試劑，然后在恒溫振蕩器中以200rpm的轉速振蕩處理Ih后，將所述脫細胞試劑替換為所述水在恒溫振蕩器中以200rpm的轉速振蕩處理lh，如此這兩種溶液交替使用，共振蕩處理40h。
[0032]C、加入甘油所占體積比為90%的脫水劑，在25°C溫度下振蕩處理30min (分鐘)，得到脫細胞角膜。脫細胞處理后的角膜由于吸水，厚度變厚，故使用含有甘油的脫水劑脫去角膜中的水分，能使角膜厚度達到原始厚度。
[0033]使用濃度為2g/L碳酸氫鈉溶液清洗得到的脫細胞角膜lOmin。這樣，既可以降低角膜中甘油含量至合理范圍，又可以使角膜中含有一定水分。
[0034]D、將所述脫細胞角膜進行削切，得到脫細胞角膜基質，所述脫細胞角膜基質只含有iu彈力層和基質層。
[0035]將得到的所述脫細胞角膜基質用用劑量為5KGy的鈷-60輻照滅菌。
[0036]通過脫細胞試劑和水的交替使用，反復改變組織滲透壓的方法，能逐步去除角膜基質中免疫原細胞成分和可溶性蛋白，從而得到完好的脫細胞角膜基質。此外，通過削切處理，可制備出只含有前彈力層和基質層的脫細胞角膜基質，使得臨床使用前只需醫生根據患者創面大小和深度選擇對應的規格型號，環鉆取得合適的直徑大小的脫細胞角膜基質即可使用。這樣，不僅操作簡單，又能避免污染。
[0037]第二實施例中，所述脫細胞角膜基質的制備方法包括以下步驟:
[0038]A、將摘取的動物角膜，放入裝有水的試劑瓶中，然后在恒溫振蕩器中以150rpm(轉/每分鐘)的轉速振蕩處理IOh (小時)，期間，每隔2h換一次水，以使上皮層脫落。所述動物包括豬、牛、羊等動物，所用的水包括注射水、純水、生理鹽水等。
[0039]將水更換成濃度為2%。的次氯酸鈉溶液進行滅病毒處理，靜置IOmin后倒去次氯酸鈉溶液，再用水洗去殘留的次氯酸鈉。
[0040]B、在裝有所述動物角膜的試劑瓶內加入含有濃度為2mol/L的NaCl和0.5g/L的EDTA的脫細胞試劑，然后在恒溫振蕩器中以IOOrpm的轉速振蕩處理2h后，將所述脫細胞試劑替換為所述水在恒溫振蕩器中以IOOrpm的轉速振蕩處理2h，如此這兩種溶液交替使用，共振蕩處理70h。
[0041]C、加入甘油所占體積比為50%的脫水劑，在2°C溫度下靜置處理60min (分鐘)，得到脫細胞角膜。
[0042]使用濃度為5g/L碳酸氫鈉溶液清洗得到的脫細胞角膜2min。
[0043]D、將所述脫細胞角膜進行削切，得到脫細胞角膜基質，所述脫細胞角膜基質只含有iu彈力層和基質層。
[0044]將得到的所述脫細胞角膜基質用用劑量為25KGy的鈷-60輻照滅菌。
[0045]第三實施例中，在第二實施例的基礎上，采用以下參數進行實施:
[0046]所述脫細胞試劑的pH值為7.0 ;所述脫細胞試劑和/或水的溫度為37°C。
[0047]第四實施例中，與第三實施例相比，所述脫細胞試劑的pH值為7.4 ;所述脫細胞試劑和/或水的溫度為2°C。
[0048] 本發明還提供一種脫細胞角膜基質，在第一實施例中，由前述制備方法制備得到的脫細胞角膜基質厚度為150 μ m，直徑為0.5mm。通過削切處理，可制備出只含有角膜前彈力層與基質層的角膜。臨床使用前，無需醫生對材料進行厚度的處理，醫生只需根據患者創面大小和深度選擇對應的規格型號，環鉆取得合適的直徑大小的脫細胞角膜基質即可使用。這樣，不僅操作簡單，又能避免污染。此外，由于該方法制備的所述脫細胞角膜基質表面平整,創面能夠快速愈合。
[0049]在第二實施例中，由前述制備方法制備得到的脫細胞角膜基質厚度為550 μ m，直徑為1.2mm。
[0050]圖1至圖2，以豬角膜為實驗對象，采用本發明提供的脫細胞角膜基質的制備方法，得到以下實驗結果:
[0051]取依據上述制備方法所制得的豬脫細胞角膜基質進行形態學HE染色觀察、超微結構透射電鏡觀察。
[0052]結果顯示:
[0053]圖1中，IA為脫細胞處理前的蘇木精-伊紅(HE)染色照片圖，其中正常角膜具有完整的全層角膜上皮細胞和單層角膜內皮細胞，角膜基質內存在大量基質細胞為脫細胞處理后的蘇木精-伊紅(HE)染色照片圖，其中脫細胞處理后，角膜中未觀察到任何完整的細胞，如上皮細胞和內皮層。
[0054]圖2中，2A為脫細胞處理前天然豬角膜的透射電鏡照片圖，2B為脫細胞處理后的透射電鏡照片圖，2B顯示脫細胞角膜中膠原纖維排列整齊，與圖2A對比觀察，脫細胞處理后的角膜基質膠原結構與天然角膜膠原結構一致，說明脫細胞過程未對角膜膠原結構造成破壞。[0055]本發明并不局限于以上實施方式，在上述實施方式公開的技術內容下，還可以進行各種變化。凡是利用本發明說明書及附圖內容所作的等效結構變換，或直接或間接運用在其他相關的【技術領域】，均同理包括在本發明的專利保護范圍內。
【權利要求】
1.一種脫細胞角膜基質的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: A、將摘取的動物角膜放入水中，振蕩處理，以使上皮層脫落； B、將水更換為脫細胞試劑，振蕩處理，期間，所述脫細胞試劑和水交替使用，以使基質細胞和內皮細胞脫落； C、加入脫水劑，靜置或振蕩處理，得到脫細胞角膜； D、將所述脫細胞角膜進行削切，得到脫細胞角膜基質，所述脫細胞角膜基質只含有前彈力層和基質層； 其中，所述脫細胞試劑含有NaCl和EDTA，所述脫水劑含有甘油。
2.如權利要求1所述的脫細胞角膜基質的制備方法，其特征在于，所述脫細胞試劑為:濃度為2~5mol/L的NaCl溶液與濃度為0.5~5g/L的EDTA溶液的混合液。
3.如權利要求2所述的脫細胞角膜基質的制備方法，其特征在于，所述脫細胞試劑的PH值為7.0~7.4 ;所述脫細胞試劑和/或水的溫度為2~37°C。
4.如權利要求1所述的脫細胞角膜基質的制備方法，其特征在于，所述A步驟的振蕩時間為5~10h，期間，每隔I~2h更換一次水；所述B步驟的振蕩時間為40~70h，期間，每隔I~2h交替更換一次脫細胞試劑或水。
5.如權利要求1所述的 脫細胞角膜基質的制備方法，其特征在于，所述脫水劑中甘油的體積比為50~90%。
6.如權利要求1所述的脫細胞角膜基質的制備方法，其特征在于，在所述C步驟之后、D步驟之前還包括以下步驟: X、使用濃度為2~5g/L碳酸氫鈉溶液清洗所述動物角膜2~lOmin。
7.如權利要求1所述的脫細胞角膜基質的制備方法，其特征在于，在所述A步驟之后、B步驟之前還包括以下步驟: Y、將水更換成濃度為0.02~2%。的次氯酸鈉溶液，靜置10~60min。
8.如權利要求1所述的脫細胞角膜基質的制備方法，其特征在于，在所述D步驟之后，還包括以下步驟: Z、將所述脫細胞角膜基質用鈷-60輻照。
9.一種脫細胞角膜基質，其特征在于，由權利要求1至8中任一項所述的制備方法制備得到。
10.如權利要求9所述的脫細胞角膜基質，其特征在于，所述脫細胞角膜基質的厚度為.150 ~550 μ m，直徑為 0.5 ~1.2mm。
【文檔編號】A61L27/36GK104001215SQ201410264542
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月13日 優先權日:2014年6月13日
【發明者】王維博, 張斌 申請人:深圳艾尼爾角膜工程有限公司